專(zhuān)利名稱(chēng)：多肽的純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從微生物發(fā)酵液或勻漿物中純化目標(biāo)多肽。更具體地，向培養(yǎng)液或勻漿物中引入沉淀劑以有效除去諸如蛋白質(zhì)、DNA和細(xì)胞碎片。
背景技術(shù)：
今天，重組技術(shù)的出現(xiàn)使得可以在合適的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中產(chǎn)生高水平的蛋白。因此用快速、高濃度(robust)、高效率的純化方法回收重組蛋白的需求不斷增加。通常地，通過(guò)用基因工程手段將含有目標(biāo)蛋白的基因的重組質(zhì)粒插入哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、真菌以及細(xì)菌等細(xì)胞系，培養(yǎng)細(xì)胞，可以產(chǎn)生目標(biāo)蛋白。由于所用的細(xì)胞系為活的生物體，必須供給它們復(fù)合生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中包含糖、氨基酸以及生長(zhǎng)因子，通常由動(dòng)物血清制劑提供。從供給細(xì)胞的化合物的混合物中以及從細(xì)胞自己的副產(chǎn)物中，將目標(biāo)蛋白純化到足以用作人類(lèi)治療劑的純度，這成為極大的挑戰(zhàn)。
從細(xì)胞碎片純化蛋白的過(guò)程最初依賴(lài)于蛋白表達(dá)的位置。某些蛋白可以從細(xì)胞中直接分泌到周?chē)呐囵B(yǎng)基中；其它蛋白則在胞內(nèi)生產(chǎn)。對(duì)于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽，純化策略比在其它形式的宿主細(xì)胞中簡(jiǎn)單得多。由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞可將多肽輸出體外，多肽可以從培養(yǎng)基中收集，在培養(yǎng)基中它們以相對(duì)純凈的形式存在。然而，如果多肽是在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生，例如微生物，比如真菌或者大腸桿菌，多肽就從細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞間質(zhì)空間回收(Kipriyanov and Little，Molecular Biotechnology，12173-201(1999)；Skerra and Pluckthun，Science，2401038-1040(1988))。因此，需要通過(guò)細(xì)胞裂解等提取方式將蛋白從胞內(nèi)釋放到胞外培養(yǎng)基中。這樣的破碎可以將胞內(nèi)全部?jī)?nèi)容物質(zhì)變?yōu)閯驖{，而且附加生成了由于尺度太小難于去除的亞細(xì)胞的碎片，這些物質(zhì)通常以差速離心或過(guò)濾的方式除去。
細(xì)胞裂解一般應(yīng)用機(jī)械破碎技術(shù)如勻漿或珠磨來(lái)完成。當(dāng)目標(biāo)蛋白大部分被有效地釋放，這些技術(shù)顯示出一些缺點(diǎn)(Engler，Protein PurificationProcess Engineering，Harrison eds.，37-55(1994))。在處理過(guò)程中時(shí)常出現(xiàn)的升溫可能會(huì)導(dǎo)致蛋白的失活，而且處理后的懸浮液中含有光譜的雜質(zhì)蛋白、核酸和多糖。核酸和多糖會(huì)增加溶液的粘度，潛在地增加了后續(xù)離心、錯(cuò)流過(guò)濾或者層析的復(fù)雜度。這些雜質(zhì)與目標(biāo)蛋白的復(fù)雜結(jié)合會(huì)使純化過(guò)程更加繁復(fù)而且導(dǎo)致更加難以接受的低產(chǎn)量的結(jié)果。
如上所述，釋放胞內(nèi)蛋白的更多可選擇的方法推動(dòng)了下游的處理過(guò)程，已報(bào)道有一些技術(shù)可使細(xì)胞具有通透性和/或提取胞內(nèi)蛋白。這些方法包括應(yīng)用溶劑、洗滌劑、離液劑、抗體、酶以及螯合劑來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的滲透性和/或提高提取率。也有報(bào)道稱(chēng)，將某些化合物如甘氨酸在培養(yǎng)時(shí)加入發(fā)酵培養(yǎng)基，可以提高特定的胞內(nèi)酶的釋放。最后，諸如凍融處理或滲壓休克等技術(shù)可以釋放胞內(nèi)的一部分蛋白。
然而，這些技術(shù)并不能針對(duì)所有胞內(nèi)的微生物蛋白進(jìn)行有效地應(yīng)用，而且對(duì)于大規(guī)模的工藝過(guò)程這些技術(shù)都有應(yīng)用上的限制和/或其它缺點(diǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)使用溶劑如甲苯和氯仿等來(lái)提高胞內(nèi)蛋白的釋放時(shí)，這些物質(zhì)都是有毒且致癌的(Windholtz et al.，The Merck Index10th Edition300 and1364(1983))。離子型洗滌劑如SDS，常常不可逆地使分離出的蛋白變性，雖然非離子洗滌劑一般不會(huì)使蛋白變性，但回收的蛋白常常與洗滌劑微膠團(tuán)結(jié)合，這樣就要求增加處理步驟以收獲無(wú)洗滌劑的蛋白。離液劑如脲和鹽酸胍，會(huì)在蛋白內(nèi)容物全部釋放所要求的濃度下使蛋白變性，而且它們的有效性可能只限于培養(yǎng)的生長(zhǎng)期。溶菌酶的使用為蛋白釋放提供了相對(duì)溫和的方法，但它又由于相對(duì)較高的成本和后續(xù)仍需要從酶試劑中純化目標(biāo)蛋白而受到限制。另外，螯合劑常常用于有效增強(qiáng)其它提高通透性的技術(shù)如應(yīng)用溶菌酶或甲苯提取，但要忍受宿主非特異性蛋白釋放的缺點(diǎn)。
其它釋放蛋白的方法也有缺點(diǎn)。比如應(yīng)用滲壓休克時(shí)，將細(xì)胞重懸于高滲透壓的培養(yǎng)基進(jìn)行回收，然后置于低滲透壓的緩沖液中，這就要求相對(duì)其它可選擇的提取方法增加處理步驟(Moir et al.，Separation Processesin Biotechnology，Asenjo eds67-94(1990))或者需要在低溫下處理大量液體。這使得此方法對(duì)于大規(guī)模提取時(shí)是不具吸引力的。
雖然經(jīng)多次循環(huán)以及附加的處理要求導(dǎo)致產(chǎn)率相對(duì)較低，但凍融處理也可以釋放胞內(nèi)蛋白。另外，細(xì)胞糊狀物的冷凍與其它可選擇的提取方法相比增加了價(jià)值不菲的處理需求。
最后，在發(fā)酵時(shí)加入試劑如甘氨酸可以提高蛋白向胞外培養(yǎng)基中的釋放(Aristidou et al.，Biotechnology Letters15331-336(1993))。當(dāng)一些胞內(nèi)蛋白被部分釋放后，此法就要求發(fā)酵、釋放策略以及后續(xù)從可能很復(fù)雜的胞外培養(yǎng)液中分離目標(biāo)蛋白過(guò)程的直接耦聯(lián)。
一旦目標(biāo)多肽從宿主細(xì)胞中釋放出來(lái)后，要求將它與其它的細(xì)胞組分分離。不幸地，大多數(shù)的提取方法，如細(xì)胞裂解，不僅可能將蛋白暴露給宿主細(xì)胞的蛋白酶進(jìn)行降解，而且使蛋白與提取后的懸浮液中其它組分的分離更加困難。舉例來(lái)說(shuō)，DNA、RNA、磷脂和脂多糖(LPS)等帶負(fù)電荷的分子的存在，常常需要應(yīng)用離子交換層析(Sassenfeld，TIBTECH，888-93(1990)；Spears，Biotechnology，vol.3--Bioprocessing，Rehm eds40-51(1993))和/或硫酸魚(yú)精蛋白(Kelley et al.，Bioseparation，1333-349(1991)；Scopes，Protein Purification Principles and Practice，2nd edition，Cantor eds.，pp.21-71(1987))、硫酸鏈霉素(Wang et al.，eds，F(xiàn)ermentation and Enzyme Technology253-256(1979))、聚乙烯亞胺(PEI)(Kelley et al.，出處同上；Sassenfeld，出處同上；Cumming et al.，Bioseparation，617-23(1996)；Jendrisak，The use ofpolyethyleneimine in protein purification.Protein purificationmicro to macro，ed.Alan R.，Liss，Inc，75-97(1987)；Salt et al.，Enzyme and MicrobialTechnology，17107-113(1995))等聚陽(yáng)離子沉淀和/或用聚乙二醇(PEG)/磷酸或PEG/葡聚糖(Kelley et al.，出處同上，Strandberg et al.，Process Biochemistry26225-234(1991))等不互溶的高分子系統(tǒng)進(jìn)行雙水相萃取。
或者，可以通過(guò)加入硫酸銨或氯化銨等中性鹽(Wheelwright，ProteinPurificationDesign and Scale up of Downstream Processing87-98(1991)；Englard et al.，Methods in EnzymologyVolume 182，Deutscher eds.285-300(1990))和/或PEG或硫酸葡聚糖等高分子(Wang et al.，出處同上；Wheelwright，出處同上)將目標(biāo)蛋白從非蛋白的多陰離子雜質(zhì)中沉淀出來(lái)。這里，目標(biāo)蛋白帶有正電荷，因此它傾向于和帶負(fù)電荷的分子結(jié)合，使蛋白的純化事實(shí)上是不可能實(shí)現(xiàn)的。
典型地，研究者們已經(jīng)應(yīng)用了上述的初始分離步驟來(lái)分離目標(biāo)蛋白和討厭的聚陰離子。不幸地，每一個(gè)初始純化方法都有嚴(yán)重的缺陷，尤其當(dāng)其應(yīng)用于生產(chǎn)藥物試劑的時(shí)候。比如說(shuō)，在微生物溶解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的大量非蛋白聚陰離子雜質(zhì)易于使陰離子交換層析樹(shù)脂的結(jié)合能力減弱。另外，再生操作常常由于聚陰離子與樹(shù)脂的強(qiáng)力結(jié)合而失效(Spears，出處同上)。最終，目標(biāo)蛋白結(jié)合的低離子強(qiáng)度條件對(duì)于破壞聚陰離子-蛋白相互作用是無(wú)效的，導(dǎo)致很差的分離效果(Scopes，Protein Purification PrinciplesandPractice，3rd edition，Cantor eds.，p.171(1994))。當(dāng)關(guān)注到蛋白酶和病毒雜質(zhì)時(shí)，制備硫酸魚(yú)精蛋白是令人苦惱的。而且，應(yīng)用這種試劑會(huì)產(chǎn)生不需要的蛋白沉淀(Scopes，蛋白Purification Principles and Practice，2nd edition，Cantor eds.，21-71(1987))。
在藥物蛋白的生產(chǎn)過(guò)程中，基于有關(guān)抗生素用作生產(chǎn)試劑的一般理解，硫酸鏈霉素是通常不會(huì)采用的(Scawen et al.，Handbook of EnzymeBiotechnology 2nd edition，Wiseman eds.15-53(1985))。PEI制劑經(jīng)常被乙烯亞胺單體量的變動(dòng)所污染，因?yàn)槠鋯误w是一種可能的治癌物質(zhì)(Scawen et al.，出處同上)。PEI也易于與許多層析樹(shù)脂不可逆地結(jié)合而限制樹(shù)脂的有效性，所以，大量的層析樹(shù)脂都可以應(yīng)用在PEI步驟之后的純化步驟。總的來(lái)說(shuō)，雙水相萃取系統(tǒng)常常需要而又難于預(yù)測(cè)一種經(jīng)驗(yàn)方法，用它來(lái)確定將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)入適宜水相的條件(Kelley et al.，出處同上)。
目標(biāo)蛋白的特殊沉淀技術(shù)常常導(dǎo)致沉淀中非蛋白雜質(zhì)的截留而使分離失效(Scopes，出處同上；Wheelwrihght，出處同上)。
描述蛋白回收和純化的專(zhuān)利中的實(shí)例包括如下美國(guó)專(zhuān)利5,665,866公開(kāi)了一種可溶并正確折疊和組裝的抗體獲取方法。為了促進(jìn)可溶性并正確折疊和組裝的抗體的后續(xù)分離，充分去除其它與抗體相關(guān)的物質(zhì)，該方法包括一個(gè)在操作過(guò)程中的某一時(shí)刻將操作溫度從34℃升高到60℃的步驟。
美國(guó)專(zhuān)利5,760,189公開(kāi)了一種通過(guò)向溶液中加入螯合劑從大腸桿菌中將一種類(lèi)似硫氧還蛋白的融合蛋白包括帶負(fù)電荷的非蛋白物質(zhì)釋放到溶液中，并通過(guò)向溶液中添加二價(jià)陽(yáng)離子/乙醇溶液以形成第一個(gè)含有蛋白的可溶性級(jí)分和第一個(gè)含有多余雜質(zhì)的不溶性級(jí)分，從而將帶負(fù)電荷的非蛋白物質(zhì)從溶液中沉淀的方法。任意地，在加入螯合劑之前的溫度要比加入螯合劑之后低得多。二價(jià)陽(yáng)離子包括，例如鎂、錳和鈣單獨(dú)或者組合加入。
美國(guó)專(zhuān)利5,714,583公開(kāi)了一種在溶液中純化IX因子的方法，包括應(yīng)用一種陰離子交換樹(shù)脂處理含有IX因子的溶液，用電導(dǎo)率小于從樹(shù)脂上洗脫IX因子所需電導(dǎo)率的溶液洗滌陰離子交換樹(shù)脂，用第一種洗脫劑洗脫陰離子交換樹(shù)脂形成第一種洗脫液，將洗脫液用肝素或類(lèi)肝素(例如基質(zhì)帶負(fù)電荷的)樹(shù)脂處理，應(yīng)用第二種洗脫劑洗脫肝素或類(lèi)肝素樹(shù)脂形成第二種洗脫液，用羥基磷灰石樹(shù)脂處理第二種洗脫液，而后用第三種洗脫劑洗脫羥基磷灰石樹(shù)脂以形成含有純化的IX因子的第三種洗脫液。
美國(guó)專(zhuān)利6,322,997公開(kāi)了一種回收多肽的方法，包括用一種可與多肽相結(jié)合或者可對(duì)多肽進(jìn)行修飾的試劑處理一種含有多肽的混合物，此時(shí)試劑被固定化在固相上，然后將混合物通過(guò)一個(gè)所帶電荷與混合物中的試劑所帶電荷相反的過(guò)濾器，以便從混合物中除去濾出的試劑。
美國(guó)專(zhuān)利6,214,984公開(kāi)了將低pH疏水相互作用層析(LPHIC)用于抗體純化的方法。具體地，該專(zhuān)利提供了一種純化抗體去除雜質(zhì)的方法，包括將含有抗體和雜質(zhì)的混合物在疏水相互作用層析柱上上樣、用一種pH大約2.5-4.5的的緩沖液將抗體從柱上洗脫。通常，上樣到柱上的混合物與洗脫緩沖液具有一樣的pH值美國(guó)專(zhuān)利6,121,428提供了一種回收多肽的方法，包括用一種可與多肽相結(jié)合或者可對(duì)多肽進(jìn)行修飾的試劑處理一種含有多肽的混合物，此時(shí)試劑被固定化在固相上，然后將混合物通過(guò)一個(gè)所帶電荷與混合物中的試劑所帶電荷相反的過(guò)濾器，以便從混合物中除去濾出的試劑。
美國(guó)專(zhuān)利5,641,870提供了一種純化抗體的方法，其中對(duì)含有抗體和雜質(zhì)的混合物在低鹽濃度的條件下進(jìn)行LPHIC。將抗體從柱上洗脫到不與它結(jié)合的級(jí)分。在提取步，冷凍的細(xì)胞顆粒在室溫下重懸于pH值6.0、含有5mM EDTA和預(yù)溶于乙醇的20mM 4，4′-DTP的20mM MES緩沖液中(1kg細(xì)胞顆粒溶于3升緩沖液)。重懸細(xì)胞在Mantin Gaulin勻漿器中5500-6500PSI條件下的雙通道中進(jìn)行細(xì)胞破碎。勻漿物以聚乙烯亞胺(PEI)調(diào)至0.25％(v/v)并以相同體積的28℃純水稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮膭驖{物進(jìn)行離心，抗體片斷出現(xiàn)在上清液中。
在歷史上，已從人血清和血漿中純化出免疫球蛋白G(IgG)(Putnam，ed.，The Plasma Protein，vol.1(Academic Press，1975))。純化方法常常包含一步或多步沉淀過(guò)程。最常使用的用于沉淀IgG的沉淀方法是Cohn分餾法(Cohn etal.，J.Amer.Chem.Soc.，72465(1950))，然而其它沉淀技術(shù)已有報(bào)道(Niederauer and Glatz，Advances in Biochemical Engineering Biotechnology，v.47(Springer-Verlag Berlin Heidelberg，1992)；Steinberg and Hershberger，Biochim.et Biophys.Acta，342195-206(1974))。應(yīng)用乳酸6，9-二氨基-2-乙氧吖啶(USAN命名，本文也稱(chēng)乳酸依沙吖啶(ethacridine lactate)，還可以稱(chēng)ETHODINTM或RIVANOLTM)-一種多芳基的陽(yáng)離子染料，從血漿中純化IgG的先驅(qū)工作是由Horsjsi和Smetana，Acta Med.Scand.，15565(1956)報(bào)道的。其后的十年產(chǎn)生的大量出版物都表明了乳酸6，9-二氨基-2-乙氧吖啶具有從生物物質(zhì)如血漿和培養(yǎng)基中，純化IgG和其它蛋白的能力(Miller，Nature，184450(1959)；Steinbuch和Niewiarowski，Nature，18687(1960)；Neurath和Brunner，Experientia，25668(1969))。應(yīng)用乳酸依沙吖啶從其它來(lái)源回收抗體和其它蛋白已經(jīng)有所報(bào)道，參見(jiàn)Tchernov et al.，J.Biotechnol.，6969-73(1999)；SU 944580，1982-07-28公開(kāi)；Franek和Dolnikova，Biotech-Forum-Eur，7468-470(1990)；EP 250288，1987-12-23公開(kāi)；DE3604947，1987-08-20公開(kāi)；Rothwell et al.，Anal.Biochem.，149197-201(1985)；Lutsik和Antonyuk，Biokhimiya，471710-1715(1982)；和Aizenman etal.，Mikrobiol-Zh.，4469-72(1982)。
從微生物中回收多肽的第一步常常涉及去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片等固體物質(zhì)，重要的是認(rèn)識(shí)到，需要從經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的培養(yǎng)基(conditioned medium)所含能與目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)生特定相互作用的組分中分離目標(biāo)產(chǎn)物。當(dāng)目標(biāo)蛋白帶正電荷時(shí)，它傾向于與任何存在的帶負(fù)電荷的分子相結(jié)合，因此用傳統(tǒng)方法純化蛋白是十分困難的。在這一步驟中，附加從微生物的粗提物如大腸桿菌勻漿物中去除可溶性的雜質(zhì)蛋白的處理可以簡(jiǎn)化后續(xù)的層析步驟。這樣的附加操作尤其對(duì)于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)具有價(jià)值，可以降低層析柱尺寸并節(jié)約生產(chǎn)時(shí)間。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及權(quán)利要求所述的純化方法。
具體地，一方面，本發(fā)明提供了從產(chǎn)生并溶有目標(biāo)異源多肽的微生物發(fā)酵液或勻漿物中純化該多肽的方法，包括在使多肽的主要部分保持可溶的條件下，向培養(yǎng)液或勻漿物中加入有效量的乳酸6，9-二氨基-2-乙氧吖啶(乳酸依沙吖啶)溶液，以沉淀宿主細(xì)胞雜質(zhì)，并從培養(yǎng)液或勻漿物中分離目標(biāo)多肽。
另一方面，本發(fā)明提供了一種微生物細(xì)胞的發(fā)酵液或勻漿物，其包含乳酸依沙吖啶和相對(duì)于所述細(xì)胞而言異源的多肽。
加入乳酸依沙吖啶作為沉淀劑，可意外地導(dǎo)致明顯去除宿主細(xì)胞碎片，包括宿主蛋白。在此過(guò)程中，大多數(shù)的宿主蛋白與細(xì)胞碎片一起回收在沉淀中，而多肽則回收在澄清的上清中。應(yīng)用乳酸依沙吖啶時(shí)，澄清提取物的純度增加，這導(dǎo)致層析柱所需的層析介質(zhì)或樹(shù)脂的體積減小，因此可減小后續(xù)純化所需的規(guī)模。它還導(dǎo)致取消一些層析步驟，可以節(jié)約處理時(shí)間和成本。另外，本文所述方法也可產(chǎn)生穩(wěn)定的原料并可在中性pH操作。


圖1為抗CD18F(ab’)2(-亮氨酸拉鏈)質(zhì)粒pS1130(單啟動(dòng)子)和pxCD18-7T3(雙啟動(dòng)子)的構(gòu)建示意圖。
圖2顯示了雙啟動(dòng)子構(gòu)建體pxCD18-7T3中插入的核酸序列(定名為抗-CD18-7T3.DNA；SEQ ID NO1)。
圖3A和3B顯示由構(gòu)建體pxCD18-7T3中的兩個(gè)翻譯單元編碼的氨基酸序列(SEQ ID NOS2和3)(合并定名為抗-CD18-7T3.蛋白)，分別定名為STII+抗-CD18輕鏈(圖3A)和STII+抗-CD18重鏈(圖3B)。N端STII分泌信號(hào)序列用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖4為抗組織因子IgG1質(zhì)粒paTF130(phoA/phoA啟動(dòng)子)和pxTF-7T3FL(phoA/tacII-啟動(dòng)子)的示意圖。
