專利名稱：多肽的純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多 肽的純化。特別地，本發(fā)明涉及使用離子交換色譜的方法，通過該方法可以純化不同的Y羧基化形式的多肽。
背景技術(shù)：
Y-羧基谷氨酸(Gla)是與鈣結(jié)合的獨(dú)特的氨基酸。其是谷氨酸(Glu，glutamic acid)的修飾的形式，并且可以在體內(nèi)通過谷氨酸殘基的翻譯后修飾而產(chǎn)生。按照這種方式進(jìn)行谷氨酸的羧基化能夠?qū)崿F(xiàn)與鈣的結(jié)合并且允許蛋白例如前凝血?jiǎng)┖涂鼓齽┡c磷脂結(jié)合。這種酶介導(dǎo)的反應(yīng)被稱作Y-羧基化(伽馬羧基化)，其需要維生素K作為輔因子。一些成熟蛋白含有富含已經(jīng)通過這種方式被轉(zhuǎn)化為Y羧基谷氨酸的氨基酸的結(jié)構(gòu)域。其被稱作GLA結(jié)構(gòu)域。這種GLA結(jié)構(gòu)域通常負(fù)責(zé)鈣離子與蛋白的高親和性結(jié)合。此類GLA結(jié)構(gòu)域可以存在于多種不同的蛋白中。例如，凝血因子VII、IX和X以及凝血酶原都包含含有多個(gè)Gla氨基酸殘基的GLA結(jié)構(gòu)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以分離或純化不同種類的多肽，其中所述的不同種類的區(qū)別在于 Y羧基化的量，或它們所包含的Y羧基谷氨酸殘基的數(shù)目。本發(fā)明尤其解決了具有不同含量的Y羧基谷氨酸的多肽種類的色譜分離。因此，本發(fā)明提供了從包含具有不同含量的Y羧基谷氨酸的多肽種類的混合物的樣品中純化具有想要的含量的Y羧基谷氨酸的所述多肽的方法，所述方法包括以下步驟(a)將所述樣品裝載至陰離子交換色譜材料之上；(b)使用pH小于9. 0的包含至少一種選自乙酸銨、氯化銨和乙酸鈉的鹽的溶液來洗脫所述多肽；(c)選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中所述級(jí)分中的多肽具有想要的含量的Y羧
基谷氨酸。優(yōu)選方法包括以下步驟(a)以pH小于9. 0的緩沖液平衡陰離子交換材料；(b)將所述樣品裝載至所述陰離子交換材料之上；(c)任選地以pH小于9. 0的緩沖液洗滌所述陰離子交換材料；(d)使用pH小于9. 0的包含至少一種選自乙酸銨、氯化銨和乙酸鈉的鹽的溶液從陰離子交換材料洗脫所述多肽；和(e)選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中所述級(jí)分中的多肽具有想要的含量的Y羧
基谷氨酸。適合以這種方式純化的多肽包括因子IX、因子VII、因子Vila、因子X、凝血酶原、 蛋白-S、蛋白-C、蛋白Z、骨鈣蛋白、基質(zhì)(MatriX)-gla-蛋白、生長抑制特異性-6、富含脯氨酸的Gla-I、富含脯氨酸的Gla-2、富含脯氨酸的Gla_3和富含脯氨酸的Gla_4。在優(yōu)選方法中，所述多肽是因子IX、因子X、因子VII或因子Vila。當(dāng)所述多肽是因子IX時(shí)，該方法可以包括選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中相較于被純化的樣品中#1-11-Gla和/或#1-12-Gla形式的因子IX的比例，所述級(jí)分中 #1-11-Gla和/或#1-12-Gla形式的因子IX的比例有所增加。當(dāng)所述多肽是因子X或因子VII時(shí)，所述方法可以包括選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中相較于被純化的樣品中#1_10-Gla和/或#l-ll-Gla形式的因子X或因子VII的比例，所述級(jí)分中#1-10-Gla和/或#1-11-Gla形式的因子X或因子VII的比例有所增加。當(dāng)所述多肽是因子IX時(shí)，該方法可以包括選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中相較于被純化的樣品中#1_10-Gla形式的因子IX的比例，所述級(jí)分中#1-10-Gla形式的因子 IX的比例有所降低。當(dāng)所述多肽是因子X或因子VII時(shí)，所述方法可以包括選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中相較于被純化的樣品中#l-9_Gla形式的因子X或因子VII的比例，所述級(jí)分中 #l-9-Gla形式的因子X或因子VII的比例有所降低。在本發(fā)明的方法中，可以應(yīng)用下列一項(xiàng)或多項(xiàng)一洗脫緩沖液的pH可以是5. 0-8. 5 ；一乙酸銨、氯化銨或乙酸鈉可以以0. 1M-2. 0M、優(yōu)選約0. 6M的濃度存在于洗脫緩沖液中；一離子交換色譜可以使用pH為5. 0-8. 5的平衡緩沖液。本發(fā)明還延伸至通過如本文描述的方法獲得的多肽制劑，即其中一種或多種種類的多肽的量被改變的制劑，其中所述種類的區(qū)別在于Y羧基化的程度或它們包含的Y羧基谷氨酸殘基的數(shù)目。


圖IA顯示了人類因子IX的初級(jí)結(jié)構(gòu)，其中標(biāo)示出了亞結(jié)構(gòu)域。GLA結(jié)構(gòu)域位于氨基酸1-46，EGFl結(jié)構(gòu)域位于氨基酸47-83，EGF2結(jié)構(gòu)域位于氨基酸84-124，活化肽位于氨基酸146-180，蛋白酶結(jié)構(gòu)域位于氨基酸181-415。Gla結(jié)構(gòu)域中的潛在會(huì)經(jīng)歷、羧基化的 12個(gè)氨基酸被標(biāo)示為“ Y ”，其位置為氨基酸7、8、15、17、20、21、26、27、30、33、36和40。圖IB顯示了人類因子VII、因子IX和因子X多肽的氨基酸序列的一部分的比對(duì)。 這些比對(duì)來自這些多肽中的每一個(gè)的GLA結(jié)構(gòu)域，其中以*顯示了 Gla殘基的位置。圖2顯示了從如實(shí)施例2描述的rhFIX的樣品的陰離子交換色譜獲得的色譜圖。 圖3顯示了圖2的局部放大。圖4顯示了在實(shí)施例2的陰離子交換色譜分離之前和之后的Gla種類的分布的分析。之前=用作實(shí)施例2中的“加樣”的rhFIX的樣品中Gla種類的分布。該樣品已經(jīng)過免疫親和捕捉的純化，以產(chǎn)生純度大于95%的rhFIX的樣品。圖5顯示了從如實(shí)施例3描述的rhFIX的樣品的陰離子交換色譜獲得的色 譜圖。 圖6顯示了圖5的局部放大。圖7顯示了從如實(shí)施例4描述的FVII的樣品的陰離子交換色譜獲得的色譜圖。圖 8顯示了圖7的局部放大。圖9顯示了從如實(shí)施例5描述的rhFIX的樣品的陰離子交換色譜獲得的色譜圖。圖10顯示了圖9的局部放大。圖11顯示了從如實(shí)施例6描述的rhFIX的樣品的陰離子交換色譜獲得的色譜圖。 圖12顯示了圖11的局部放大。圖13顯示了從如實(shí)施例7描述的FX的樣品的陰離子交換色譜獲得的色譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明源于以下發(fā)現(xiàn)具有不同水平的Y羧基化的多肽種類可以具有不同水平的活性，并且可以使用離子交換色譜來純化或分離這樣的不同種類。通過增加樣品中活性更高的多肽種類的比例和/或通過降低活性較低或無活性的多肽種類的比例，結(jié)果可以產(chǎn)生具有增強(qiáng)的比活性的純化的制劑。“多肽”在本文中以其最寬的含義使用，其是指兩個(gè)或更多個(gè)亞單元氨基酸、氨基酸類似物或其它擬肽(P印tidomimetics)的化合物。