圖5顯示了phoA/tacII-啟動(dòng)子構(gòu)建體pxTF-7T3FL中插入的核酸序列(定名為抗-TF-7T3FL.DNA；SEQ ID NO4)圖6A和6B顯示了由構(gòu)建體pxTF-7T3FL中的兩個(gè)翻譯單元編碼的氨基酸序列(SEQ ID NOS5和6)(合并定名為抗-TF-7T3FL.蛋白)，它們分別定名為STII+抗-TF輕鏈(圖6A)和STII+抗-TF重鏈(圖6B)。N端STII分泌信號(hào)序列用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖7顯示了乳酸依沙吖啶的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖8A-8C顯示三種上清液經(jīng)乳酸依沙吖啶沉淀后的非還原性SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色凝膠分析。沉淀在如每條泳道所示的不同pH值進(jìn)行，標(biāo)有X的泳道是不同大腸桿菌勻漿物的澄清上清，即抗-CD18F(ab’)2、抗-TF F(ab’)2和全長(zhǎng)抗-TF(分別見(jiàn)圖8A、8B和8C)。勻漿物以0.8％的乳酸依沙吖啶溶液稀釋4倍，即用于每個(gè)試驗(yàn)中的乳酸依沙吖啶終濃度為0.6％。所有樣品加載到凝膠之前補(bǔ)足體積，因此如果回收率為100％，條帶的強(qiáng)度應(yīng)該與提取物(X)相當(dāng)。箭頭所示為產(chǎn)物條帶。
圖9A-9C顯示上清液經(jīng)乳酸依沙吖啶沉淀后的非還原性SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色凝膠分析。沉淀在如每條泳道所示的乳酸依沙吖啶不同濃度進(jìn)行，標(biāo)有X的泳道是不同大腸桿菌勻漿物的澄清上清，即抗-CD18F(ab’)2、抗-TF F(ab’)2和全長(zhǎng)抗-TF(分別見(jiàn)圖9A、9B和9C)?？?CD18F(ab’)2、抗-TFF(ab’)2和全長(zhǎng)抗-TF的pH值分別為8.5、7.5、6.0。樣品的電導(dǎo)率為3.2±0.2mS/cm。所有樣品加載到凝膠之前補(bǔ)足體積，因此如果回收率為100％，條帶的強(qiáng)度應(yīng)該與提取物(X)相當(dāng)。箭頭所示為產(chǎn)物條帶。
圖10A和10B顯示兩種上清液分別經(jīng)水或乳酸依沙吖啶稀釋后的非還原性SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色凝膠分析。在不同電導(dǎo)率水平進(jìn)行沉淀。用含有抗-CD18F(ab’)2的大腸桿菌勻漿物進(jìn)行此項(xiàng)研究。以水(圖10A)或者0.8％的乳酸依沙吖啶溶液，即用于每個(gè)試驗(yàn)中的乳酸依沙吖啶終濃度為0.6％(圖10B)將勻漿物稀釋4倍，將pH值調(diào)節(jié)到8.3。將NaCl以0-400mM范圍內(nèi)的不同濃度(如圖所示)加入樣品中來(lái)改變電導(dǎo)率。箭頭所示為產(chǎn)物條帶。
圖11顯示了在逐步升高的NaCl濃度中乳酸依沙吖啶的溶解度圖。在檢測(cè)可溶性乳酸依沙吖啶濃度之前，樣品在室溫溫育3小時(shí)。空心符號(hào)的表示1.2％乳酸依沙吖啶溶液而實(shí)心符號(hào)則表示0.6％的溶液。實(shí)線(xiàn)表示pH值為6.0的0.6％的乳酸依沙吖啶溶液，虛線(xiàn)表示pH值為6的1.2％的乳酸依沙吖啶溶液，點(diǎn)線(xiàn)表示pH值為9的0.6％的乳酸依沙吖啶溶液，加點(diǎn)虛線(xiàn)表示pH值為9的1.2％的乳酸依沙吖啶溶液。
圖12A-12C顯示三種上清液經(jīng)乳酸依沙吖啶沉淀后的非還原性SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色凝膠分析。在提高的溫度進(jìn)行沉淀，標(biāo)有X的泳道是不同大腸桿菌勻漿物，即抗-CD18(F(ab’)2)、抗-TF(F(ab’)2)和全長(zhǎng)抗-TF的澄清上清(分別如圖12A、12B和12C)。將勻漿物稀釋4倍，使乳酸依沙吖啶的終濃度為0.6％，分別將抗-CD18(F(ab’)2)、抗-TF(F(ab’)2)和全長(zhǎng)抗-TF的pH調(diào)節(jié)到8.5、7.5和6.0。溫度和溫育時(shí)間如圖所示，箭頭所示為產(chǎn)物條帶。
圖13顯示了三種不同上清液的濁度與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系。實(shí)心圓圈(4℃)或空心圓圈(21℃)表示用0.6％乳酸依沙吖啶處理的抗-CD18勻漿物的上清，實(shí)心方塊(4℃)或空心方塊(21℃)表示以0.2％PEI處理的樣品。實(shí)心三角(4℃)或空心三角(21℃)表示濃縮前用水稀釋的抗-CD18澄清勻漿物中回收的上清。在所有的情況下，抗-CD18勻漿物都被稀釋4倍且pH值為7.2。
發(fā)明詳述定義“微生物發(fā)酵液或勻漿物(homogenate)”是指微生物(包括酵母、真菌、以及原核生物如細(xì)菌)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)(不管使用的是什么培養(yǎng)容器，例如，搖瓶或發(fā)酵罐)、并消耗營(yíng)養(yǎng)所獲得的培養(yǎng)液(broth)，糊狀物(paste)，或提取物(extract)，優(yōu)選為重新懸浮的形式。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液或勻漿物來(lái)自酵母或原核生物。更優(yōu)選，所述培養(yǎng)液或勻漿物來(lái)自細(xì)菌。本文中優(yōu)選勻漿物。在一些情況下，當(dāng)溶液的電導(dǎo)率(conductivity)很高時(shí)，優(yōu)選收獲細(xì)胞并將它們重新懸浮，但在其它情況下，優(yōu)選直接使用從發(fā)酵罐中獲得的勻漿物。培養(yǎng)液或勻漿物的組分包括細(xì)胞碎片，宿主細(xì)胞蛋白，DNA，RNA等。因此，在這里，添加乳酸鹽(lactate)導(dǎo)致選擇性沉淀宿主細(xì)胞蛋白等，從而提供比不使用乳酸鹽時(shí)更強(qiáng)的純化能力。
“在使多肽的主要部分保持可溶狀態(tài)的條件下”是指，將乳酸依沙吖啶(ethacridine lactate)添加到培養(yǎng)液或勻漿物中，添加量、添加時(shí)的溫度以及電導(dǎo)率水平應(yīng)使得能防止目標(biāo)多肽的主要部分從培養(yǎng)液或勻漿物中沉淀出來(lái)。優(yōu)選這類(lèi)條件防止多肽的約60％以上的部分沉淀，更優(yōu)選約70％以上，還更優(yōu)選約75％以上，還更優(yōu)選約80％以上，還更優(yōu)選約85％以上，還更優(yōu)選約85％以上，還更優(yōu)選約90％，以上，還更優(yōu)選約95％以上。這一溶解度可以通過(guò)合適的試驗(yàn)測(cè)量，所述試驗(yàn)例如RP-HPLC，親和層析，ELISA，RIA，以及SDS-PAGE與高效親和層析(HPAC)聯(lián)用。對(duì)試驗(yàn)的選擇取決于諸如所用宿主細(xì)胞類(lèi)型和所藥產(chǎn)生的多肽等因素。
“細(xì)菌”在本文中指真細(xì)菌(eubacteria)和古細(xì)菌(archaebacteria)。優(yōu)選真細(xì)菌，包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。更優(yōu)選革蘭氏陰性菌。優(yōu)選類(lèi)型之一是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)。屬于腸桿菌科的細(xì)菌的實(shí)例包括埃希氏菌屬(Escherichia)，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文氏菌屬(Erwinia)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，變形菌屬(Proteus)，沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)，沙雷氏菌屬(Serratia)和志賀氏菌屬(Shigella)。其它適合的細(xì)菌包括固氮菌屬(Azotobacter)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，根瘤菌屬(Rhizobia)，透明顫菌屬(Vitreoscilla)，和副球菌屬(Paracoccus)。本文優(yōu)選大腸桿菌(E.coli)。合適的大腸桿菌宿主包括大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)，大腸桿菌294(ATCC31,446)，大腸桿菌B和大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)。這些實(shí)例都是舉例說(shuō)明，并非限制，優(yōu)選W3110。也可以使用上述任一種細(xì)菌的突變細(xì)胞。當(dāng)然，選擇合適的細(xì)菌必需考慮復(fù)制子在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制的能力。例如，當(dāng)用pBR322，pBR325，pACYC177，或pKN410等已知質(zhì)粒供應(yīng)復(fù)制子時(shí)，大腸桿菌、沙雷氏菌或沙門(mén)氏菌物種是合適的宿主。詳見(jiàn)下文關(guān)于合適的細(xì)菌宿主細(xì)胞的實(shí)例。
“細(xì)胞”，“細(xì)胞系”，“菌株”以及“細(xì)胞培養(yǎng)物”在本文中可以互換使用，它們都包括其后代。因此，“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代細(xì)胞及其衍生的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)理解，由于有意或無(wú)意的突變，所有后代在DNA含量方面不一定完全相同。在最初的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出的、具有相同功能或生物活性的突變后代也包括在內(nèi)。不管命名有不同，其內(nèi)容可以清楚顯示其含義。
“多肽”在本文中一般指，來(lái)自任何細(xì)胞來(lái)源、具有10個(gè)以上氨基酸的肽和蛋白?！爱愒础倍嚯氖侵赶鄬?duì)于所用的宿主細(xì)胞而言外來(lái)的多肽，如大腸桿菌產(chǎn)生的人蛋白。異源多肽可以是原核多肽或真核多肽，優(yōu)選真核多肽，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物的多肽，最優(yōu)選人的多肽。優(yōu)選是重組產(chǎn)生的多肽，或重組的多肽。
多肽產(chǎn)生于并溶于發(fā)酵液或勻漿物中，是指它產(chǎn)生在這樣的發(fā)酵液或勻漿物中，并且已經(jīng)是產(chǎn)物中的可溶性級(jí)分，或者是經(jīng)離液劑(chaotrope)(例如，尿素或胍)或去污劑(如十二烷基硫酸鈉(SDS))等溶解劑處理或與之接觸而成不溶性級(jí)分或形式或相，經(jīng)或未經(jīng)還原劑(如二硫蘇糖醇或beta-巰基乙醇)處理以助溶解?！翱扇艿?Soluble)”“增溶的(solubilized)”“增溶(solubilization)”“溶于(dissolved)”或“溶解(dissolution)”在本文中是指，多肽離心后在上清中而不是在固體級(jí)分中。沉淀或溶解度可以通過(guò)，例如上述合適的試驗(yàn)來(lái)確定。
哺乳動(dòng)物多肽的實(shí)例包括下列分子，例如腎素；生長(zhǎng)因子，包括人生長(zhǎng)因子和牛生長(zhǎng)因子；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺素；甲狀腺刺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；前胰島素；血小板生成素；卵泡刺激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子如凝血因子VIIIC，凝血因子IX，組織因子(TF)，和von Willebrands因子；抗-凝血因子，如蛋白C；心房利鈉因子(atrial naturietic factor)；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活劑，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)及其變體如RETEVASETM和TNKASETM；蛙皮素(bombesin)；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和-β；抗ErbB2結(jié)構(gòu)域抗體如2C4(WO 01/00245；雜交瘤ATCC HB-12697)，其與ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域(例如，ErbB2的約殘基22-584(含)所示區(qū)域中的任何一或多個(gè)殘基)結(jié)合，腦啡肽酶；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；前松弛素；小鼠絨毛膜促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，例如β-內(nèi)酰胺酶；DNase；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A或D；類(lèi)風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經(jīng)生長(zhǎng)因；心營(yíng)養(yǎng)蛋白(cardiotrophin)(心臟肥大因子)如心營(yíng)養(yǎng)蛋白-1(CT-1)；血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，例如aFGF和bFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8和CD19；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生(morphogenetic)蛋白(BMP)；干擾素，例如干擾素-α、-β和γ；血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(IL)，例如IL-1到IL-10；抗-HER-2抗體；Apo2配體；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變(decay)加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；粘著素(adderssin)；調(diào)節(jié)蛋白；抗體；以及上述任何多肽的片段。
本文優(yōu)選的多肽包括人血清白蛋白(HSA)，2C4，組織因子，抗-組織因子，抗-CD20，抗-HER-2，遺傳調(diào)節(jié)蛋白(heregulin)，抗-IgE，抗-CD11a，抗-CD18，VEGF及其受體和抗體如rhuFab V2和AVASTINTM，生長(zhǎng)激素及其變體，如hGH，生殖激素受體，生長(zhǎng)激素釋放蛋白(GHRP)，LIV-1(EP1,263,780)，TRAIL，腫瘤壞死因子(TNF)及其抗體，TNF受體和相關(guān)抗體，TNF-受體-IgG，TNF受體相關(guān)因子(TRAF)及其抑制因子，凝血因子VIII，凝血因子VIII B結(jié)構(gòu)域，干擾素如干擾素-γ，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-β，抗-TGF如抗-TGF-β，活化素，抑制素，抗-活化素，抗-抑制素，組織-纖溶酶原激活劑及其變體如t-PA，RETEPLASETM和TNKase，抗-Fas抗體，Apo-2配體；Apo-2配體抑制劑；Apo-2受體，Apo-3，凋亡因子，Ced-4，DcR3，死亡受體和激動(dòng)劑抗體(DR4，DR5)，淋巴毒素(LT)，促乳素(prolactin)，促乳素受體，SOB蛋白，WISP(wnt-誘導(dǎo)的經(jīng)選擇的蛋白)，神經(jīng)毒素(neurotoxin)-3(NT-3)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和抗-NGF，DNase，肝炎病毒抗原，單純皰疹病毒抗原，leptin，胰島素-樣生長(zhǎng)因子(IGFs)如IGF-1和IGF-2及其結(jié)合蛋白和受體如IGFBP-1-IGFBP-6，胰島素，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)如FGF-17，Toll蛋白，TIE配體，CD40和抗-CD40，免疫粘附素，枯草桿菌蛋白酶，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，血小板生成素(TPO)，白細(xì)胞介素如IL-2，IL-12，IL-17，IL-22，IL-8，IL-9，及其抗體，以及前列腺特異性癌抗原(PSCA)。
結(jié)合HER2的抗體的實(shí)例包括4D5，7C2，7F3和2C4，及其人源化變體，包括huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,821,337的表3；以及人源化2C4突變體編號(hào)560，561，562，568，569，570，571，574，或56869，參見(jiàn)WO01/00245。7C2、7F3及其人源化變體參見(jiàn)WO98/17797。
結(jié)合CD20抗原的抗體的實(shí)例包括“C2B8”，現(xiàn)稱(chēng)為“Rituximab”(“RITUXAN”)(美國(guó)專(zhuān)利5,736,137)；釔-[90]-標(biāo)記的2B8鼠抗體“Y2B8″(美國(guó)專(zhuān)利5,736,137)；鼠IgG2a“B1”，可以用131I標(biāo)記，產(chǎn)生“131I-B1”抗體(BEXXARTM)(美國(guó)專(zhuān)利5,595,721)；鼠單克隆抗體“1F5″(Press et al.，Blood，69(2)584-591(1987))；“嵌合2H7″抗體(美國(guó)專(zhuān)利5,677,180)；以及單克隆抗體L27，G28-2，93-1B3，B-C1或NU-B2，它們可以從International LeukocyteTyping Workshop(Valentine et al.，InLeukocyte Typing III(McMichael，Ed.，p.440，Oxford University Press(1987))獲得。
更優(yōu)選的多肽是2C4，抗-組織因子，抗-CD20，抗-HER-2，遺傳調(diào)節(jié)蛋白，抗-IgE，抗-CD11a，抗-CD18，抗-VEGF如rhuFab V2，hGH，GHRP，LIV-1，TRAIL，抗TNF、TNF受體及其相關(guān)抗體的抗體，TRAF抑制劑，TNF-受體-IgG，凝血因子VIII，凝血因子VIII B結(jié)構(gòu)域，干擾素-γ，TGF-β和抗-TGF-β，活化素，抑制素，抗-活化素，抗-抑制素，t-PA，TNKase，抗-Fas抗體，Apo-2配體；Apo-2配體抑制劑；Apo-2受體，Apo-3，DcR3，死亡受體和激動(dòng)劑抗體(DR4，DR5)，淋巴毒素(LT)，促乳素，促乳素受體，WISP，抗-NGF，NGF，NT-3，抗-IL-8，抗-IL-9.IL-17，IL-22，DNase，GHRP，肝炎病毒抗原，單純皰疹病毒抗原，leptin，IGF-1和IGFBP1-6，胰島素，F(xiàn)GF-17，Toll蛋白，TIE配體，CD40，免疫粘附素，枯草桿菌蛋白酶，HGF，和TPO。
還更優(yōu)選的多肽是2C4，抗-組織因子，抗-CD20，抗-HER-2，抗-IgE，抗-CD11a，抗-CD18，抗-VEGF如rhuFab V2，hGH，LIV-1，TRAIL，抗TNF和TNF受體和相關(guān)抗體的抗體，TNF-受體-IgG，凝血因子VIII，凝血因子VIIIB結(jié)構(gòu)域，干擾素-γ，TGF-β，活化素，抑制素，抗-活化素，抗-抑制素，t-PA，TNKase，Apo-2配體；Apo-2配體抑制劑；Apo-2受體，Apo-3，DcR3，死亡受體和激動(dòng)劑抗體(DR4，DR5)，WISP，TRAF抑制劑，抗-NGF，NGF，NT-3，抗-IL-8，抗-IL-9，IL-17，IL-22，抗-TGFs，DNase，GHRP，肝炎病毒抗原，單純皰疹病毒抗原，leptin，IGF-1和IGFBP1-6，胰島素，F(xiàn)GF-17，Toll蛋白，TIE配體，抗-CD40，HGF，和TPO。
特別優(yōu)選的多肽是重組多肽，更優(yōu)選抗體，包括單克隆抗體和人源化抗體抗體。這種抗體可以是全長(zhǎng)抗體或抗體片段。更優(yōu)選，這些抗體是人的抗體或人源化抗體，包括，例如特別優(yōu)選的多肽2C4，抗-組織因子Fab’2及其全長(zhǎng)分子，抗-CD20，抗-HER-2，抗-IgE，抗-CD11a，抗-CD18Fab’2及其全長(zhǎng)分子，抗-VEGF全長(zhǎng)分子和rhuFab V2，LIV-1，DR4，DR5，和TRAIL。
還更優(yōu)選，抗體是抗-IgE，抗-CD18，抗-VEGF，抗-組織因子，2C4，抗-Her-2，抗-CD20，抗-CD40，或抗-CD11a抗體。包含在多肽定義中的抗體片段優(yōu)選包含輕鏈，更優(yōu)選包含к輕鏈。這類(lèi)優(yōu)選片段包括，例如Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，或F(ab’)2-亮氨酸拉鏈(LZ)融合體，最優(yōu)選F(ab’)2。最優(yōu)選的抗體是抗-CD18F(ab’)2，抗-組織因子F(ab’)2，全長(zhǎng)抗-組織因子抗體，以及抗-VEGF抗體。
本文術(shù)語(yǔ)“抗體”是指最廣義上的抗體，具體包括完整(intact)單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要它們顯示所需生物學(xué)活性即可。