因此，術(shù)語“多肽”包括短的肽序列并且也包括較長的多肽和蛋白。如本文使用的術(shù)語“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光學(xué)異構(gòu)體以及氨基酸類似物和擬肽?！俺墒斓摹钡鞍资且呀?jīng)經(jīng)歷翻譯后加工例如羧基化、糖基化或前肽區(qū)域(例如靶向序列)的切割的多肽。因此， 成熟蛋白形式的本發(fā)明的多肽可以已經(jīng)經(jīng)歷Y羧基化，并且在其翻譯的序列中可以具有一個(gè)或多個(gè)被轉(zhuǎn)化為Gla的Glu殘基。本文描述的方法可用于純化任意多肽，所述多肽是Y羧基化的或者可以是Y羧基化的。用于本發(fā)明的方法的多肽可以是包含一個(gè)或多個(gè)Y羧基谷氨酸殘基的多肽?？梢酝ㄟ^研究該多肽的氨基酸序列并確定是否存在Gla來鑒定此類多肽。多種包含γ羧基谷氨酸的多肽是已知的。多種血液凝塊和調(diào)節(jié)蛋白中包含Gla 殘基，所述蛋白包括凝血酶原、因子VII (包括因子Vila)、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。 這些蛋白可以在GLA結(jié)構(gòu)域中包含10-12個(gè)、羧基谷氨酸殘基，它們位于成熟蛋白的N-末端的前40個(gè)殘基內(nèi)。骨蛋白例如骨鈣蛋白和基質(zhì)Gla蛋白和其它的哺乳動(dòng)物維生素K依賴性蛋白，例如生長抑制特異性_6(Gas6)、蛋白Z、富含脯氨酸的Gla-I (PRGPl)、富含脯氨酸的Gla-2(PRGP2)、富含脯氨酸的Gla_3(PRGP3)和富含脯氨酸的Gla_4(PRGP4)也包含多個(gè)Gla殘基。發(fā)現(xiàn)在非哺乳動(dòng)物蛋白例如芋螺肽(conop印tide)芋螺抑制肽G和芋螺抑制肽T中也存在γ羧基谷氨酸殘基。任意這些多肽都可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行純化。 用于本發(fā)明的方法的多肽可以是這樣的多肽，即所述多肽可以經(jīng)過翻譯后修飾以包括一個(gè)或多個(gè)Y羧基谷氨酸殘基。例如，可以通過多肽中谷氨酸殘基的Y羧基化而產(chǎn)生此類殘基。因此，多肽的氨基酸序列可以包含一個(gè)或多個(gè)谷氨酸(Glu)殘基。可以通過這種方式進(jìn)行翻譯后修飾的多肽可以是天然存在的多肽。此類多肽可以源自任意合適的生物。例如，所述多肽可以是天然存在的哺乳動(dòng)物多肽，例如嚙齒類、靈長類、貓、狗、綿羊、牛、 豬或其它哺乳動(dòng)物多肽。優(yōu)選地，所述多肽是小鼠、大鼠或人類多肽。最優(yōu)選地，所述多肽是人類多肽。所述多肽可以源自非哺乳動(dòng)物物種。例如，一些芋螺毒素可以包含Y羧基谷氨酸(glutamate)。因此，所述多肽可以是天然存在的來自軟體動(dòng)物例如腹足動(dòng)物的多肽。 所述腹足動(dòng)物可以是蝸牛，例如芋螺(cone snail)。能以這種方式進(jìn)行翻譯后修飾的多肽可以是天然存在的多肽的變體，例如上文所討論的已知的Y羧基化的蛋白中的一種的變體，人工產(chǎn)生的多肽，例如合成的多肽或重組產(chǎn)生的突變體或變體蛋白。所述多肽可以是具有GLA結(jié)構(gòu)域的多肽。GLA結(jié)構(gòu)域是包含多個(gè)谷氨酸(Glu)殘基的翻譯后修飾以形成Y羧基谷氨酸(Gla)的蛋白結(jié)構(gòu)域。這些Gla殘基一般位于多肽的單一的區(qū)域或結(jié)構(gòu)域內(nèi)。這通常位于多肽或成熟蛋白的N-末端。例如，圖IA顯示了人類因子IX蛋白的初級(jí)結(jié)構(gòu)。