本文術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指，來(lái)自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個(gè)抗體均相同。單克隆抗體具有高度特異性，直接針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與包括針對(duì)不同決定簇(表位)的多個(gè)不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每種單克隆抗體直接針對(duì)抗原上的單個(gè)表位。單克隆抗體除了它們?cè)谔禺愋苑矫娴膬?yōu)勢(shì)以外，優(yōu)勢(shì)還包括它們的合成不會(huì)污染其它抗體。修飾詞“單克隆”表明該抗體的特點(diǎn)，即，它來(lái)自基本均一的抗體群，不解釋為需通過(guò)任何特殊方法產(chǎn)生該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的單克隆抗體可通過(guò)由Koehler et al.，Nature，256495(1975)首先描述的雜交瘤法進(jìn)行制備，或者可通過(guò)重組DNA法進(jìn)行制備(例如見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可利用例如Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)中分離。
本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分與源自具體物種或?qū)儆诰唧w抗體種類(lèi)或亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，但所述鏈的剩余部分與源自另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體種類(lèi)或亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，單克隆抗體還包括這類(lèi)抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性(美國(guó)專(zhuān)利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。本文的目標(biāo)嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類(lèi)化(primatized)”抗體，其包含源于非人靈長(zhǎng)類(lèi)可變區(qū)的抗原結(jié)合序列(如OldWorld Monkey，Ape等)和人的恒定區(qū)序列。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合部分或可變區(qū)部分?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二價(jià)抗體(diabodies)；線(xiàn)性抗體；單鏈抗體分子；和由多個(gè)抗體片段形成的多特異性抗體。
“完整(intact)”抗體包含與抗原結(jié)合的可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)CH1，CH2和CH3。恒定區(qū)可以是天然序列恒定區(qū)(例如，人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列變體。優(yōu)選，完整抗體具有一或多種效應(yīng)功能。
抗體“效應(yīng)功能”是指可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或具有氨基酸序列變異的Fc區(qū))的那些生物學(xué)活性?？贵w“效應(yīng)功能”的實(shí)例包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒活性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性(ADCC)；胞吞作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體，BCR)下調(diào)等。
完整抗體根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列可分為不同的“類(lèi)”。主要有5類(lèi)免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它們分別具有被稱(chēng)為α、δ、ε、γ和μ的重鏈，其中的α和γ還可以根據(jù)其CH序列和功能的更小差異進(jìn)一步分成亞類(lèi)，例如人類(lèi)表達(dá)以下亞類(lèi)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同類(lèi)免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。
“抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性”和“ADCC”是指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(例如自然殺傷(NK)細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別結(jié)合在靶細(xì)胞上的抗體，隨后引起該靶細(xì)胞裂解。介導(dǎo)ADCC作用的主要細(xì)胞NK細(xì)胞僅表達(dá)FcRIII，而單核細(xì)胞則表達(dá)FcRI、FcRII和FcRIII。關(guān)于造血細(xì)胞上FcR表達(dá)的總結(jié)見(jiàn)Ravetch andKinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-92(1991)，464頁(yè)，表3。為了評(píng)價(jià)目標(biāo)分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC試驗(yàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利5,500,362或5,821,337中所述。用于這類(lèi)試驗(yàn)的有效效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。或者(或另外)，可在體內(nèi)，例如在Clynes et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95652-656(1998)所述的動(dòng)物模型中，評(píng)估目標(biāo)分子的ADCC活性。
“人類(lèi)效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)功能的白細(xì)胞。優(yōu)選，所述細(xì)胞至少表達(dá)Fc RIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)功能。介導(dǎo)ADCC作用的人類(lèi)白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。所述效應(yīng)細(xì)胞可從其天然來(lái)源中分離，例如從本文所述血液或PBMC中分離。
“天然抗體”通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈具有不同數(shù)目的二硫鍵。每條重鏈和輕鏈還有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。人們相信有一些氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語(yǔ)“可變”是指可變區(qū)一些部分的序列在不同抗體之間有很大差異，它們可在各個(gè)具體抗體針對(duì)其具體抗原的結(jié)合和特異性方面發(fā)揮作用。然而，該變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個(gè)稱(chēng)為超變區(qū)的節(jié)段中。可變區(qū)中更高度保守的部分稱(chēng)為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包括4個(gè)FR，主要采取β折疊構(gòu)型，由三個(gè)超變區(qū)相連，形成環(huán)狀連接，在一些情況下可形成所述β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈的超變區(qū)通過(guò)FR區(qū)緊密相連，彼此十分靠近，并且與其它鏈的超變區(qū)一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)Kabat et al.，Sequencesof蛋白o(hù)f Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出各種效應(yīng)功能，例如參與抗體的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性作用(ADCC)。
本文中術(shù)語(yǔ)“超變區(qū)”是指抗體上負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)一般包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如，輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，重鏈可變區(qū)中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequence of proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))，和/或來(lái)自“超變環(huán)”的那些殘基(例如，輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，重鏈可變區(qū)中的殘基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196901-917(1987))。“框架區(qū)”或“FR”殘基是那些可變區(qū)殘基而不是本文定義的超變區(qū)殘基。
用木瓜蛋白酶消化抗體可產(chǎn)生兩個(gè)相同的各帶有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合片段(稱(chēng)為“Fab”片段)和殘余的“Fc”片段，F(xiàn)c片段的名稱(chēng)反應(yīng)了其易于結(jié)晶的能力。經(jīng)胃蛋白酶處理可產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并仍然能與抗原交聯(lián)的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原-識(shí)別和抗原-結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此區(qū)由一個(gè)重鏈可變區(qū)與一個(gè)輕鏈可變區(qū)緊密地非共價(jià)連接形成的二聚體組成。在這個(gè)構(gòu)型中，每個(gè)可變區(qū)的三個(gè)超變區(qū)相互作用，在VH-VL二聚體表面限定抗原結(jié)合位點(diǎn)。這六個(gè)超變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或Fv上僅含有三個(gè)抗原特異性超變區(qū)的一半)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管與完整的結(jié)合位點(diǎn)相比其親和力較低。
Fab段還包括輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段區(qū)別于Fab片段之處在于，F(xiàn)ab’在重鏈CH1區(qū)的羧基末端多出數(shù)個(gè)殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定區(qū)半胱氨酸殘基帶有至少一個(gè)游離巰基的那些Fab’。F(ab’)2抗體片段最初產(chǎn)生為Fab’片段對(duì)的形式，在它們之間具有鉸鏈區(qū)半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)是眾所周知的。
脊椎動(dòng)物任何物種的抗體的“輕鏈”，可依據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列而歸為兩種完全不同類(lèi)型(稱(chēng)為к和λ)中的一種。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，且這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈上。優(yōu)選，F(xiàn)v多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，它能使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述見(jiàn)Plückthunin The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburgand Moore eds.(Springer-Verlag，New York，1994)，pp.269-315?？?ErbB2抗體scFv片段可參見(jiàn)WO93/16185；美國(guó)專(zhuān)利5,571,894；美國(guó)專(zhuān)利5,587,458。
術(shù)語(yǔ)“二價(jià)抗體(diabodies)”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小分子抗體片段，這些片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中含有相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)。利用一種太短以至于不能使同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域配對(duì)的接頭，可以迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。二價(jià)抗體的詳細(xì)說(shuō)明參見(jiàn)，如EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)。
“人源化”非人(例如嚙齒類(lèi))抗體是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。大多數(shù)場(chǎng)合，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，但其中受體的超變區(qū)殘基被具有所需特異性、親和力以及能力的小鼠、大鼠、家兔或非人靈長(zhǎng)類(lèi)等非人源物種抗體(供體抗體)的超變區(qū)殘基所取代。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白的一些框架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人類(lèi)殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進(jìn)一步細(xì)化(refine)抗體性能。一般而言，人源化抗體基本上包括至少一個(gè)(通常包括兩個(gè))可變區(qū)的全部，其中超變環(huán)的全部或基本上全部對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的相應(yīng)部分，而FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白的序列。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常為人的免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。詳見(jiàn)Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
“分離的”抗體，是指從其天然環(huán)境的組分中鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境中的雜質(zhì)組分是可以干擾該抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，可包括酶，激素，及其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體經(jīng)過(guò)純化可以達(dá)到以下程度(1)按Lowry法測(cè)定，達(dá)到抗體重量的95％以上，最優(yōu)選重量的99％以上，(2)足以經(jīng)轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀(spinning cupsequenator)測(cè)出N-末端氨基酸序列或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基，或者(3)經(jīng)過(guò)還原或非-還原條件下的SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色測(cè)出為均質(zhì)。分離的抗體包括重組細(xì)胞中的原位抗體，因?yàn)樵摽贵w的天然環(huán)境中的至少一種組分不存在。但是通常，分離的抗體通過(guò)至少一步純化步驟制得。
“亮氨酸拉鏈”是一種肽(常常約20-40個(gè)氨基酸長(zhǎng))，其具有數(shù)個(gè)重復(fù)氨基酸，其中每第7個(gè)氨基酸是亮氨酸。這種亮氨酸拉鏈序列形成兩性α-螺旋，其中的亮氨酸排列在疏水側(cè)以便形成二聚體。本文中亮氨酸拉鏈的實(shí)例包括，F(xiàn)os-Jun亮氨酸拉鏈(O′Shea et al.，Science，245646(1989))，其可用于形成異二聚體(例如，雙特異性抗體)；來(lái)自酵母的GCN4亮氨酸拉鏈(Landschulz et al.，Science，2401759-1764(1988))，其可用于形成同二聚體(例如，單特異性抗體)；以及在其它DNA-結(jié)合蛋白(如C/EBP和c-myc，及其中任一種的變體)中發(fā)現(xiàn)的亮氨酸拉鏈。
術(shù)語(yǔ)“控制序列”是指在具體宿主生物中表達(dá)可操作相連的編碼序列所必需的DNA序列。適宜于細(xì)菌的控制序列包括啟動(dòng)子，任選還有操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
當(dāng)核酸與另一核酸序列產(chǎn)生功能上的關(guān)聯(lián)時(shí)，該核酸與所述另一核酸序列“可操作相連”。例如，前序列或分泌前導(dǎo)序列被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白時(shí)，編碼前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與編碼該多肽的DNA是可操作相連的；啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，所述啟動(dòng)子與該編碼序列是可操作相連的；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)處在促進(jìn)翻譯的位置時(shí)，它與編碼序列是可操作相連的。通常，“可操作相連”是指相連的DNA是鄰接的，而且，在分泌前導(dǎo)序列的情況中，是鄰接并處在同一個(gè)閱讀框中的。連接可通過(guò)在便利的限制性位點(diǎn)進(jìn)行連接來(lái)完成。如果不存在這類(lèi)位點(diǎn)，可根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
術(shù)語(yǔ)多肽的“回收”一般是指，從產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞獲得不含細(xì)胞的該多肽。
“宿主細(xì)胞雜質(zhì)(Host cell impurities)”是指，發(fā)酵液或勻漿物中污染的宿主蛋白和其它生物分子雜質(zhì)如DNA和細(xì)胞碎片。
實(shí)施本發(fā)明的模式本發(fā)明一方面提供了從微生物發(fā)酵液或勻漿物中純化該多肽的方法，所述發(fā)酵液或勻漿物中產(chǎn)生并溶有所需異源多肽。所述多肽可以是產(chǎn)生在可溶性級(jí)分中，或者可以是不溶的(例如，產(chǎn)生在不溶性級(jí)分、相或形式中)并因此經(jīng)過(guò)接觸或處理使所述多肽溶解。如果產(chǎn)生的多肽為不溶狀態(tài)，它通過(guò)暴露于增溶劑(如上述)或與之接觸(例如，將這類(lèi)試劑添加到含有不溶性多肽的級(jí)分中)而溶解，然后再添加乳酸依沙吖啶。優(yōu)選所述多肽已經(jīng)在可溶性級(jí)分中。本文所述方法涉及向發(fā)酵液或勻漿物中添加有效量的乳酸依沙吖啶溶液，以便使該發(fā)酵液或勻漿物中所含的宿主細(xì)胞雜質(zhì)沉淀。所述添加是在使所述多肽的主要部分維持可溶狀態(tài)的條件下進(jìn)行。接著，將所需多肽從發(fā)酵液或勻漿物(包括細(xì)胞碎片，宿主蛋白，DNA，RNA等)中分離出來(lái)。
由于被乳酸依沙吖啶沉淀的大多數(shù)宿主蛋白帶負(fù)電而目標(biāo)多肽表面帶正電，優(yōu)選目標(biāo)多肽具有比宿主細(xì)胞雜質(zhì)中所含宿主蛋白的平均pI更高的pI，以便目標(biāo)多肽可以回收到上清中，與沉淀的宿主蛋白脫離。所述平均pI可以通過(guò)對(duì)宿主蛋白進(jìn)行雙向(2-D)凝膠分析來(lái)確定，例如，在這類(lèi)分析中，pI為約7.5-5.0，則平均值為6.25。或者，等電聚焦(即雙向凝膠分析中的第一向)、層析聚焦、計(jì)算氨基酸組成的方法都可以單獨(dú)用于確定平均pI。更優(yōu)選的多肽是具有至少約7的pI值的多肽，優(yōu)選pI值至少約7-10。
所用的優(yōu)選多肽如上所述。
所用乳酸依沙吖啶的濃度取決于，例如溶液中大多數(shù)宿主細(xì)胞雜質(zhì)表面的負(fù)電荷量。因此，乳酸依沙吖啶至少取決于溶液中DNA和宿主蛋白濃度等宿主細(xì)胞雜質(zhì)量。勻漿物中宿主蛋白和DNA的濃度越高，乳酸依沙吖啶的需要量越高。因此，可以與乳酸依沙吖啶形成復(fù)合物并因此沉淀的帶負(fù)電的組分越多，達(dá)到最大沉淀所需的乳酸依沙吖啶量越大。乳酸依沙吖啶的優(yōu)選濃度一般高于約0.1％重量/體積。更優(yōu)選乳酸依沙吖啶濃度約0.1-5％，還更優(yōu)選約0.4-5％，最優(yōu)選約0.6-5％重量/體積。
一般而言，沉淀時(shí)溶液的電導(dǎo)率越低，使所述多肽從細(xì)胞碎片和DNA中沉淀出來(lái)的效率越高。電導(dǎo)率可以通過(guò)，例如，勻漿物或發(fā)酵液中的含鹽量來(lái)控制，或者通過(guò)用水或其它合適的溶劑稀釋勻漿物或發(fā)酵液來(lái)控制。優(yōu)選發(fā)酵液或勻漿物添加乳酸依沙吖啶后的電導(dǎo)率小于約16毫姆歐(milliSiemens，mS)，更優(yōu)選約1-15mS，還更優(yōu)選約1-10mS，最優(yōu)選約1-5mS。
沉淀期間溶液的電導(dǎo)率至少部分取決于其中的鹽類(lèi)型。鹵化物(如氯化物或溴化物)不是所述鹽的優(yōu)選陰離子，但如果它們確實(shí)存在，優(yōu)選其在溶液中的濃度，在添加乳酸依沙吖啶之前低于約100mM，在添加乳酸依沙吖啶之后低于約50mM。本文所用鹽的一些實(shí)例包括緩沖鹽，TRIS，MES，MOPS，乙酸鹽，和檸檬酸鹽。鹽濃度必須不高于使乳酸依沙吖啶沉淀的量。實(shí)際量主要取決于鹽的類(lèi)型和鹽與乳酸依沙吖啶之間的化學(xué)計(jì)算量，底線(xiàn)是該化學(xué)計(jì)算量的最小值(low end)，即所述最小值意味著相對(duì)于乳酸依沙吖啶而言更多的鹽。
發(fā)酵液或勻漿物添加乳酸依沙吖啶之后的pH取決于，例如，多肽的pI，多肽表面負(fù)電荷量，溶液中宿主細(xì)胞雜質(zhì)量，以及乳酸依沙吖啶濃度。pH優(yōu)選不高于多肽的pI。一般情況下，pH為約4-10；但為了使宿主細(xì)胞雜質(zhì)有效沉淀，優(yōu)選發(fā)酵液或勻漿物添加乳酸依沙吖啶之后的pH不大于約9(因?yàn)槿樗嵋郎尺灌ぴ谠損H值以上荷電量減少)，優(yōu)選的范圍為約4-9。更優(yōu)選發(fā)酵液或勻漿物添加乳酸依沙吖啶之后的pH為約5-9，還更優(yōu)選為約6-9。多肽表面的負(fù)電荷越多，pH值在上述范圍內(nèi)越低，優(yōu)選所述多肽的pH范圍為約6-7。
發(fā)酵液或勻漿物添加乳酸依沙吖啶之后，可以任選在升高的溫度保溫一段時(shí)間。是否升高溫度和保溫多長(zhǎng)時(shí)間取決于很多因素，包括，目標(biāo)多肽的類(lèi)型，目標(biāo)多肽在該階段暴露于升高的溫度時(shí)如果發(fā)生改變，是什么改變，等等。例如，純化抗-組織因子F(ab’)2時(shí)，優(yōu)選升高的溫度，而純化全長(zhǎng)抗體時(shí)，優(yōu)選不加熱(have no heat)或溫度不高于約25℃。在考慮這些因素的前提下，發(fā)酵液或勻漿物添加乳酸依沙吖啶之后的溫度一般在約室溫-約70℃，更優(yōu)選在約室溫-約65℃維持約1-60分鐘。在必須升高溫度的情況下，優(yōu)選在約50-65℃維持約1-60分鐘。
另一方面，本發(fā)明提供了一種物質(zhì)組合物，它是從微生物細(xì)胞獲得的、包含乳酸依沙吖啶和異源多肽的發(fā)酵液或勻漿物。優(yōu)選地，所述多肽溶于所述發(fā)酵液或勻漿物。發(fā)酵液或勻漿物的細(xì)胞、多肽、濃度和條件如上所述。所述多肽的溶解程度可以用合適的試驗(yàn)(例如，上述的試驗(yàn))確定。以常規(guī)方式應(yīng)用培養(yǎng)參數(shù)并進(jìn)行多肽生產(chǎn)，如下述方法。
A.核酸及其修飾的選擇本文所述多肽，例如抗體，可以從任何來(lái)源產(chǎn)生(例如通過(guò)對(duì)完整抗體進(jìn)行肽裂解而產(chǎn)生)，但優(yōu)選重組制備。編碼目標(biāo)多肽的核酸適于為任何來(lái)源的RNA，cDNA或基因組DNA，只要其編碼此目標(biāo)多肽即可。篩選在微生物宿主中表達(dá)異源多肽(包括其變體)的合適核酸的方法是眾所周知的。篩選合適的核酸以便在微生物細(xì)胞培養(yǎng)中制備非-抗體多肽的方法也是本領(lǐng)域已知的。
如果要產(chǎn)生單克隆抗體，那么，編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法(如，利用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)很容易地分離和測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞是這類(lèi)DNA的優(yōu)選來(lái)源。DNA分離后，可將其置于表達(dá)載體中，然后用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化本文的微生物宿主細(xì)胞，以便在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細(xì)菌中重組表達(dá)的綜述包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
使非-人抗體人源化的方法是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選人源化抗體具有一或多個(gè)從非人來(lái)源導(dǎo)入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱(chēng)為“引進(jìn)的(import)”殘基，它們通常來(lái)自“引進(jìn)的”可變區(qū)。人源化過(guò)程基本可以按照Winter及其同事(Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，2391534-1536(1988))所述，用超變區(qū)序列取代人類(lèi)抗體的相應(yīng)序列來(lái)進(jìn)行。相應(yīng)地，此種“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專(zhuān)利4,816,567)，其中完整人類(lèi)可變區(qū)的很少一部分被非人物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中一些超變區(qū)殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類(lèi)抗體中類(lèi)似位點(diǎn)的殘基取代。
選擇可用于制備人源化抗體的人類(lèi)可變區(qū)(重鏈和輕鏈)，對(duì)降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂“最適應(yīng)(best-fit)”方法，針對(duì)已知人類(lèi)可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)篩選嚙齒類(lèi)抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類(lèi)的序列最相似的人類(lèi)序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims et al.，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法采用具有人類(lèi)輕鏈或重鏈特定亞型的所有人抗體的共有序列衍生特定框架區(qū)。相同的框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后仍保留對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)到此目的，在一種優(yōu)選方法中，用親本序列和人源化序列的三維模型，分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物，以此制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選的候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象的計(jì)算機(jī)程序。通過(guò)觀(guān)察這些展示結(jié)果，可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。通過(guò)這種方法，可從受體和引進(jìn)序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對(duì)靶抗原的親和力增加?？傊儏^(qū)殘基直接并且最主要涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
本申請(qǐng)還涉及人源化抗體或親和力成熟的抗體的各種形式。例如，所述人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是抗體片段，如Fab，其可任選與一個(gè)或多個(gè)靶向試劑偶聯(lián)以制備免疫偶聯(lián)物?；蛘撸鋈嗽椿贵w或親和力成熟的抗體可以是完整的抗體，例如完整的IgG1抗體。
Fab′-SH片段可從大腸桿菌直接回收，并經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)中分離F(ab′)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)(WO 93/16185；美國(guó)專(zhuān)利5,571,894和美國(guó)專(zhuān)利5,587,458)?？贵w片段也可以是“線(xiàn)性化抗體”，舉例如美國(guó)專(zhuān)利5,641,870所述。這類(lèi)線(xiàn)性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
雙特異性抗體是具有針對(duì)至少兩種不同抗原表位的結(jié)合特異性的抗體。雙特異抗體實(shí)例可以與Dkk-1蛋白的兩個(gè)不同抗原表位相結(jié)合。雙特異性抗體可制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如F(ab′)2雙特異性抗體)。
根據(jù)另一種方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)、CH2及CH3區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體的DNA，以及必要時(shí)，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染至適當(dāng)細(xì)菌宿主生物。這使得在使用三種非等比的多肽鏈進(jìn)行構(gòu)建的實(shí)施方案中，能非常靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達(dá)而獲得高產(chǎn)時(shí)或所述比例無(wú)特別意義時(shí)，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達(dá)載體。
在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一種結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二種結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)有利于從不必要的免疫球蛋白鏈混合群(combinations)中分離出所需雙特異性化合物，因?yàn)橹挥性撾p特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使分離變得容易。此方法公開(kāi)于WO94/04690。制備雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見(jiàn)例如Suresh et al.，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利5,731,168所述的另一種方法，可以改造一對(duì)抗體分子之間的界面，使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)中收獲的異二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一種抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補(bǔ)“溝”可通過(guò)將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二種抗體分子的界面上形成。此機(jī)制使得異二聚體的產(chǎn)量比同二聚體等其它不必要的終產(chǎn)物的高。
雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。已有觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，這類(lèi)抗體可用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞導(dǎo)向不必要的細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利4676980)，和用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過(guò)任何方便的交聯(lián)方法制備。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域已知，可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,676,980。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已在文獻(xiàn)中描述。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。Brennan et al.，Science，22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備成F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時(shí)被還原，從而穩(wěn)定相鄰的二巰基，并阻止分子間形成二硫鍵。生成的Fab′片段之后被轉(zhuǎn)化為硫代亞硝基苯甲酸(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab′-硫醇(thio)，再與等摩爾量的另一種Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固定所用的試劑。
另外，F(xiàn)ab′-SH片段可從大腸桿菌直接回收，并經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異抗體(Shalaby et al.，J.Exp.Med.，175217-225(1992))。
直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體(Kostelny et al.，J.Immunol.，1481547-1553(1992))。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過(guò)基因融合而連接。使抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)被還原，形成單體，然后被再氧化形成抗體異二聚體。該方法也可用于制備抗體同二聚體。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)描述的“二價(jià)抗體(diabody)”技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過(guò)接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無(wú)法配對(duì)。因此，一個(gè)片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)制備雙特異性抗體的策略也有報(bào)道(Gruber et al.，J.Immunol.，1525368(1994))。
本發(fā)明還涉及二價(jià)以上的抗體。例如可制備三特異性抗體(Tutt et al.，J.Immunol.，14760(1991))。
編碼多肽變體的核酸分子用本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括，但不限于，從天然來(lái)源分離(在存在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過(guò)對(duì)早先制備的該多肽變體或非變體形式進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變，PCR誘變或盒式誘變來(lái)制備。
優(yōu)選修飾本發(fā)明抗體的效應(yīng)功能，以便，例如，增強(qiáng)與Fc受體的結(jié)合。這可以通過(guò)在抗體Fc區(qū)引入一或多個(gè)氨基酸取代而獲得?；蛘?，或另外，可在Fc區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。
為了延長(zhǎng)該抗體的血清半衰期，可在該抗體(尤其抗體片段)中摻入補(bǔ)救(salvage)受體結(jié)合表位，如美國(guó)專(zhuān)利5,739,277所述。本文中術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指IgG分子(例如IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)該IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位。
本發(fā)明還涉及抗體的其它修飾。例如，可以使抗體與多種非蛋白質(zhì)聚合物中的一種，如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯(polyoxyalkylene)，或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物連接。
B.將核酸插入復(fù)制型載體可以將異源核酸(如cDNA或基因組DNA)適當(dāng)插入復(fù)制型載體中，以便在適宜啟動(dòng)子控制下在微生物中表達(dá)。許多載體可用于此目的，對(duì)合適的載體的選擇主要取決于要被插入該載體的核酸的大小和要被該載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì)胞。每種載體根據(jù)與其相容的具體宿主細(xì)胞而包含不同的組分。依具體的宿主種類(lèi)不同，載體組分通常包括但不限于一或多個(gè)下述組分信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一或多個(gè)標(biāo)志基因，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
一般來(lái)說(shuō)，包含復(fù)制子和源于與宿主細(xì)胞相容的物種的控制序列的質(zhì)粒載體與微生物宿主聯(lián)用。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)志序列。例如，大腸桿菌通常用pBR322轉(zhuǎn)化，這是來(lái)源于大腸桿菌的質(zhì)粒(參見(jiàn)例如，Bolivar et al.，Gene，295(1977))。pBR322含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗藥性基因，并由此提供鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡(jiǎn)便方法。pBR322質(zhì)?；蚱渌?xì)菌質(zhì)?；蚴删w也通常包含或在修飾后包含能被該宿主使用的啟動(dòng)子，以表達(dá)該選擇標(biāo)志基因。
(i)信號(hào)序列組分編碼本發(fā)明目標(biāo)多肽的DNA不僅可以直接表達(dá)，也可作為與另一多肽的融合來(lái)表達(dá)，所述另一多肽優(yōu)選信號(hào)序列或在成熟多肽的N末端具有特異性裂解位點(diǎn)的其它多肽。通常，信號(hào)序列是載體的組分，或者是被插入載體中的多肽DNA的一部分。所選異源信號(hào)序列應(yīng)當(dāng)是被宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶裂解)的一種序列。
對(duì)于不識(shí)別和加工天然或真核生物多肽信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，信號(hào)序列則被選自，例如，下組的原核生物信號(hào)序列取代lamB，ompF，堿性磷酸酶，青霉素酶，lpp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。為了進(jìn)行酵母分泌，所述信號(hào)序列可以是，例如，酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列，α因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母(Saccharomyces)和克魯維酵母(Kluyveromyces)的α因子前導(dǎo)序列，后者參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,010,182)，或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列(EP 362,179，1990-04-04公開(kāi))，或1990-11-15公開(kāi)的WO90/13646所描述的信號(hào)。