該蛋白包括位于氨基酸1-46的 GLA結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域包括12個(gè)氨基酸殘基，它們可以從谷氨酸被修飾為Gla。這些氨基酸位于位置7、8、15、17、20、21、26、27、30、33、36和40。因此其能夠包含最多12個(gè)Gla殘基。因此，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行純化的多肽可以是因子IX。圖IB顯示了基于人類因子VII、IX 和X蛋白的Gla結(jié)構(gòu)域的比對(duì)。在每個(gè)序列中，可以從谷氨酸被修飾為Gla的氨基酸殘基的位置被標(biāo)記為*。因此，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行純化的多肽可以是因子VII或因子X。用于本發(fā)明的多肽可以包含來自已知的Y羧基化蛋白的GLA結(jié)構(gòu)域，例如來自因子IX、因子VI或因子X的GLA結(jié)構(gòu)域，或來自如上文討論的任意其它已知的γ羧基化蛋白例如來自另一種凝血因子的GLA結(jié)構(gòu)域。用于本發(fā)明的方法的多肽可以是包含或能夠包含一個(gè)或多個(gè)、羧基谷氨酸殘基的多肽。例如，所述多肽可以包含或能夠包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個(gè)Gla殘基。優(yōu)選地，所述多肽包含或能夠包含1個(gè)以上的Gla殘基，例如1個(gè)以上，2 個(gè)以上，5個(gè)以上或9個(gè)以上Gla殘基。所述多肽可以包含或能夠包含最多10個(gè)、最多12 個(gè)、最多15個(gè)或最多20個(gè)Gla殘基。如下文所討論，本發(fā)明的方法允許純化具有不同水平的Y羧基化的多肽的不同分子種類。此處所稱的數(shù)目是可以存在于該多肽中的Gla殘基的總數(shù)目。也就是說，如果該多肽是完全Y羧基化的，這些數(shù)目表示存在的Gla殘基的數(shù)目。例如，當(dāng)Y羧基化發(fā)生于GLA結(jié)構(gòu)域中時(shí)，這些數(shù)目是指該GLA結(jié)構(gòu)域中可能發(fā)生γ 羧基化的位點(diǎn)的總數(shù)目，例如翻譯的多肽中的Glu殘基的總數(shù)目，或可以通過酶例如Y _谷氨酰羧化酶產(chǎn)生的Gla殘基的最大數(shù)目。也可以存在相同多肽的其它種類，其中存在比該最大數(shù)目少的Y羧基谷氨酸殘基。因此，多肽可以在其翻譯的氨基酸序列的N-末端40個(gè)殘基中包含多個(gè)Glu殘基。 例如，表達(dá)的多肽的氨基酸序列可以在最接近多肽的N末端的40個(gè)氨基酸中或者在最接近成熟蛋白的N末端的40個(gè)氨基酸中包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個(gè)Glu殘基?？梢允褂妹竵韺?shí)現(xiàn)、羧基化。已知此類Y-谷氨酰羧化酶在體內(nèi)參與很多多肽的Y羧基化。Y-谷氨酰羧化酶是內(nèi)質(zhì)酶，其催化多種維生素K依賴性凝血因子的GLA結(jié)構(gòu)域中的Glu通過翻譯后修飾被轉(zhuǎn)化為Gla。因此可以通過測定它們是否被Y-谷氨酰羧化酶Y羧基化來鑒定用于本發(fā)明的多肽。相信Y -谷氨酰羧化酶通過待羧基化的谷氨酸殘基的氨基末端一側(cè)的序列模體而與其底物蛋白結(jié)合。然后該酶可以使該區(qū)域中的多個(gè)谷氨酸殘基(例如，GLA結(jié)構(gòu)域中的所有谷氨酸殘基)羧基化，然后釋放所述底物。因此，用于本發(fā)明的多肽可以包含被Y-谷氨酰羧化酶或其它能夠進(jìn)行Y羧基化的酶識(shí)別的模體或位點(diǎn)。