(ii)復(fù)制起點(diǎn)組分表達(dá)載體包含能使該載體在一或多種所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。在多種微生物中，這樣的序列眾所周知。來(lái)自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。
(iii)選擇基因組分表達(dá)載體通常包含選擇基因，也稱(chēng)為選擇標(biāo)志。該基因編碼為生長(zhǎng)在選擇性培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的存活或生長(zhǎng)所必需的蛋白質(zhì)。未用包含選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞將不能在所述培養(yǎng)基中存活。選擇標(biāo)志與本發(fā)明使用和定義的遺傳標(biāo)志不同。典型的選擇基因編碼具有以下性質(zhì)的蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素(如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性，(b)彌補(bǔ)并非由遺傳標(biāo)記造成的營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺陷，或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基不能供給的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌(Bacilli)D-丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個(gè)實(shí)例是利用藥物阻滯(arrest)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。在這種情況下，那些被目標(biāo)核酸成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生能賦予藥物抗性的多肽，從而在選擇中存活。這種顯性選擇的實(shí)例使用藥物新霉素(Southern et al.，J.Molec.Appl.Genet.，1327(1982))，霉酚酸(Mulligan et al.，Science，2091422(1980))和潮霉素(Sugden et al.，Mol.Cell.Biol.，5410-413(1985))。這三個(gè)實(shí)例利用在真核控制下的細(xì)菌基因，來(lái)傳遞對(duì)抗各自藥物G418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。
(iv)啟動(dòng)子組分用于產(chǎn)生目標(biāo)多肽的表達(dá)載體含有可被宿主生物識(shí)別并與編碼目標(biāo)多肽的核酸可操作相連的適宜啟動(dòng)子。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括，β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang et al.，Nature，275615(1978)；Goeddel et al.，Nature，281544(1979))，阿拉伯糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Guzman et al.，J.Bacteriol.，1747716-7728(1992))，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel，Nucleic Acids Res.，84057(1980)；EP 36,776)，和雜合(hybrid)啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子(deBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983))。但其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是適宜的。它們的核苷酸序列業(yè)已公開(kāi)，因而技術(shù)人員可以利用連接子或銜接子(adaptor)提供任何所需限制酶位點(diǎn)，將這些核苷酸序列與編碼目標(biāo)多肽的DNA連接(Siebenlist et al.，Cell，20269(1980))。
用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子通常還含有Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其與編碼目標(biāo)多肽的DNA可操作連接。該啟動(dòng)子可通過(guò)限制酶消化，與細(xì)菌來(lái)源的DNA脫離，并插入到含有所需DNA的載體中。
適用于酵母的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。適用于酵母宿主的啟動(dòng)序列的實(shí)例包括下述酶的啟動(dòng)子3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.，2552073(1980))或其它糖酵解酶(Hess et al.，J.Adv.Enzyme Reg.，7149(1968)；Holland，Biochemistry，174900(1978))，如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母啟動(dòng)子，即那些另具有由生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是下述基因的啟動(dòng)子區(qū)醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C(isocytochromeC)、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶，以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中進(jìn)一步描述了適用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子。
(v)構(gòu)建并分析載體包含上述所列一或多個(gè)組分的適宜載體可使用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)構(gòu)建。分離的質(zhì)?；駾NA片段按所需形式裂解，剪裁(tailored)和再連接，以產(chǎn)生所需質(zhì)粒。
為了分析證實(shí)所構(gòu)建質(zhì)粒中的正確序列，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12株294(ATCC 31,446)或其它菌株，并用相應(yīng)的氨芐青霉素或四環(huán)素抗性選擇出成功的轉(zhuǎn)化體。制備來(lái)自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化進(jìn)行分析，和/或用Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467(1977)或Messinget al.，Nucleic Acids Res.，9309(1981)的方法，或用Maxam et al.，Methods in Enzymology，65499(1980)的方法測(cè)序。
C.選擇并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞克隆或表達(dá)本文所述載體中的DNA的適宜宿主細(xì)胞可以是任何微生物細(xì)胞，包括原核生物和真菌的細(xì)胞，包括酵母。適于此目的的原核生物包括上述定義的細(xì)菌，優(yōu)選真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。例如腸桿菌科，如埃希氏菌屬(例如，大腸桿菌)，腸桿菌屬，歐文氏菌屬，克雷伯氏菌屬，變形菌屬，沙門(mén)氏菌屬(如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium))，沙雷氏菌屬(如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志賀菌氏屬等，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬如銅綠菌假單胞菌(P.aeruginosa)，及鏈霉菌屬(Streptomyces)。優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC 31,446)，但其它菌株，如大腸桿菌B，大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也是合適的。這些實(shí)例是用于說(shuō)明，并非限制。上述任一種菌株的突變細(xì)胞也可用作起始宿主，它們通過(guò)進(jìn)一步突變，可以包含至少本文所需的最少基因型(minimum genotype)。
大腸桿菌菌株W3110是優(yōu)選的親本大腸桿菌宿主，因?yàn)樗侵亟MDNA產(chǎn)物發(fā)酵的通用宿主。用作親本宿主的起始大腸桿菌宿主實(shí)例以及它們的基因型，包括于下表中

還優(yōu)選在產(chǎn)生36F8株的過(guò)程中的中間物，即27B4(美國(guó)專(zhuān)利5,304,472)和35E7(一種比27B4生長(zhǎng)好的自發(fā)、溫度-耐受性菌落分離物)。另一種適宜的菌株是具有突變的周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌菌株，見(jiàn)1990年8月7日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利4,946,783。
上述菌株可以通過(guò)親本菌株的染色體整合或其它技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，包括以下實(shí)施例中所述的技術(shù)。
全長(zhǎng)抗體可以按照2002-08-08公開(kāi)的WO 02/061090所述，在大腸桿菌中制備。
除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合于編碼多肽的載體的表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最常用的低等真核宿主微生物。其它包括，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beachand Nurse，Nature，290140(1981)；EP 139,383，1985-05-02公開(kāi))；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國(guó)專(zhuān)利4,943,529；Fleer et al.，Bio/Technology，9968-975(1991))，例如乳克魯維酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt et al.，J.Bacteriol.，737(1983))、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg et al.，Bio/Technology，8135(1990))、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K.marxianus)等；西洋蓍霉(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol.，28265-278(1988))；念珠菌屬(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)(Case et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263(1979))；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(EP 394,538，1990-10-31公開(kāi))等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、Tolypocladium(WO91/00357，1991-01-10公開(kāi))以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)(Ballance et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112284-289(1983)；Tilburn et al.，Gene，26205-221(1983)；Yelton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes，EMBO J.，4475-479(1985))。甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母(Methylotropic yeast)也適于本發(fā)明，包括但不限于，能在甲醇上生長(zhǎng)的選自以下屬的酵母漢遜氏酵母屬(Hansenula)，念珠菌屬，克勒克氏酵母屬(Kloeckera)，畢赤酵母屬，糖酵母屬(Saccharomyces)，球擬酵母屬(Torulopsis)，和紅酵母屬(Rhodotorula)。這類(lèi)酵母的具體實(shí)例可以參見(jiàn)C.Anthony，The Biochemistry of Methylotrophs，269(1982)。
編碼所述多肽的核酸被插入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選地，這可以通過(guò)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、并在為了誘導(dǎo)各種啟動(dòng)子而酌情改良的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)而完成。
根據(jù)所用的宿主細(xì)胞的不同，使用適合于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中1.82節(jié)所述的使用氯化鈣進(jìn)行的鈣處理，通常用于原核細(xì)胞或包含細(xì)胞壁實(shí)體屏障的其它細(xì)胞。另一轉(zhuǎn)化方法利用聚乙二醇/DMSO，如Chung and Miller，Nucleic Acids Res.，163580(1988)所述。向酵母中轉(zhuǎn)化通常按照Van Solingen et al.，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，763829(1979)所述方法進(jìn)行。然而，也可使用將DNA引入細(xì)胞的其它方法，例如核顯微注射、電穿孔、細(xì)菌原生質(zhì)體與完整細(xì)胞或聚陽(yáng)離子如聚凝胺(polybrene)、聚鳥(niǎo)氨酸融合。
D.培養(yǎng)宿主細(xì)胞用于制備本發(fā)明多肽的原核細(xì)胞在本領(lǐng)域已知的適于培養(yǎng)所選宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基包括Sambrook等出處同上所一般性描述的培養(yǎng)基。適用于細(xì)菌的培養(yǎng)基包括，但不限于，AP5培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth)，Luria-Bertani(LB)肉湯，Neidhardt′s基本培養(yǎng)基，以及C.R.A.P.基本或完全培養(yǎng)基，外加必需的營(yíng)養(yǎng)添加物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還包含一種選擇制劑，它是基于表達(dá)載體的構(gòu)建而選出的，可以選擇性允許含有該表達(dá)載體的原核細(xì)胞生長(zhǎng)。例如，在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素，使表達(dá)氨芐青霉素抗性基因的細(xì)胞生長(zhǎng)。除了碳源，氮源，和無(wú)機(jī)磷酸鹽源以外，還可以包括適當(dāng)濃度的任何必需添加物，它們可以單獨(dú)加入，或者與另一種添加物或培養(yǎng)基組合成混合物再加入，如復(fù)合氮源。還可選在培養(yǎng)基中包含一或多種還原劑，所述還原劑選自谷胱甘肽，半胱氨酸，胱胺，硫代乙醇酸(thioglycollate)，二硫赤蘚醇和二硫蘇糖醇。
合適的培養(yǎng)基的實(shí)例可以參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,304,472和5,342,763。C.R.A.P.磷酸鹽-限制型培養(yǎng)基組成如下3.57g(NH4)2(SO4)，0.71g檸檬酸鈉-2H2O，1.07g KCl，5.36g Yeast Extract(certified)，5.36g HycaseSFTM-Sheffield，pH用KOH調(diào)至7.3，qs用SQ H2O調(diào)至872ml，高壓滅菌；冷卻至55℃，添加110ml 1M MOPS pH7.3，11ml 50％葡萄糖，7ml 1M MgSO4)。然后，可以在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加50ug/ml羧芐青霉素。
原核宿主細(xì)胞在適當(dāng)溫度中培養(yǎng)。例如，大腸桿菌優(yōu)選在約20℃-約39℃，更優(yōu)選約25℃-約37℃，甚至更優(yōu)選約30℃生長(zhǎng)。
使用堿性磷酸酶啟動(dòng)子時(shí)，用于產(chǎn)生本發(fā)明目標(biāo)多肽的大腸桿菌細(xì)胞在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在所述適宜培養(yǎng)基中，堿性磷酸酶啟動(dòng)子可以被部分或完全誘導(dǎo)，總體如Sambrook等(出處同上)所述。培養(yǎng)需求決不在缺乏無(wú)機(jī)磷酸鹽或磷酸鹽饑餓水平的情況下發(fā)生。首先，培養(yǎng)基所含無(wú)機(jī)磷酸鹽的量超出誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的水平并足以使細(xì)菌生長(zhǎng)。隨著細(xì)胞生長(zhǎng)和利用磷酸鹽，其降低培養(yǎng)基中的磷酸鹽水平，從而導(dǎo)致誘導(dǎo)多肽合成。
如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，那么，為了使誘導(dǎo)發(fā)生，通常用高細(xì)胞密度方法將細(xì)胞培養(yǎng)至一定光密度(如A550約200)，以此啟動(dòng)誘導(dǎo)(例如，通過(guò)添加誘導(dǎo)物，通過(guò)耗竭培養(yǎng)基組分等)，從而誘導(dǎo)編碼目標(biāo)多肽的基因表達(dá)。
還可以包括適當(dāng)濃度的、本領(lǐng)域已知的任何必需添加物，它們可以單獨(dú)加入，或者與另一種添加物或培養(yǎng)基組合成混合物再加入，如復(fù)合氮源。培養(yǎng)基的pH可以是在約5-9的范圍內(nèi)的任何pH，這主要取決于宿主生物。對(duì)于大腸桿菌，pH優(yōu)選約6.8-約7.4，更優(yōu)選約7.0。
一種用于培養(yǎng)酵母的選擇性培養(yǎng)基是缺乏尿素的合成性完全葡萄糖瓊脂(SCD-Ura)，可以按照Kaiser et al.，Methods in Yeast Genetics(Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1994)，p.208-210所述來(lái)制備。
E.檢測(cè)表達(dá)基因表達(dá)可以直接在樣品中測(cè)定，例如用常規(guī)Southern印跡法，用于定量mRNA轉(zhuǎn)錄的Northern印跡法(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980))，斑點(diǎn)印跡(DNA分析)或原位雜交，它們使用基于多肽序列適當(dāng)標(biāo)記的探針?？梢允褂酶鞣N標(biāo)記物，最常見(jiàn)的是放射性同位素，尤其是32P。然而，也可使用其它技術(shù)，例如使用生物素-修飾的核苷酸以便引入到多核苷酸中。生物素在以后作為與抗生物素蛋白或用各式各樣標(biāo)記物(如放射性核素，熒光體，酶等)標(biāo)記的抗體相結(jié)合的位點(diǎn)?；蛘?，使用試驗(yàn)(assays)或凝膠(gels)檢測(cè)蛋白質(zhì)。
F.純化多肽使用重組技術(shù)時(shí)，本文所述多肽可產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)，或在周質(zhì)空間中。如果所述多肽是產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)，首先要通過(guò)例如離心或超濾作用除去顆粒狀殘?jiān)?為宿主細(xì)胞或裂解的細(xì)胞，是例如勻漿后的細(xì)胞)，從而產(chǎn)生發(fā)酵液或勻漿物。
然后，根據(jù)本發(fā)明，上述細(xì)胞雜質(zhì)通過(guò)用乳酸依沙吖啶在上述條件下沉淀，而從勻漿物或發(fā)酵液中除去，所得混合物經(jīng)過(guò)處理，獲得可溶性目標(biāo)多肽。
從發(fā)酵液或勻漿物中分離目標(biāo)多肽可以用任何合適的手段完整，包括本領(lǐng)域已知的離心和過(guò)濾等手段。優(yōu)選，用離心或切向流過(guò)濾的方法進(jìn)行分離，例如使用約300kD-1微的濾膜。