這種識(shí)別位點(diǎn)可以位于多肽的N-末端區(qū)域，例如，最接近所翻譯的多肽的N末端或最接近將成為成熟蛋白的N末端的蛋白的18、19、20、21、22、23、24、25、30、35或40個(gè)氨基酸內(nèi)。這種識(shí)別位點(diǎn)可以 位于待羧基化的谷氨酸殘基的氨基末端一側(cè)。例如，在很多天然存在的Y羧基化蛋白中，Y-谷氨酰羧化酶識(shí)別前肽區(qū)域中的位點(diǎn)并與其結(jié)合。然后在翻譯后加工過程中從多肽的其余部分切除該區(qū)域。因此，成熟蛋白中可以不含Y-谷氨酰羧化酶識(shí)別位點(diǎn)。在 凝血酶原和因子IX中，參與識(shí)別Y-谷氨酰羧化酶的位點(diǎn)是由殘基-18、-17、-15、-15和-10確定的。類似的識(shí)別位點(diǎn)存在于其它Y羧基化蛋白中。位置-16處的苯丙氨酸和位置-10處的丙氨酸在羧基化酶底物的前肽中是高度保守的，如同脂肪族殘基，例如位置-17和-15處的異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸。位置-16處的亮氨酸、 纈氨酸或賴氨酸也可以支持羧基化。用于本發(fā)明的多肽可以包含來自已知的Y羧基化蛋白的Y羧基化識(shí)別位點(diǎn)，例如來自因子IX、因子X、因子VII的γ羧基化識(shí)別位點(diǎn)，或來自如上文討論的任意其它已知的Y羧基化蛋白的Y羧基化識(shí)別位點(diǎn)。例如，來自任意此類蛋白的前肽區(qū)(其包含Y羧基化識(shí)別位點(diǎn))可以存在于翻譯的多肽的N末端，以允許通過 Y“谷氨酰羧化酶進(jìn)行多肽的合適的翻譯后加工。能夠被Y羧基化的多肽優(yōu)選滿足以下標(biāo)準(zhǔn)之一或二者(1)該多肽包含Y羧基化識(shí)別位點(diǎn)；和(2)在Y羧基化識(shí)別位點(diǎn)的40個(gè)殘基內(nèi)存在谷氨酸殘基。相信Y-谷氨酰羧化酶在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中是有活性的。對(duì)于被該酶Y羧基化的多肽，多肽優(yōu)選穿過表達(dá)Y-谷氨酰羧化酶的細(xì)胞的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。因此，多肽可以包含允許將新合成的多肽運(yùn)輸通過糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列。能夠?qū)⒍嚯陌邢騼?nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列是熟知的。此類信號(hào)序列經(jīng)常存在于多肽的氨基末端，長度可以是16-30個(gè)氨基酸，并且可以包含 4-12個(gè)疏水性殘基。此類信號(hào)肽一般通過信號(hào)肽酶從多肽分子上被切除，所以不存在于成熟蛋白中。為了進(jìn)行多肽的Y羧基化，優(yōu)選在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多肽。可以通過在此類細(xì)胞中的表達(dá)來合成用于本發(fā)明的多肽。優(yōu)選地，表達(dá)多肽的細(xì)胞包括允許進(jìn)行多肽的Y羧基化的必要的細(xì)胞機(jī)制(cellular machinery)。例如，細(xì)胞可以表達(dá)Y-谷氨酰羧化酶。優(yōu)選地，用于合成蛋白的細(xì)胞具有與糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的Y-谷氨酰羧化酶。可以在存在酶的輔因子例如維生素K的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。優(yōu)選地，用于合成蛋白的細(xì)胞包含細(xì)胞內(nèi)的維生素K。