在將多肽從發(fā)酵液或勻漿物中分離后，可以用任何已知手段，包括層析或超濾/滲濾等過(guò)濾或切向流過(guò)濾，進(jìn)行純化。具體地，以下方法單獨(dú)或聯(lián)合可以作為適當(dāng)純化方法的實(shí)例，但具體用什么方法取決于多肽的類(lèi)型固相金屬親和層析(IMAC)，水性?xún)上喾蛛x(ATPS)，免疫親和柱或離子交換柱分級(jí)分離；乙醇沉淀；反相HPLC；疏水相互作用層析(HIC)；硅層析；離子交換樹(shù)脂如S-SEPHAROSETM和DEAE層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；超濾/滲濾，切向流過(guò)濾，凝膠過(guò)濾，使用例如SEPHADEXTMG-75。
例如，作為總體蛋白回收方法的一部分，可以使多肽暴露于與該多肽結(jié)合或修飾該多肽的固相試劑。如此一來(lái)，可以對(duì)多肽進(jìn)行親和層析，其中與該多肽特異性結(jié)合的固相試劑(如抗體)捕獲抗原，而雜質(zhì)則流過(guò)層析柱。然后通過(guò)改變條件，使多肽不再與固相試劑結(jié)合，而將多肽從層析柱上洗脫下來(lái)。固相試劑也可以是酶，如修飾該多肽的酶(Sahni et al.，Anal.Biochem.，193178-185(1991)；Voyksner et al.，Anal.Biochem.，18872-81(1990))。
另一種純化方法是過(guò)濾。為了使微細(xì)顆粒大小的污染物從流體中過(guò)濾出，可以使用各種多孔濾膜介質(zhì)，使被污染的組合物流過(guò)該濾膜，污染物被該濾膜截留。污染物的滯留可以通過(guò)機(jī)械應(yīng)變(mechanical straining)或動(dòng)電顆粒(electrokinetic particle)捕獲和吸附來(lái)發(fā)生。在機(jī)械應(yīng)變中，當(dāng)顆粒嘗試通過(guò)比它小的孔時(shí)被物理捕獲。在動(dòng)電捕獲機(jī)制中，顆粒在多孔濾膜內(nèi)與表面碰撞，由于短-范圍吸引力而被滯留在該表面。為了實(shí)現(xiàn)動(dòng)電捕獲，可以用電荷-變更系統(tǒng)改變?yōu)V膜表面的電荷特性(參見(jiàn)例如WO 90/11814)。例如，當(dāng)需要除去的污染物是陰離子時(shí)，可以用陽(yáng)離子電荷變更劑改變?cè)摓V膜的電荷特性，使污染物滯留在該濾膜上。
單克隆抗體可以通過(guò)常規(guī)抗體純化方法與沉淀劑適當(dāng)分離，所述方法例如凝膠過(guò)濾或電泳，透析，HIC，親和層析，如蛋白-A SEPHAROSETM，蛋白-G、抗原-親和或抗-IgG親和層析，勻漿，在離心、沉淀之后過(guò)濾使之澄清(例如用硫酸銨、聚乙二醇或辛酸處理)，離子交換層析，例如用羥基磷灰石等樹(shù)脂，如陶瓷-羥基磷灰石和BIOGEL HTTM等含有磷酸鈣的樹(shù)脂，以及陰離子交換樹(shù)脂，包括那些具有正電荷部分(處在中性pH)的樹(shù)脂如二乙胺乙烷(diethylaminoethane，DEAE)，聚1，2-亞乙基亞胺(polyethyleneimine，PEI)，和季銨乙烷(quaternary aminoethane，QAE)，例如Q-SEPHAROSEFAST FLOWTM樹(shù)脂(Pharmacia)，DEAE-SEPHAROSE FAST FLOWTM樹(shù)脂，DEAE-TOYOPEARLTM樹(shù)脂，QAE-TOYOPEARLTM樹(shù)脂，POROS-QTM樹(shù)脂，F(xiàn)RACTOGEL-DMAETM樹(shù)脂，F(xiàn)RACTOGEL EMD-TMAETM樹(shù)脂，MATREXCELLUFINE DEAETM等。分離和純化抗體的方法還可以參見(jiàn)AntibodiesALaboratory Manual″；Harlow and Lane，eds.(Cold Spring Harbor Laboratories，New York1988)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，回收步驟包括將已溶解的多肽暴露于固相，該固相上固定了與該多肽結(jié)合或修飾該多肽的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述固相被裝載在柱中，并且被固定的試劑可以捕獲所述多肽。在另一實(shí)施方案中，所述試劑對(duì)所述多肽進(jìn)行化學(xué)修飾和/或物理修飾，并且所述試劑被固定在固相上，而該固相被裝載在例如柱中，使組合物流經(jīng)該柱。例如，所述多肽可以包含前體區(qū)，該區(qū)在回收過(guò)程中可以被固相試劑除去，例如，所述前體多肽可以是具有亮氨酸拉鏈二聚化區(qū)的抗體，在回收過(guò)程中，該亮氨酸拉鏈二聚化區(qū)被固定的胃蛋白酶除去。
在該實(shí)施方案中，可以再使含有所述多肽和瀝濾劑(1eached reagent)(以及任選一或多種其它污染物)的組合物流經(jīng)濾膜，該濾膜在組合物的pH條件下帶有與所述試劑的電荷相反的電荷，從而可以使瀝濾劑與組合物脫離。濾膜可以帶有正電荷，以除去在組合物pH條件下帶負(fù)電荷的污染物如酸性蛋白酶，蛋白A，蛋白G或其它可以從親和柱上瀝濾而出的試劑。備選地，濾膜可以帶負(fù)電，以便除去在組合物pH條件下帶正電荷的污染物如堿性蛋白酶。優(yōu)選地，流過(guò)濾膜的組合物中目標(biāo)多肽的電荷特性，應(yīng)使該多肽不被該濾膜顯著滯留而是可以通過(guò)該濾膜。濾膜可以處于與之前步驟中被處理的洗脫物“在線(xiàn)(in line)”的位置(即，使洗脫物直接流過(guò)濾膜)。這可以通過(guò)在洗脫物被收集到匯集槽之前將濾膜與層析柱洗脫端口直接連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。濾膜可以用這類(lèi)濾膜常用的技術(shù)再生。
HIC也可以用于純化抗體片段。參見(jiàn)如Inouye et al.，Protein Engineering，pp.6，8and 1018-1019(1993)；Inouye et al.，Animal Cell TechnologyBasic &Applied Aspects，5609-616(1993)；Inouye et al.，Journal of Biochemical andBiophysical Methods，2627-39(1993)；Morimoto et al.，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods，24107-117(1992)；and Rea et al.，Journal of Cell.Biochem.，Suppl.0，Abstract No.X1-206(17Part A)，p.50(1993)。HIC柱通常包含堿性基質(zhì)(base matrix)(如交聯(lián)瓊脂糖或合成性共聚物材料)，疏水配體(如烷基或芳基)可以與之偶聯(lián)。HIC層析柱商品目前有很多。實(shí)例包括但不限于具有低或高取代的苯基SEPHAROSE 6FAST FLOWTM層析柱(Pharmacia LKB Biotechnology，AB，Sweden)；苯基SEPHAROSETM高效柱(Pharmacia LKB Biotechnology，AB，Sweden)；辛基SEPHAROSETM高效柱(Pharmacia LKB Biotechnology，AB，Sweden)；FRACTOGELTMEMD丙基或FRACTOGELTMEMD苯基層析柱(E.Merck，Germany)；MACRO-PREPTM甲基或MACRO-PREPTM叔丁基支持物(Bio-Rad，California)；WP HI-丙基(C3)TM柱(J.T.Baker，New Jersey)；和TOYOPEARLTM醚、苯基或丁基柱(TosoHaas，PA)。
分批疏水層析基質(zhì)(batch hydrophobic chromatography matrices)實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，包括與以下支持基質(zhì)相連的C18烷基鏈如SEPHAROSETM，瓊脂糖，或硅，例如丁基，苯基或辛基SEPHAROSETM，或者纖維素或polystyrene等聚合物。美國(guó)專(zhuān)利6,214,984描述了用低-pH疏水相互作用層析(LPHIC)純化抗體和抗體片段。該方法尤其可用于純化抗體片段，特別是從未正確折疊和/或經(jīng)二硫鍵連接的污染抗體片段中，純化出正確折疊并經(jīng)二硫鍵連接的抗體片段(如Fab片段)。在進(jìn)行LPHIC之前，優(yōu)選使從細(xì)胞制備的抗體組合物經(jīng)歷至少一個(gè)純化步驟，實(shí)例包括羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析和親和層析。蛋白A是否適合作為親和配體取決于抗體中任一種免疫球蛋白Fc區(qū)的種類(lèi)和同種型。蛋白A可以用于純化基于特定人類(lèi)重鏈的抗體(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.，621-13(1983))。蛋白G被建議用于所有小鼠同種型以及一種人類(lèi)同種型(Guss et al.，EMBO J.，51567-1575(1986))。親和配體附著的基質(zhì)最常見(jiàn)的是瓊脂糖，也可以采用其它基質(zhì)。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)例如控制孔徑的玻璃(controlled pore glass)或聚(苯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)與瓊脂糖相比，其流速更快且處理時(shí)間更短。當(dāng)抗體包含CH 3區(qū)時(shí)，可以用BAKERBOND ABXTM樹(shù)脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)進(jìn)行純化。其它蛋白純化技術(shù)，例如離子交換柱分級(jí)分離，乙醇沉淀，反相HPLC，硅層析，肝素SEPHAROSETM層析，陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(例如聚天冬氨酸柱)層析，層析聚焦，SDS-PAGE，和硫酸銨沉淀也可以采用，這取決于所回收的抗體。
G.多肽的應(yīng)用如此回收的多肽可以配制在可藥用載體中，用于各種診斷、治療用途，或這類(lèi)分子的其它已知用途。例如，本文所述抗體可以在免疫分析，如酶免疫分析中應(yīng)用。
用本文所述方法純化的多肽的治療用途也包括在本發(fā)明中。例如，生長(zhǎng)因子或激素可以用于根據(jù)需要促進(jìn)生長(zhǎng)，抗體可以用于重新引導(dǎo)(redirect)細(xì)胞毒活性(如，殺腫瘤細(xì)胞)，作為疫苗佐劑，用于將溶栓劑運(yùn)輸?shù)窖獕K部位，用于將免疫毒素運(yùn)送到腫瘤細(xì)胞，用于將酶活化的前體藥物運(yùn)送到目標(biāo)位置(如腫瘤)，用于治療傳染病，或用于將免疫復(fù)合物靶向細(xì)胞表面受體。
多肽的治療性配制劑如下制備并貯存將具有所需純度的多肽與任選的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thedition，Osol，A.，Ed.，(1980))混合成凍干塊(cake)或水溶液的形式。
可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度對(duì)受者無(wú)毒性，包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽，及其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量多肽(少于約10個(gè)殘基)；蛋白如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖，二糖及其它糖包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽反離子，如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
所述多肽也可容納在微膠囊中，或容納在膠體性質(zhì)的藥物運(yùn)送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)中，或者容納在大乳劑(macroemulsions)中，所述微膠囊可以通過(guò)諸如凝聚(coacervation)技術(shù)或界面聚合作用來(lái)制備，例子分別有羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)見(jiàn)Remington′sPharmaceutical Sciences，出處同上。
用于體內(nèi)給藥的多肽必須是無(wú)菌的。這可以通過(guò)在凍干和重建之前或之后，經(jīng)除菌濾膜過(guò)濾而輕易實(shí)現(xiàn)。抗體通常以?xún)龈尚问交蛉芤盒问奖４妗?br> 治療性多肽組合物通常放置在帶有無(wú)菌存取口的容器中，例如該容器可以是靜脈點(diǎn)滴袋(intravenous solution bag)或帶有能通過(guò)皮下注射針穿刺的塞子的小瓶。
多肽給藥途徑可以按照已知方法，例如通過(guò)靜脈內(nèi)、腹腔(intraperitoneal)內(nèi)、腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、或損傷內(nèi)途徑，或通過(guò)下文所述緩釋系統(tǒng)，進(jìn)行注射或輸注。多肽通過(guò)持續(xù)輸注給藥或作為集合藥團(tuán)(bolus)進(jìn)行注射。
緩釋制劑的適當(dāng)實(shí)例包括含有所述多肽的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)實(shí)例包括，聚酯、水凝膠(如Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)and Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982)所述的聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman et al.，Biopolymers，22547-556(1983))、不可降解的乙烯乙酸乙酯(Langer et al.，出處同上)、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。
聚合物如乙烯-乙酸乙酯和乳酸-羥基乙酸能持續(xù)釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間卻較短。例如，當(dāng)膠囊化抗體長(zhǎng)時(shí)間停留在體內(nèi)時(shí)，它們可能由于暴露在37℃潮濕環(huán)境中而變性或聚集，導(dǎo)致?lián)p失生物活性，且免疫原性可能會(huì)改變?？梢愿鶕?jù)相關(guān)機(jī)理來(lái)設(shè)計(jì)使抗體穩(wěn)定的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集的機(jī)理是通過(guò)硫-二硫鍵互換而形組分子間S-S鍵，則可通過(guò)修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制濕度、采用合適的添加劑、和開(kāi)發(fā)特異性聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。
緩釋多肽組合物還可以包括被脂質(zhì)體包裹的多肽。含抗體的脂質(zhì)體可通過(guò)原本已知的方法制備DE 3,218,121；Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688-3692(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本專(zhuān)利申請(qǐng)83-118008；美國(guó)專(zhuān)利4,485,045和4,544,545；以及EP 102,324。一般而言，脂質(zhì)體具有小(約200-800埃)單層形式，其中的脂質(zhì)含量大于約30mol.％膽固醇，這一選定的比例根據(jù)用多肽進(jìn)行最有效治療的需求進(jìn)行調(diào)整。
用于治療的多肽有效量取決于，例如治療目的、給藥途徑、以及患者的情況。相應(yīng)地，醫(yī)生(therapist)必須根據(jù)獲得最有益治療效果的需要，滴定劑量和調(diào)整給藥途徑。通常的日劑量可以是約1μg/kg至高達(dá)10mg/kg或更多，這取決于上述因素。一般地，臨床醫(yī)師會(huì)給藥多肽直至劑量達(dá)到獲得所需效果的水平。該治療的進(jìn)展很容易通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)來(lái)監(jiān)控。
本發(fā)明通過(guò)參考以下實(shí)施例可以更全面地理解。但它們不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。本文引用的所有文獻(xiàn)和專(zhuān)利都引入作為參考。
實(shí)施例1材料和方法A.質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化、發(fā)酵1.制備rhuFab’2(xCD18)
a.質(zhì)粒構(gòu)建設(shè)計(jì)對(duì)照質(zhì)粒pS1130用于抗-CD18F(ab’)2的雙順?lè)醋颖磉_(dá)，且它是在Carter et al.，Bio/Technology，10163-167(1992)所述載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。此設(shè)計(jì)將輕鏈和帶有C末端亮氨酸拉鏈的重鏈片段的基因的轉(zhuǎn)錄置于一個(gè)單phoA啟動(dòng)子的控制之下。轉(zhuǎn)錄結(jié)束于重鏈-亮氨酸拉鏈編碼序列下游的λt0轉(zhuǎn)錄終止子(Scholtissek和Grosse，Nucleic Acids Res.，15(7)3185(1987))。熱穩(wěn)定的腸毒素II信號(hào)序列(STII)位于每一條鏈的編碼序列之前，并且指導(dǎo)多肽分泌到細(xì)胞周質(zhì)中(Lee et al，Infect.Immun.，42264-268(1983)；Picken etal.，Infect.Immun.，42269-275(1983))。亮氨酸拉鏈附著在重鏈片段的C末端，用于促進(jìn)兩個(gè)Fab’臂的二聚化。
雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pxCD18-7T3包含兩個(gè)分離的翻譯單元，從時(shí)間上將輕鏈轉(zhuǎn)錄與重鏈轉(zhuǎn)錄分開(kāi)。輕鏈與在pS1130中一樣，仍然受到phoA啟動(dòng)子的調(diào)控。然而，在pxCD18-7T3中，輕鏈編碼區(qū)后跟著一個(gè)λt0轉(zhuǎn)錄終止子。這個(gè)終止子的下游添加tacII啟動(dòng)子以調(diào)控重鏈片段/C末端亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄(DeBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983))。第二個(gè)λt0轉(zhuǎn)錄終止子跟在這個(gè)編碼序列的后面。STII信號(hào)序列的沉默密碼子變體用于指導(dǎo)兩條鏈的分泌(Simmons和Yansura，Nature Biotechnology，14629-634(1996))。
圖1中顯示了單啟動(dòng)子對(duì)照質(zhì)粒與雙啟動(dòng)子質(zhì)粒的比較。pxCD18-7T3的表達(dá)盒序列在圖2中提供(SEQ ID NO1)，而兩個(gè)翻譯單元的氨基酸序列(SEQ ID NOS2和3)分別如圖3A(輕鏈)和3B(重鏈)所示。
b.發(fā)酵發(fā)酵中應(yīng)用的宿主菌株為大腸桿菌W3110的衍生菌，定名為59A7。59A7的完整基因型為W3110ΔfhuA phoAΔE15Δ(argF-lac)169deoC degP41ilvG2096(Valr)Δprc sprW148R，59A7宿主細(xì)胞用pxCD18-7T3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，篩選出成功的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。將另一質(zhì)粒pMS421與pxCD18-7T3一起共轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒pMS421是基于pSC101的質(zhì)粒，它提供lacIq以增強(qiáng)tacII啟動(dòng)子的控制，而且還賦予壯觀(guān)霉素和鏈霉素抗性。
對(duì)于每一輪10升發(fā)酵，單個(gè)含1.5mL培養(yǎng)物-10-15％DMSO液的小瓶在1-L搖瓶中解凍，所述搖瓶中含500mL LB培養(yǎng)基并添加0.5mL 5mg/mL的四環(huán)素溶液和2.5mL 1M的磷酸鈉溶液。使該種子培養(yǎng)物在30℃生長(zhǎng)約16小時(shí)，然后接種到10L的發(fā)酵罐。
發(fā)酵罐最初裝有約6.5L培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有約4.4g葡萄糖、100mL1M硫酸鎂、10mL痕量元素溶液(100mL鹽酸、27g六水合氯化鐵、8g七水合硫酸鋅、7g六水合氯化鈷、7g二水合鉬酸鈉、8g五水合硫酸銅、2g硼酸、5g一水合硫酸錳，終體積1L)，20mL四環(huán)素溶液(在5mg/mL乙醇中)，10mL FERMAX Adjuvant 27TM(或一些等效的消泡劑)，1袋HCD鹽(37.5g硫酸銨，19.5g磷酸氫二鉀，9.75g二水合磷酸二氫鈉，7.5g二水合檸檬酸鈉，11.3g磷酸二氫鉀)和200g NZ Amine A(一種蛋白水解物)。發(fā)酵在30℃、通氣量10slpm、pH值7.0±0.2的條件下進(jìn)行(盡管一些情況下會(huì)偶然出現(xiàn)超過(guò)此范圍的偏差)。改變發(fā)酵罐的回壓(back pressure)和攪拌速度，以操控發(fā)酵罐中的氧氣傳輸速率，并由此控制細(xì)胞呼吸速率。