可以通過在此類細(xì)胞中表達(dá)并測定是否發(fā)生Y羧基化來鑒定能夠被Y羧基化的多肽。例如，可以在如本文描述的細(xì)胞中表達(dá)多肽，并通過例如使用如上文描述的信號(hào)肽將其靶向此類細(xì)胞的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。通過在此類細(xì)胞中表達(dá)多肽并測定所表達(dá)的和翻譯后加工的多肽是否包含Gla殘基，可以鑒定能夠被γ羧基化的多肽。本發(fā)明的方法包括從具有不同程度的Y羧基化的多肽的其它種類中純化一種或多種多肽種類。當(dāng)某多肽可以在不止一個(gè)位點(diǎn)被Y羧基化時(shí)，可以存在該多肽的不同種類，其中存在不同數(shù)目的Y羧基谷氨酸氨基酸殘基，或者其中在該多肽分子的不同的可能位置處存在Y羧基谷氨酸殘基。例如，一些種類的多肽可以被完全Y羧基化。S卩，Y羧基化可以將該多肽內(nèi)所有可能的殘基(例如GLA結(jié)構(gòu)域中的所有Glu殘基)處的谷氨酸都轉(zhuǎn)化為Y羧基谷氨酸。其它種類的多肽可以是部分Y羧基化的。即，Y羧基化可以將該多肽內(nèi)的一些但非所有可能的殘基(例如GLA結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一些但非所有Glu殘基)處的谷氨酸轉(zhuǎn)化為Y羧基谷氨酸?？梢澡b定多種不同的部分Y脫羧基化的種類?？梢园凑斩喾N方式對(duì)這些種類進(jìn)行分類。例如，可以通過“多肽中哪個(gè)殘基被Y脫羧基化”或通過“存在于多肽中的Y羧基谷氨酸的氨基酸總數(shù)目”來確定Y脫羧基化的水平。后者的分類的意思可以是，基于它們包含的Y羧基谷氨酸殘基的總數(shù)目，一起考慮多肽的多個(gè)結(jié)構(gòu)上不同的分子種類。例如， 這樣的多肽種類其中除了一個(gè)Y羧基谷氨酸殘基之外的所有可能的Y羧基谷氨酸殘基都存在，則該多肽可以包含多肽的多個(gè)不同亞類，其中在可能被Y羧基化的不同位置處保留了谷氨酸。由于Y谷氨酰 羧化酶的作用機(jī)理，Y羧基化一般起始于最接近Y羧基化識(shí)別位點(diǎn)的Glu殘基，并且向遠(yuǎn)離多肽的N末端的方向進(jìn)行。當(dāng)多肽未被完全Y羧基化時(shí)，這一般是由于在最遠(yuǎn)端的Glu殘基被轉(zhuǎn)化之前，γ羧基化被阻斷，或者酶從多肽中被釋放出來。 在部分Y羧基化的多肽中，一般是距離Y羧基化結(jié)合位點(diǎn)最遠(yuǎn)或者距離蛋白的N末端最遠(yuǎn)的Glu殘基未被γ羧基化。例如，如圖1所示，人類因子IX包括最多12個(gè)γ羧基谷氨酸殘基。存在的實(shí)際 Gla殘基數(shù)在不同的多肽分子中是不同的，這取決于該分子通過Y羧基化所進(jìn)行的翻譯后修飾的程度。這意味著人類因子IX的樣品可以包含完全Y脫羧基化的因子IX的種類，即， 具有所有12個(gè)可能的Y羧基谷氨酸殘基(#l_12Gla)。其還可以包含一個(gè)或多個(gè)種類的因子IX，其具有可能的12個(gè)Y羧基谷氨酸殘基中的11個(gè)。在這些之中，最可能的情形是最接近多肽的N末端的11個(gè)Glu殘基被轉(zhuǎn)化為 Gla，但是在如圖1所示的位置40處的第12個(gè)Glu殘基仍然保持為Glu。因此，在這種情況下，只有Glu殘基1-11被轉(zhuǎn)化為Gla (#1-1 IGla)。其還可以包含一個(gè)或多個(gè)種類的因子IX，其具有可能的12個(gè)Y羧基谷氨酸殘基中的10個(gè)。在這些之中，最可能的情形是最接近多肽的N末端的10個(gè)Glu殘基被轉(zhuǎn)化為 Gla，但是在如圖1所示的位置36和40處的第11個(gè)和第12個(gè)Glu殘基仍然保持為Glu。 