在將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基從搖瓶接種到發(fā)酵罐中之后，采用基于計(jì)算機(jī)的算法向發(fā)酵罐中加入濃縮的葡萄糖溶液，使培養(yǎng)物在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)到高細(xì)胞密度。為了控制pH值，還向發(fā)酵罐中加入氫氧化銨(58％的溶液)和硫酸(24％的溶液)。一些情況下還要添加消泡劑以控制發(fā)泡。當(dāng)培養(yǎng)液達(dá)到大約40OD550時(shí)，再向發(fā)酵罐中加入100mL 1M硫酸鎂。另外，當(dāng)培養(yǎng)液達(dá)到大約20OD550時(shí)，以2.5mL/min的速率向發(fā)酵罐中加入濃縮鹽(由大約10g硫酸銨、26g磷酸氫二鉀，13g二水合磷酸二氫鈉，2g二水合檸檬酸鈉和15g磷酸二氫鉀溶于1L水而組成)，一直持續(xù)直到向發(fā)酵系統(tǒng)中加入大約1250mL為止。發(fā)酵通常持續(xù)72-80小時(shí)。
在發(fā)酵過(guò)程中，一旦發(fā)酵液中溶氧達(dá)到設(shè)定值，就根據(jù)溶氧探頭的信號(hào)向其中添加濃縮的葡萄糖溶液以將溶液濃度控制在設(shè)定值。因此，在這個(gè)控制方案中，操縱影響發(fā)酵中氧氣傳輸能力的發(fā)酵罐操作參數(shù)，如攪拌轉(zhuǎn)速或回壓等，可相應(yīng)地操縱細(xì)胞的攝氧率或者代謝速率。
用質(zhì)譜儀監(jiān)測(cè)發(fā)酵廢氣的組成，它能計(jì)算發(fā)酵過(guò)程中的攝氧率和二氧化碳釋放速率。
當(dāng)培養(yǎng)液的細(xì)胞密度達(dá)到大約220OD550時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速經(jīng)過(guò)約12小時(shí)從1000rpm的初始速率降為大約725rpm。當(dāng)培養(yǎng)液的細(xì)胞密度達(dá)到220OD550的大約12小時(shí)以后，加入50mL 200mM的異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)，用于誘導(dǎo)重鏈的合成。
2.制備抗組織因子F(ab’)2a.構(gòu)建質(zhì)粒用與上述雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pXCD18-7T3相似的方法，創(chuàng)建雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pxTF7T3，將其用于在不同時(shí)間分別表達(dá)抗組織因子輕鏈和重鏈。來(lái)自質(zhì)粒pMS421的lacI序列也被整合到pxTF7T3上，以創(chuàng)建新的雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pJVG3IL。
b.發(fā)酵這些發(fā)酵中采用的宿主菌株是大腸桿菌W3110的衍生菌株，定名為60H4。60H4的完整基因型為W3110ΔfhuAΔmanA phoAΔE15Δ(argF-lac)169deoC2degP41 ilvG2096(Valr)Δprc prc-suppressor。60H4宿主細(xì)胞用pJVG3IL轉(zhuǎn)化，篩選出成功的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
發(fā)酵在與上述抗-CD18F(ab’)2相類(lèi)似的條件下進(jìn)行，其中主要的區(qū)別是發(fā)酵時(shí)間在大約72小時(shí)到114小時(shí)內(nèi)變化，在培養(yǎng)液OD550達(dá)到220的大約4到12小時(shí)以后，用IPTG誘導(dǎo)重鏈。
3.產(chǎn)生全長(zhǎng)抗-TF抗體a.構(gòu)建質(zhì)粒質(zhì)粒pxTF-7T3FL的表達(dá)盒從5’到3’包括(1)phoA啟動(dòng)子(Kikuchi etal.，Nucleic Acid Res.，9(21)5671-5678(1981))；(2)trp Shine-Dalgarno序列(Yanofsky et al.，Nucleic Acids Res.，96647-6668(1981))；(3)STII信號(hào)序列的沉默密碼子變體(TIR相對(duì)強(qiáng)度約為7)(Simmons和Yansura，NatureBiotechnology，14629-634(1996))；(4)抗組織因子輕鏈的編碼序列；(5)λt0終止子(Scholtissek和Grosse，Nucleic Acids Res.，153185(1987))；(6)tacII啟動(dòng)子((DeBoer et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983))；(7)第二個(gè)trp Shine-Dalgarno；(8)STII信號(hào)序列的第二個(gè)沉默密碼子變體(TIR相對(duì)強(qiáng)度約為3)；(9)抗組織因子重鏈全長(zhǎng)的編碼序列；和(10)第二個(gè)λt0終止子。將該表達(dá)盒克隆到大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的框架中(Sutcliffe，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.，4377-90(1978))。
為此，質(zhì)粒pxTF-7T3FL的設(shè)計(jì)允許通過(guò)兩個(gè)不同的而不是兩個(gè)相同的啟動(dòng)子來(lái)從時(shí)間上間隔每條鏈的表達(dá)。在此質(zhì)粒中，輕鏈由phoA啟動(dòng)子控制，而重鏈的轉(zhuǎn)錄則由tacII啟動(dòng)子控制。如本領(lǐng)域已知的，phoA和tacII啟動(dòng)子是在完全不同的條件下被誘導(dǎo)的。圖4中描述了單啟動(dòng)子質(zhì)粒paTF130與pxTF-7T3FL的圖示比較。圖5中提供了pxTF-7T3FL表達(dá)盒的核酸序列(SEQ ID NO4)，而它編碼的多肽序列(SEQ ID NOS5和6)則分別由圖6A(輕鏈)和6B(重鏈)提供。用pxTF-7T3FL和pJJ247共轉(zhuǎn)化下述宿主細(xì)胞。pJJ247編碼tacII啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DsbA和DsbC兩者的表達(dá)，其中DsbA先表達(dá)。pJJ247的構(gòu)建在WO02/061090中描述。
b.發(fā)酵為了小規(guī)模的表達(dá)，應(yīng)用基因型為W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lacIq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41的大腸桿菌菌株61D6作為宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化之后，挑取選出的轉(zhuǎn)化體接種到添加50μg/L羧芐青霉素和50μg/L卡那霉素的5mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)輪(culture wheel)中30℃過(guò)夜生長(zhǎng)。應(yīng)用如WO02/061090所述的培養(yǎng)基進(jìn)行10L體積的發(fā)酵，基本的發(fā)酵條件也如WO02/061090所述，除去在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行下列的修改在約40小時(shí)的時(shí)候加入300mL 1M NaPO4，pH7.0，使?jié)舛燃s為30mM。在約44小時(shí)的時(shí)候加入100mL 200mM IPTG溶液，使?jié)舛燃s為2mM。接種的80小時(shí)后收獲發(fā)酵。
B.蛋白鑒定采用來(lái)自Novex的系統(tǒng)，在4-12％線(xiàn)性丙烯酰胺梯度條件下進(jìn)行單向SDS-PAGE凝膠電泳。具體地，應(yīng)用的系統(tǒng)為NOVEXNUPAGETM系統(tǒng)，由NUPAGETMBis-TRIS-Pre-Cast Gels(用于低到中分子量的蛋白)組成。
C.化學(xué)試劑沉淀劑是純度為98％、來(lái)自Sigma(St.Louis，MO，USA)的乳酸依沙吖啶，乳酸依沙吖啶的分子量為361.4Da，所有其它的化學(xué)品為分析級(jí)。
D.沉淀含有抗體和F(ab’)2的大腸桿菌物質(zhì)應(yīng)用Watts Fluidair Inc.的微流化器(microfluidizer)(型號(hào)B12-04DJC，Kittery，MN，USA)進(jìn)行勻漿。細(xì)胞在4bar的壓力下三次通過(guò)微流化器。為了避免蛋白的熱降解，所述物質(zhì)在每一次通過(guò)微流化器期間流經(jīng)冰水浴。F(ab’)2勻漿物的總蛋白濃度為30mg/mL。重懸糊狀物中得到的全長(zhǎng)抗-TF勻漿物的總蛋白濃度為18mg/mL?？筎F糊狀物在pH7.5的25mM TRIS-HCl緩沖液中重懸。
乳酸依沙吖啶沉淀劑溶于水，直到所需的終濃度(w/v)。
1.pH研究沉淀實(shí)驗(yàn)在恒定為0.6％(w/v)的乳酸依沙吖啶濃度進(jìn)行。制備一種0.8％的乳酸依沙吖啶溶液，并與大腸桿菌勻漿物以3∶1的比例混合，舉例來(lái)說(shuō)，3mL的乳酸依沙吖啶與1mL大腸桿菌勻漿物混合。根據(jù)所需要的pH值，以HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值。
2.乳酸依沙吖啶濃度研究勻漿物以乳酸依沙吖啶原液稀釋4倍(即pH研究中的1∶3)，將pH值保持在每一種目標(biāo)蛋白的設(shè)定值。對(duì)于抗-CD18，pH值為8.5，而對(duì)于抗-TF，pH值為7.5。在沉淀系統(tǒng)中乳酸依沙吖啶終濃度分別為0.15％、0.30％、0.45％、0.60％、0.75％和0.9％(w/v)。進(jìn)行一組加入0％乳酸依沙吖啶的實(shí)驗(yàn)作為參照。
3.電導(dǎo)率/稀釋研究將各種濃度的NaCl加入到抗-CD18勻漿物中，以評(píng)估電導(dǎo)率對(duì)于蛋白沉淀的影響。研究的NaCl濃度為0、50、100、150、200和400mM。無(wú)乳酸依沙吖啶的參照系列也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確定是否有蛋白由于鹽濃度高而形成沉淀。在這個(gè)鹽濃度峰的研究中pH為8.5，且抗-CD18勻漿物被稀釋4倍。樣品中的乳酸依沙吖啶濃度為0.6％，0％濃度的則用于參照實(shí)驗(yàn)。
為了改變樣品的電導(dǎo)率，勻漿物以漸增量進(jìn)行稀釋?zhuān)琾H保持不變，對(duì)于抗-CD18和抗-TF，pH值分別為8.5和7.5。所有實(shí)驗(yàn)中乳酸依沙吖啶終濃度為0.6％(w/v)。勻漿物分別被稀釋2、3、4、5、6和7倍。
4.溫度研究一些實(shí)驗(yàn)在升高的溫度下進(jìn)行。將大腸桿菌勻漿物稀釋4倍，乳酸依沙吖啶的終濃度為0.6％。對(duì)于抗-CD18和抗-TF，pH值分別為8.5和7.5。樣品在處于所需溫度的恒溫水浴中溫育，即50、60和70℃。樣品在升高的溫度溫育20-120分鐘。一個(gè)16小時(shí)的長(zhǎng)時(shí)間溫育在50℃進(jìn)行。
在將沉淀劑和大腸桿菌勻漿物混合在一起并調(diào)節(jié)pH值后，樣品在振蕩條件下溫育30-60分鐘。沉淀實(shí)驗(yàn)在4mL標(biāo)度的玻璃管中進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)平行雙份并得出平均值。
E.大腸桿菌蛋白實(shí)驗(yàn)乳酸依沙吖啶與大多數(shù)常用的蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，例如Bradford、BCA、280nm分光光度吸收檢測(cè)等發(fā)生相互作用。因此，采取通用的大腸桿菌蛋白ELISA方法檢測(cè)總蛋白濃度。樣品在含有魚(yú)明膠(fish gelatin)的緩沖液(0.15M NaCl、0.1M NaPO4、0.1％魚(yú)明膠、0.05％TWEEN 20TM、0.05％PROCLINTM300)中稀釋?zhuān)越档团c抗大腸桿菌蛋白抗體的非特異性結(jié)合。包被抗體為山羊抗-Whole ECP，偶聯(lián)抗體為與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗-抗體Whole ECP。應(yīng)用Molecular Devices的SPECTRA MAX PLUSTM平板閱讀器(plate reader)(Sunnyvale，CA，USA)監(jiān)測(cè)405nm處的吸收。
F.蛋白G實(shí)驗(yàn)為了檢測(cè)回收的F(ab’)2和抗體的濃度，應(yīng)用了蛋白G親和層析實(shí)驗(yàn)。IMMUNO DETECTIONTM蛋白G柱購(gòu)自PerSeptive Biosystems(Framingham，MA，USA)。該柱以磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行平衡，并以PBS進(jìn)行洗脫，該P(yáng)BS已用HCl將pH調(diào)節(jié)到2.2。為了將乳酸依沙吖啶的干擾減到最低，樣品在實(shí)驗(yàn)前在排阻旋轉(zhuǎn)柱(BIO-SPIN6Tris columns(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA))中處理。旋轉(zhuǎn)柱按說(shuō)明書(shū)使用。將氯化四甲銨(TMAC)洗滌步驟(Fahrner et al.，Biotechnology和Genetic Engineering Reviews，18302-327(2001))引入層析方法，以減小樣品中殘留的乳酸依沙吖啶的任何干擾。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用購(gòu)自Hewlett Packard(Mountain View，CA，USA)的HPLC(HP1090TM液相色譜儀)進(jìn)行。樣品以PBS稀釋。應(yīng)用純化的蛋白(來(lái)自Genentech，Inc.)繪制每一種蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
G.DNA測(cè)定沉淀后上清中的DNA濃度應(yīng)用購(gòu)自Molecular Probes(Eugene，OR，USA)的Pico Green試劑盒進(jìn)行測(cè)定。這是一個(gè)熒光實(shí)驗(yàn)，其中熒光試劑(Pico green)與雙鏈DNA結(jié)合。Pico Green試劑在502nm激發(fā)，記錄在523nm的發(fā)射。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用購(gòu)自Molecular Devices(Sunnyvale，CA，USA)的熒光平板閱讀器SPECTRA MAX GENINI XSTM進(jìn)行。乳酸依沙吖啶與Pico Green實(shí)驗(yàn)發(fā)生相互作用，故在分析之前，沉淀劑要從溶液中除去。應(yīng)用在G蛋白親和層析實(shí)驗(yàn)部分所述的BIO-SPIN6TRIS柱，除去樣品中乳酸依沙吖啶。
H.SDS-PAGE乳酸依沙吖啶沉淀后得到的上清液可以通過(guò)SDS-PAGE來(lái)進(jìn)行分析。用購(gòu)自Novex(San Diego，CA，USA)的非還原性4-12％NUPAGETM凝膠觀(guān)察抗-CD18和抗-TF的純化和回收。應(yīng)用預(yù)制凝膠，電泳緩沖液為MOPS(預(yù)先配置的濃縮劑，購(gòu)自Novex)。凝膠以COOMASSIE BRILLANT BLUER250TM經(jīng)過(guò)過(guò)濾的溶液進(jìn)行染色。對(duì)于每種澄清的大腸桿菌提取物來(lái)說(shuō)，上清液是經(jīng)體積補(bǔ)償?shù)?。這樣一來(lái)，如果能在經(jīng)乳酸依沙吖啶沉淀后的上清液中得到100％的收率，大腸桿菌提取物中蛋白條帶的強(qiáng)度應(yīng)與樣品中是一樣的。因而，凝膠可以用于準(zhǔn)確地指示沉淀后得到的純化程度。
I.乳酸依沙吖啶溶解度研究了0.6％和1.2％兩種乳酸依沙吖啶溶液。每種溶液分兩等份，pH分別調(diào)為6.0和9.0。為了在該系統(tǒng)中獲得微弱的緩沖容量，將乳酸依沙吖啶溶于10mM Tris-HCl緩沖液。使每一種乳酸依沙吖啶溶液暴露于遞增量的NaCl即0、50、100、150、200、300和600mM。樣品溫育3小時(shí)，然后在微量離心機(jī)(SORVALL MC12VTM，DuPont，Wilmington，DE，USA)中12000g離心20分鐘。通過(guò)測(cè)定270nm處的吸收值，檢測(cè)上清液中的乳酸依沙吖啶。應(yīng)用的分光光度計(jì)為Hewlett Packard(Wilmington，DE)的HP8453UV-VISTM，現(xiàn)在它改稱(chēng)為A1igent Technologies(Palo Alto，CA)的AGILENT8453UV-VISTM分光光度計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可由已知乳酸依沙吖啶濃度的溶液得到。
J.濁度為了測(cè)定上清的穩(wěn)定性與時(shí)間和溫度的函數(shù)關(guān)系，對(duì)濁度進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。應(yīng)用的濁度計(jì)來(lái)自HACH(型號(hào)2100N，Ames，Iowa，USA)，樣品在不稀釋的條件下在室溫進(jìn)行測(cè)定。
用0.6％的乳酸依沙吖啶、0.2％PEI或者只用水處理抗-CD18勻漿物，在所有的三種樣品中，抗-CD18勻漿物被稀釋4倍，pH為7.2±0.2。在4000g離心1小時(shí)后，回收上清液，分成兩等份。每種樣品取一份在室溫(21℃)溫育，另一份則放置在4℃。
結(jié)果和討論pH的影響乳酸依沙吖啶分子在大多數(shù)的pH區(qū)間是帶有正電荷的(Miller，出處同上；Neurath和Brunner，出處同上；Franek，Methods in Enzymology，ed.Langone，J.J.，Van Vunakis，H.，121631-638(1986))。然而，由于pH的變化影響多肽的電荷，而且多肽的pI與多肽暴露于乳酸依沙吖啶而沉淀時(shí)的pH值相關(guān)(Neurath和Brunner，出處同上)，所以，研究了本發(fā)明方法中pH值對(duì)純化程度的影響。
將分別含有抗-CD18F(ab’)2、抗-TF F(ab’)2和全長(zhǎng)抗-TF的勻漿物暴露于0.6％且pH覆蓋4-10的乳酸依沙吖啶溶液。圖8A-8C中分別表示出經(jīng)乳酸依沙吖啶處理及離心后每種蛋白質(zhì)的澄清相。
在表1中，研究了抗-TF的全長(zhǎng)抗體和F(ab’)2。大腸桿菌勻漿物用0.8％(w/v)的乳酸依沙吖啶溶液以1∶3的比例處理，即樣品中乳酸依沙吖啶終濃度為0.6％。pH值分別以HCl和NaOH調(diào)節(jié)到所需的pH值?？梢愿鶕?jù)每種澄清的細(xì)胞勻漿物計(jì)算產(chǎn)率和純化系數(shù)?；厥盏纳锨逯械腄NA濃度也在表中報(bào)道出來(lái)。
表1以乳酸依沙吖啶處理時(shí)，pH對(duì)于αCD18和αTF的純化和產(chǎn)率的影響

*值為1表示與未經(jīng)乳酸依沙吖啶處理的系統(tǒng)得到的純化效果相同。
可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于所有的三種蛋白，在pH4-10的范圍內(nèi)，純化程度和DNA濃度可以得到鐘形曲線(xiàn)。在中等水平pH值范圍，即pH5-9，可以得到大約5倍的純化。在較高的pH，抗-CD18F(ab’)2、抗-TF抗體的全長(zhǎng)和F(ab’)2形式的收率降低，且抗-TF抗體的全長(zhǎng)和F(ab’)2形式比抗-CD18F(ab’)2具有更強(qiáng)的pH依賴(lài)性。在pH4-10的范圍，抗-CD18F(ab’)2的產(chǎn)率從100％下降到85％；而抗-TF F(ab’)2的產(chǎn)率則從93％下降到18％。不限于任何一種理論，這可部分歸因于抗-TF比抗-CD18具有更低的pI，如它們的pI分別為7.5和8.9，然而，這些數(shù)值是理論計(jì)算得到的pI數(shù)值。
抗-TF蛋白的全長(zhǎng)形式比該蛋白的F(ab’)2形式有更強(qiáng)的pH依賴(lài)性。全長(zhǎng)抗-TF蛋白的純度在pH7時(shí)最高。在pH8以上，可以觀(guān)察到明顯的產(chǎn)率損失(圖8C)。對(duì)于抗TF全長(zhǎng)，pH7.0左右是優(yōu)選的，可得到7.1倍的純化和86％的產(chǎn)率。不限于任何一種理論，對(duì)于抗-TF比抗-CD18具有更大損失的一個(gè)可能的解釋是，抗-TF在高于其pI的條件中溫育時(shí)，比抗-CD18帶有更多的表面負(fù)電荷。與此類(lèi)似，不限于任何一種理論，更大的全長(zhǎng)抗-TF可以比相應(yīng)的F(ab’)2具有更多的表面負(fù)電荷，這樣在pH值增加時(shí)，可以觀(guān)察到顯著較大的產(chǎn)率損失。
然而，除了細(xì)胞碎片和宿主蛋白之外的組分必須從目標(biāo)多肽中去除。這些組分之一就是DNA。目標(biāo)多肽中混有高DNA濃度的主要不利之處是溶液的粘度增加。這會(huì)給將來(lái)的下游操作帶來(lái)不利影響。另外，如果應(yīng)用陰離子交換柱作為第一個(gè)捕獲柱，帶負(fù)電荷的DNA會(huì)結(jié)合到樹(shù)脂上，這樣會(huì)降低柱子的蛋白容量。
由此，測(cè)定了以乳酸依沙吖啶沉淀后上清液中的DNA濃度。結(jié)果表明，乳酸依沙吖啶沉淀后上清液中的DNA濃度與在大腸桿菌勻漿物中得到的初始DNA濃度相比有了顯著的降低。然而，當(dāng)上清液中的pH值降低時(shí)，其中的DNA濃度會(huì)增加，即pH5.0時(shí)為0.1μg/mL，而pH4.0時(shí)為0.2μg/mL。不限于任何一種理論，這可能是由于在低pH值，DNA上的磷酸根所帶的負(fù)電荷越來(lái)越少。在非常高的pH如pH10.0時(shí)，DNA濃度會(huì)顯著地提高(0.3μg/mL)，而蛋白純度也會(huì)降低。不限于任何一種理論，這可部分歸因于pH高于抗體和F(ab’)2的pI值的事實(shí)，然而這也可部分歸因于在此pH乳酸依沙吖啶帶電荷較少的事實(shí)。
乳酸依沙吖啶濃度的影響大腸桿菌勻漿物與乳酸依沙吖啶溶液以1∶3的比例混合，樣品中的乳酸依沙吖啶濃度從0以0.15％的增量提高到0.9％(w/v)。在pH8.5、7.5和6.0，分別對(duì)抗-CD18、抗-TF F(ab’)2和全長(zhǎng)抗體進(jìn)行研究。
表2表明乳酸依沙吖啶濃度對(duì)于純化和產(chǎn)率的影響。在表2中，研究了抗-TF全長(zhǎng)抗體和F(ab’)2形式。大腸桿菌勻漿物以1∶3的比例用不同濃度的乳酸依沙吖啶溶液處理，報(bào)道了樣品中乳酸依沙吖啶的終濃度?？?CD18、抗-TF(F(ab’)2)以及全長(zhǎng)抗-TF的pH值分別為8.5、7.5和6.0?；厥盏纳锨逡褐械腄NA濃度也在表中報(bào)道出來(lái)。
表2遞增濃度的乳酸依沙吖啶處理對(duì)于抗-CD18和抗-TF純度和產(chǎn)率的影響

*值為1表示與未經(jīng)乳酸依沙吖啶處理的系統(tǒng)得到的純化效果相同。
研究顯示，抗體純度與乳酸依沙吖啶的濃度具有很強(qiáng)的相關(guān)性(圖9A-9C和表2)。當(dāng)乳酸依沙吖啶濃度高于約0.6％時(shí)，乳酸依沙吖啶濃度增加對(duì)于提高純度的效果不顯著。然而，在較低的乳酸依沙吖啶濃度，即當(dāng)乳酸依沙吖啶不足量時(shí)，沉淀劑的每次微量加入都會(huì)導(dǎo)致F(ab’)2的純化大大增強(qiáng)。
加入不同濃度乳酸依沙吖啶不會(huì)影響抗-CD18F(ab’)2的產(chǎn)率。所有實(shí)驗(yàn)中，兩種F(ab’)2的該步驟回收率大約為90％。然而，看起來(lái)F(ab’)2抗-CD18比抗-TF F(ab’)2更易獲得定量的回收。不限于任何一種理論，這可以是因?yàn)閜H研究中，抗-TF F(ab’)2比抗-CD18F(ab’)2具有更多的表面負(fù)電荷。全長(zhǎng)抗-TF在比相應(yīng)的F(ab’)2蛋白更低的乳酸依沙吖啶濃度(分別為0.3％和0.6％)達(dá)到最大純化。不限于任何一種理論，這可能是由于全長(zhǎng)抗-TF勻漿物中的總蛋白濃度較低，即，全長(zhǎng)抗-TF勻漿物中的總蛋白濃度為18mg/mL，而F(ab’)2抗-TF則為30mg/mL。全長(zhǎng)抗-TF也可從重懸糊狀物中得到，而F(ab’)2可直接從發(fā)酵罐中以發(fā)酵液的形式取出。因此，大腸桿菌培養(yǎng)液中的可溶性培養(yǎng)基組分在全長(zhǎng)抗-TF的重懸液中不存在，這可在一定程度上解釋所看到的差距，其不受任何一種理論限制。
上清液中的DNA濃度與蛋白純化獲得的數(shù)據(jù)具有強(qiáng)相關(guān)性。在加入0.6％或更高濃度的乳酸依沙吖啶時(shí)，沒(méi)有在上清液中檢測(cè)到DNA。當(dāng)乳酸依沙吖啶濃度從0上升到0.6％時(shí)，上清液中的DNA濃度明顯降低，即從78μg/mL減為0。
電導(dǎo)率的影響乳酸依沙吖啶使蛋白沉淀，這可部分歸因于該分子的電荷性質(zhì)(Neurath和Brunner，出處同上)，樣品的電導(dǎo)率對(duì)于沉淀后抗體和F(ab’)2的純度可以有影響。因此，如果樣品具有高的鹽濃度，即具有高電導(dǎo)率，鹽可使蛋白被屏蔽，與乳酸依沙吖啶隔開(kāi)，從而降低純化效果。
對(duì)于抗-CD18勻漿物進(jìn)行兩套實(shí)驗(yàn)，以區(qū)分樣品的蛋白濃度與電導(dǎo)率的影響。在兩套實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中加入NaCl(0-400mM)，一套實(shí)驗(yàn)中含有0.6％的乳酸依沙吖啶，而另一套實(shí)驗(yàn)中使用水。用含水的系統(tǒng)作參照，這樣，如果NaCl能引起沉淀，這就可以與由乳酸依沙吖啶引起的沉淀進(jìn)行區(qū)分。在不含乳酸依沙吖啶的系統(tǒng)，即水系統(tǒng)中，在0-400mM NaCl的濃度范圍內(nèi)，沒(méi)有觀(guān)察到蛋白沉淀(圖10A)。含有乳酸依沙吖啶的實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)電導(dǎo)率下降時(shí)，抗-CD18的純化顯著增強(qiáng)(圖10B)。
不限于任何一種理論，抗-CD18在較低電導(dǎo)率改善純化效果的一個(gè)原因可以是，帶電荷的乳酸依沙吖啶在低鹽濃度的屏蔽能力低。當(dāng)在升高的鹽濃度用PEI純化蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的屏蔽效果(Jendrisak，出處同上)。然而，更重要的因素是，乳酸依沙吖啶在較高鹽濃度的低溶解度(Miller，出處同上；Neurath and Brunner，出處同上；Franek，出處同上)。在提取系統(tǒng)中，當(dāng)NaCl為100mM時(shí)，觀(guān)察到乳酸依沙吖啶沉淀，當(dāng)鹽濃度升高以后，更多乳酸依沙吖啶被沉淀。因此，更少量的乳酸依沙吖啶溶于該系統(tǒng)中且能用于沉淀蛋白和其它生物分子。
研究乳酸依沙吖啶的溶解度與NaCl濃度的函數(shù)關(guān)系時(shí)，觀(guān)察到pH依賴(lài)性(圖11)。在pH6時(shí)，0.6％和1.2％的乳酸依沙吖啶溶液的溶解度沒(méi)有明顯的差別。在50mM NaCl時(shí)，兩種溶液都可溶；而在100mM NaC時(shí)，兩種溶液幾乎徹底沉淀。在pH9的溶液中，當(dāng)乳酸依沙吖啶所帶電荷較少時(shí)，上述兩種濃度的乳酸依沙吖啶的溶解度有明顯差別。0.6％乳酸依沙吖啶溶液比更高濃度的乳酸依沙吖啶溶液在更低鹽濃度中沉淀(圖11)。已經(jīng)表明，氯化物對(duì)于沉淀乳酸依沙吖啶特別有效(Franek，出處同上)。
實(shí)際上，沉淀實(shí)驗(yàn)的電導(dǎo)率可通過(guò)稀釋系數(shù)確定。因此，用一組實(shí)驗(yàn)研究大腸桿菌勻漿物的稀釋系數(shù)的影響。乳酸依沙吖啶總濃度保持0.6％(w/v)不變，但樣品的電導(dǎo)率隨稀釋的增加而減小。結(jié)果如表3所示。在表3中，研究了抗-TF全長(zhǎng)抗體和F(ab’)2形式。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中乳酸依沙吖啶的濃度為0.6％(w/v)?？?CD18、抗-TF F(ab’)2，和全長(zhǎng)抗-TF的pH值分別為8.5、7.5、6.0。計(jì)算每種澄清的細(xì)胞勻漿物的產(chǎn)率和純化系數(shù)?；厥盏纳锨逡褐械腄NA濃度也在表中報(bào)道出來(lái)。
表3大腸桿菌勻漿物不同量稀釋對(duì)于抗-CD18和抗-TF的純度和產(chǎn)率的影響

*值為1表示與未經(jīng)乳酸依沙吖啶處理的系統(tǒng)得到的純化效果相同。
結(jié)果表明，如果通過(guò)增加稀釋降低電導(dǎo)率，F(xiàn)(ab’)2的純化效果可得到增強(qiáng)。然而，在電導(dǎo)率為3.5mS或更低時(shí)，電導(dǎo)率的影響較小。對(duì)于本實(shí)施例中應(yīng)用的大腸桿菌勻漿物，為了得到低于3.5mS的電導(dǎo)率，必須進(jìn)行4倍的稀釋。對(duì)于全長(zhǎng)抗-TF抗體，稀釋倍數(shù)可比F(ab’)2勻漿物的稍低。不限于任何一種理論，這可以是由于全長(zhǎng)勻漿物中的蛋白濃度較低。而且，由于全長(zhǎng)物質(zhì)來(lái)自重懸糊狀物，一些可能會(huì)影響沉淀的培養(yǎng)基組分已在乳酸依沙吖啶沉淀之前去除。
在這些實(shí)驗(yàn)中，蛋白濃度隨稀釋的增加(電導(dǎo)率的降低)而降低。這樣，即使加入在乳酸依沙吖啶研究中被認(rèn)為是過(guò)量濃度的0.6％乳酸依沙吖啶，仍然不能在低水平稀釋的樣品中最大量去除宿主蛋白和DNA。這是因?yàn)檫@些樣品與在乳酸依沙吖啶濃度研究中操作的樣品相比，勻漿物濃度(即總蛋白和DNA)有所增加。因此，蛋白、DNA以及其它組分的總濃度會(huì)影響所需的乳酸依沙吖啶的濃度或稀釋倍數(shù)?？?CD18F(ab’)2和全長(zhǎng)形式及F(ab’)2形式的抗-TF的產(chǎn)率隨電導(dǎo)率的下降而提高。
對(duì)DNA去除的效果也依賴(lài)于電導(dǎo)率。進(jìn)行兩倍稀釋?zhuān)?.0mS時(shí)，在上清液中得到20.7μg/mL的高DNA濃度。然而，如果進(jìn)行3倍的稀釋?zhuān)?.0mS，濃度就會(huì)降到0.5μg/mL，在更高的稀釋倍數(shù)檢測(cè)不到DNA。正如較早前指出的，在此情況下，用于沉淀蛋白和DNA的乳酸依沙吖啶總量隨稀釋倍數(shù)的升高(即電導(dǎo)率的降低)而增加。這樣，在此實(shí)施例中所見(jiàn)到的效果包括降低電導(dǎo)率和增加乳酸依沙吖啶用量?jī)烧摺?br> 溫度的影響在進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)時(shí)，已知溫度是個(gè)重要的因素。因而研究一些增高的溫度與乳酸依沙吖啶的聯(lián)合。還研究了在增高的溫度對(duì)溫育時(shí)間的影響。
當(dāng)在增高的溫度(即50-70℃)溫育時(shí)，對(duì)于兩種F(ab’)2蛋白的純度有好的影響(圖12A和12B)。溫度越高，純化效果越好。在70℃溫育可以顯著地增強(qiáng)F(ab’)2蛋白的純度。在70℃將樣品溫育更長(zhǎng)時(shí)間，即溫育40分鐘相比于溫育20分鐘，并沒(méi)有提高F(ab’)2的純度(圖12A和12B)，但觀(guān)察到大約10％的產(chǎn)率損失。然而，當(dāng)樣品在超過(guò)70℃進(jìn)行溫育，卻沒(méi)有回收到F(ab’)2，這是由于F(ab’)2以及其它大腸桿菌蛋白的溫度沉淀。
為了更精確研究溫育時(shí)間的影響，進(jìn)行了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中，樣品在50℃溫育16小時(shí)和30分鐘，結(jié)果表明，在此溫度溫育16小時(shí)的樣品與溫育30分鐘的相比，純化效果沒(méi)有顯著的提高。這說(shuō)明溫度沉淀是一種快速現(xiàn)象，它提示，快速加熱到適當(dāng)?shù)臏囟缺乳L(zhǎng)時(shí)間的溫育更適合。
全長(zhǎng)抗TF也在增高的溫度中進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在50℃溫育15分鐘與在室溫溫育相比，對(duì)于抗體的純度略有積極影響，且回收的物質(zhì)未發(fā)現(xiàn)損失(圖12C)。然而，如果溫度提高到60℃，幾乎全部的抗-TF都被沉淀。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，全長(zhǎng)抗-TF在增高的溫度比F(ab’)2抗-TF蛋白具有較低的穩(wěn)定性。
由于溫度提高會(huì)引起目標(biāo)多肽的修飾，具體目標(biāo)多肽在增高的溫度的穩(wěn)定性需要在實(shí)施前進(jìn)行評(píng)估。
原料流(feed stream)的穩(wěn)定性重要的是，盡可能回收最清潔的原料流，然而原料流另一個(gè)重要的性質(zhì)是它在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。因此，經(jīng)乳酸依沙吖啶或PEI處理后上清液的穩(wěn)定性與簡(jiǎn)單離心后上清液的穩(wěn)定性進(jìn)行了比較。每種上清液在兩種溫度，即室溫(21℃)和4℃溫育。穩(wěn)定性通過(guò)測(cè)定各自樣品的濁度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
圖13顯示三種不同上清液在一段時(shí)間內(nèi)的濁度改變，這三種上清液分別為經(jīng)乳酸依沙吖啶處理、經(jīng)PEI處理和不經(jīng)處理的澄清上清液。可以清楚地看到，聚電解質(zhì)，即乳酸依沙吖啶和PEI，它們顯著地降低上清液的濁度。在剛剛澄清之后，不經(jīng)處理的澄清上清液的濁度為大約700NTU，而PEI處理的樣品只有一半的濁度，即327NTU，而經(jīng)乳酸依沙吖啶處理的上清，其濁度為1NTU。當(dāng)監(jiān)測(cè)經(jīng)PEI處理的上清液的濁度時(shí)，無(wú)論是時(shí)間變化還是在不同溫育溫度都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)大的差異。對(duì)于僅僅經(jīng)過(guò)離心的上清液來(lái)說(shuō)，在開(kāi)始的48小時(shí)，室溫中的樣品濁度有降低的趨勢(shì)。然而，室溫中的樣品在72小時(shí)由于樣品濁度過(guò)高而無(wú)法檢測(cè)。乳酸依沙吖啶處理的上清液具有非常低的濁度，該濁度在4℃溫育后并未顯著提高。當(dāng)樣品在21℃溫育時(shí)，濁度明顯地增加，即在72小時(shí)內(nèi)從1增加到100NTU。然而，100NTU仍然比另外兩種剛剛澄清后的上清液中得到的濁度低。因此，可以得出這樣的結(jié)論，用乳酸依沙吖啶在pH7處理后回收的上清液是穩(wěn)定的原料流。
結(jié)論乳酸依沙吖啶可以成功地用作沉淀劑，用于從培養(yǎng)液或勻漿物中初步回收異源多肽。當(dāng)應(yīng)用乳酸依沙吖啶作沉淀劑時(shí)，理想的目標(biāo)多肽優(yōu)選比普通的宿主蛋白具有較高pI，因此，大多數(shù)蛋白帶有負(fù)電荷且被乳酸依沙吖啶沉淀，同時(shí)，目標(biāo)蛋白帶有正電荷，因此回收在上清液中。
用于沉淀的乳酸依沙吖啶的優(yōu)選濃度高度依賴(lài)于培養(yǎng)基或勻漿物中宿主蛋白和DNA的濃度。培養(yǎng)基或勻漿物中蛋白和DNA的濃度越高，乳酸依沙吖啶的需要量越大。因此，能與乳酸依沙吖啶復(fù)合并由此沉淀的組分所帶負(fù)電荷越多，用于沉淀的乳酸依沙吖啶的優(yōu)選量越大。進(jìn)行沉淀時(shí)，溶液的電導(dǎo)率越低，多肽的純化效率越高。沉淀步驟可以在除去細(xì)胞碎片的同時(shí)，提供明顯的多肽純化效果和DNA去除效果。
為了有效沉淀宿主蛋白和DNA，pH值通常在大約4-10之間，優(yōu)選不超過(guò)約pH9，因?yàn)樵诖藀H以上，分子所帶電荷變少。在純化多肽時(shí)，乳酸依沙吖啶應(yīng)更優(yōu)選在大約pH5-9的范圍內(nèi)應(yīng)用。為了增強(qiáng)純化的效果，可在增高的溫度進(jìn)行短時(shí)間的溫育。然而，應(yīng)測(cè)定具體目標(biāo)多肽在增高的溫度中的穩(wěn)定性，以避免目標(biāo)多肽沉淀。也必須對(duì)回收的目標(biāo)多肽的質(zhì)量進(jìn)行研究，以證實(shí)目標(biāo)多肽沒(méi)有發(fā)生改變。
權(quán)利要求
1.從產(chǎn)生并溶有目標(biāo)異源多肽的微生物發(fā)酵液或勻漿物中純化該多肽的方法，包括在使多肽的主要部分保持可溶的條件下，向培養(yǎng)液或勻漿物中加入有效量的乳酸依沙吖啶溶液，以沉淀宿主細(xì)胞雜質(zhì)，并從培養(yǎng)液或勻漿物中分離目標(biāo)多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)液或勻漿物來(lái)自酵母或原核生物。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中培養(yǎng)液或勻漿物來(lái)自細(xì)菌。
4.權(quán)利要求1-3之一的方法，其中培養(yǎng)液或勻漿物來(lái)自真細(xì)菌。
5.權(quán)利要求1-4之一的方法，其中培養(yǎng)液或勻漿物來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌。
6.權(quán)利要求1-5之一的方法，其中培養(yǎng)液或勻漿物來(lái)自大腸桿菌。
7.權(quán)利要求1-6之一的方法，其中多肽從勻漿物中分離。
8.權(quán)利要求1-7之一的方法，其中多肽的pI比宿主細(xì)胞雜質(zhì)中所含宿主蛋白的平均pI更高。
9.權(quán)利要求1-8之一的方法，其中多肽的pI至少約為7。
10.權(quán)利要求1-9之一的方法，其中多肽是重組多肽。
11.權(quán)利要求1-10之一的方法，其中多肽是抗體。
12.權(quán)利要求1-11之一的方法，其中多肽是人源化抗體。
13.權(quán)利要求1-12之一的方法，其中多肽是全長(zhǎng)抗體。
14.權(quán)利要求1-12之一的方法，其中多肽是抗體片段。
15.權(quán)利要求14的方法，其中多肽是含有輕鏈的抗體片段。
16.權(quán)利要求15的方法，其中多肽是含有κ輕鏈的抗體片段。
17.權(quán)利要求14-16之一的方法，其中多肽是Fab、Fab’、F(ab’)2或F(ab’)2-亮氨酸拉鏈融合體。
18.權(quán)利要求14-17之一的方法，其中多肽是F(ab’)2。
19.權(quán)利要求1-11之一的方法，其中多肽是抗-IgE、抗-CD18、抗-VEGF、抗-組織因子、2C4、抗-Her-2、抗-CD20、抗-CD40或抗-CD11a抗體或抗體片段。
20.權(quán)利要求1-11之一或權(quán)利要求19的方法，其中多肽是抗-CD18F(ab’)2、抗-組織因子F(ab’)2、全長(zhǎng)抗-組織因子抗體或抗-VEGF抗體。
21.權(quán)利要求1-20之一的方法，其中乳酸依沙吖啶的濃度約為0.1-5％重量/體積。
22.權(quán)利要求1-21之一的方法，其中乳酸依沙吖啶的濃度約為0.4-5％重量/體積。
23.權(quán)利要求1-22之一的方法，其中乳酸依沙吖啶的濃度約為0.6-5％重量/體積。
24.權(quán)利要求1-23之一的方法，其中加入乳酸依沙吖啶后的培養(yǎng)液或勻漿物的電導(dǎo)率約為1-15mS。
25.權(quán)利要求1-24之一的方法，其中加入乳酸依沙吖啶后的培養(yǎng)液或勻漿物的pH值約為5-9。
26.權(quán)利要求1-25之一的方法，其中加入乳酸依沙吖啶后的培養(yǎng)液或勻漿物的pH值約為6-9。
27.權(quán)利要求1-26之一的方法，其中加入乳酸依沙吖啶后的培養(yǎng)液或勻漿物的溫度為大約室溫到70℃。
28.權(quán)利要求1-27之一的方法，其中加入乳酸依沙吖啶后的培養(yǎng)液或勻漿物的溫度為大約室溫到大約65℃，維持大約1-60分鐘。
29.權(quán)利要求1-28之一的方法，其中加入乳酸依沙吖啶后的培養(yǎng)液或勻漿物的溫度為大約50℃到65℃，維持大約1-60分鐘。
30.權(quán)利要求1-29之一的方法，其中分離通過(guò)離心或過(guò)濾進(jìn)行。
31.權(quán)利要求1-30之一的方法，其中多肽從培養(yǎng)液或勻漿物中分離后，進(jìn)一步通過(guò)層析或過(guò)濾進(jìn)行純化。
32.權(quán)利要求1-31之一的方法，其中在加入乳酸依沙吖啶之前，多肽產(chǎn)生在可溶級(jí)分中。
33.權(quán)利要求1-31之一的方法，其中在加入乳酸依沙吖啶之前，多肽是不可溶的，通過(guò)使其與增溶劑接觸而溶解。
34.微生物細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)液或勻漿物，包括乳酸依沙吖啶和相對(duì)于該細(xì)胞而言異源的多肽。
35.權(quán)利要求34的培養(yǎng)液或勻漿物，來(lái)自細(xì)菌細(xì)胞。
36.權(quán)利要求34或35的培養(yǎng)液或勻漿物，來(lái)自大腸桿菌。
37.權(quán)利要求34-36之一的培養(yǎng)液或勻漿物，其中多肽是重組多肽。
38.權(quán)利要求34-37之一的培養(yǎng)液或勻漿物，其中多肽是抗體或抗體片段。
39.權(quán)利要求34-38之一的培養(yǎng)液或勻漿物，其中多肽是F(ab’)2。
40.權(quán)利要求34-38之一的培養(yǎng)液或勻漿物，其中多肽是抗-IgE、抗-CD18、抗-VEGF、抗-組織因子、2C4、抗-Her-2、抗-CD20、抗-CD40或抗-CD11a抗體。
41.權(quán)利要求34-38之一的培養(yǎng)液或勻漿物，其中多肽是抗-CD18F(ab’)2、抗-組織因子F(ab’)2、全長(zhǎng)抗-組織因子抗體或抗-VEGF抗體。
42.權(quán)利要求34-41之一的培養(yǎng)液或勻漿物，其中乳酸依沙吖啶的濃度約為0.1-5％重量/體積。
43.權(quán)利要求34-42之一的培養(yǎng)液或勻漿物，其中多肽在培養(yǎng)液或勻漿物中是可溶的。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種從微生物發(fā)酵液或勻漿物中純化在其中生成并溶解的目標(biāo)異源多肽的方法。本方法包括了在培養(yǎng)液或勻漿物中加入一種有效量的乳酸6，9－二氨基－2－乙氧基吖啶(乳酸依沙吖啶)，在大部分多肽保持可溶性的條件下沉淀宿主細(xì)胞中的雜質(zhì)，并從培養(yǎng)液或勻漿中分離出目標(biāo)多肽。也公開(kāi)了含有乳酸依沙吖啶和多肽的培養(yǎng)液或勻漿物。
文檔編號(hào)C12N1/18GK1759186SQ200480006396
公開(kāi)日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月9日
發(fā)明者菲利普·M·萊斯特, 約瑟芬·珀森 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司