因此，在這種情況下，只有Glu殘基1-10被轉(zhuǎn)化為Gla(#l-10Gla)。其還可以包含一個(gè)或多個(gè)種類的因子IX，其具有可能的12個(gè)Y羧基谷氨酸殘基中的9個(gè)，例如#l-9Gla。其還可以包含一個(gè)或多個(gè)種類的因子IX，其具有可能的12個(gè)γ 羧基谷氨酸殘基中的小于9個(gè)，例如8、7、6、5、4、3、2、1個(gè)，或一個(gè)都沒有。本發(fā)明提供了用于純化此種多肽種類的方法。特別地，可以相對(duì)于樣品中的多肽的其它種類純化多肽的某個(gè)種類。因此，本發(fā)明的方法可以引起感興趣的種類在多肽樣品中的相對(duì)比例增大。這可以通過從該樣品中除掉多肽的一個(gè)或多個(gè)不同種類，由此增加從感興趣的種類形成的多肽(作為一個(gè)整體)的比例來實(shí)現(xiàn)。這可以通過從樣品中特異性除掉一個(gè)或多個(gè)特定種類來實(shí)現(xiàn)，通過從樣品中除掉一個(gè)或多個(gè)不是感興趣的種類的種類來實(shí)現(xiàn)，或通過除掉感興趣的種類在其中所占比例小于在原始樣品中的比例的樣品級(jí)分來實(shí)現(xiàn)。這些方法中的任意項(xiàng)可以引起感興趣的種類的比例的總體上的增加。因此，本發(fā)明的方法可以引起包含多肽的不同種類的混合物的樣品中特定的多肽種類的比例的增加或降低。多肽種類的比例的增加可以是作為一個(gè)整體該種類在多肽樣品中的比例增加至多5%，至多10%，至多20%，至多30%或更高。多肽種類的比例的降低可以是作為一個(gè)整體該種類在多肽樣品中的比例降低至多5 %，至多10 %，至多20 %，至多30 %，至多50 %， 至多70%，至多90%或更高。多肽種類的比例的降低可以是相對(duì)于存在于原始樣品中的量而言，存在的該種類的量下降至多5%，至多10%，至多20%，至多30%，至多50%，至多 70%，至多90%或更高。多肽種類的比例的降低可以是從樣品中基本上或完全除掉該種類。例如，本發(fā)明的方法可以通過從樣品中除掉所有的或基本上所有的可檢測的特定種類的多肽而純化多肽樣品。樣品中剩余的該種類的量可以低于原始樣品中存在的量的10%，低于 5%，低于2%或低于1%。 因此，本發(fā)明的方法的目的是允許改變多肽樣品中不同種類的相對(duì)比例。不同的種類可以具有不同性質(zhì)或不同活性。通過改變多肽樣品中此種類的量或比例，作為一個(gè)整體的樣品的性質(zhì)或活性可以被改變。例如，當(dāng)不同種類的多肽具有不同水平的活性時(shí)，通過改變不同種類的比例以增加具有較高水平活性的種類的比例，和/或通過降低具有較低活性或無活性的種類的比例，可以增加該樣品的比活性，例如每個(gè)多肽分子的平均活性，或那些量的多肽具有的最大可能活性的百分率。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)重組產(chǎn)生的人類因子IX(rhFIX)顯示出約50%的比活性。此樣品的分級(jí)分離(fractionization)顯示其包含具有主要是#1_8_、#1-9-, #1_10-#1_11-和 #1-12-Gla的各個(gè)rhFIX種類。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)#1_11_和#l_12_Gla在凝固測驗(yàn)和兩階段活性測驗(yàn)中是完全有活性的。#1-8-、#1_9-和#1-10-61￡1種類顯示出活性下降至約2-5%、14-22% 和27-36%，這取決于所用的測驗(yàn)。因此可以看出，不同種類的rhFIX(其區(qū)別僅在于它們、羧基化程度的不同)顯示出不同水平的活性。預(yù)期具有較高比例的#1-11-和/或#1-12-Gla的樣品將顯示出比具有較低比例的這些種類的樣品更高的比活性。預(yù)期具有較高比例的#1-8-和/或#1-9-和 /或#1-10-Gla的樣品將顯示出比具有較低比例的這些種類的樣品更低的比活性。因此，可以通過改變樣品中這些種類的比例來改變因子IX樣品的總體比活性。在這種情況下，可以預(yù)測可以通過下列一項(xiàng)或多項(xiàng)來增加因子IX的樣品的總體比活性一增加樣品中#l-12_Gla的比例；一增加樣品中#1-11-Gla的比例；一降低樣品中#l-10_Gla的比例；一降低樣品中#l-9_Gla的比例；一降低樣品中#l-8_Gla的比例；一降低樣品中#l-7_Gla的比例；一降低樣品中#l-6_Gla的比例；一降低樣品中#l-5_Gla的比例；一降低樣品中#l-4_Gla的比例；一降低樣品中#l-3_Gla的比例；一降低樣品中#l-2_Gla的比例；和一降低樣品中#l-l_Gla的比例。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明純化因子IX的樣品時(shí)，可以選擇這些變化中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)。優(yōu)選的因子IX樣品將僅包含#l-ll_Gla和#l_12_Gla，并且將不含或基本上不含具有比這低的Y羧基化程度的種類，例如#1-10-、#1-9-和#1-8-61￡1種類。該方法可適用于現(xiàn)有的hFIX的成分。例如，如本文所解釋，發(fā)現(xiàn)用于實(shí)施例2的 hFIX 具有 45. 6 % #1-12-Gla、36. 0 % #l_ll_Gla、13. 6 % #l-10_Gla、3. 3 % #l_9_Gla 和 1. 6% #l-8-Gla。rhFIX可以通過商業(yè)渠道從Wyeth獲得，其商標(biāo)是Benefix 。Benefix 中樣丨-川-^-丨丨-和Sh12-Gia的含量分別是約8-10%、25-31%和60-67%?？梢钥闯霰疚拿枋龅姆椒捎糜谠黾哟祟惓煞种?l-ll_Gla和/或#1-12-Gla的比例。本文描述的方法可用于降低此類制劑中Y羧基化程度較低的種類例如#l-10-Gla、#l-9-Gla和#l-8-Gla 的比例。預(yù)期這將會(huì)改善此類制劑中hFIX的比活性。類似的方法可用于其它的含有Gla的多肽。例如，因子VII和因子X可以包括至多11個(gè)Gla殘基。如圖4所示，本發(fā)明的方法可用于改變例如#1-9-、#1-10_或#1-11-因子VII的比例。因此，本文描述的方法可用于改變因子VII的不同種類的比例(基于它們的 Gla含量)。例如，本文描述的方法可用于增加此類成分中#1-10-Gla和/或#l_ll_Gla的比例。本文描述的方法可用于降低此類成分中的、羧基化程度較低的種類例如#1_9-Gla 和更低的種類的比例。類似地，實(shí)施例7顯示了可以根據(jù)本發(fā)明的方法處理包含因子X的多個(gè)種類的制劑，以改變因子X的包含Gla的不同種類的比例。通過在陰離子交換色譜中選擇合適的級(jí)分，可以選擇包含不同比例的不同Gla種類的樣品。例如，從實(shí)施例7中可以看出，本文描述的方法可用于增加此類成分中#1-10-Gla和/或#l-ll-Gla的比例。本文描述的方法可用于降低、羧基化程度較低的種類例如#1_9-Gla和更低的種類的比例。因此，本發(fā)明提供了允許從相同多肽的其它種類中純化多肽種類的方法，其中所述種類的區(qū)別在于其Y羧基化程度不同，或者它們的氨基酸序列中Gla殘基的數(shù)目不同。本發(fā)明的方法使用陰離子交換色譜。本發(fā)明特別涉及這樣的方法其中感興趣的多肽結(jié)合至陰離子交換材料，并且使用包含乙酸銨、氯化銨或乙酸鈉的緩沖液從陰離子交換材料中洗脫多肽。陰離子交換材料是帶正電的離子交換材料。因此，其具有可以與穿過或通過該陰離子交換材料的水溶液中的陰離子進(jìn)行交換的游離陰離子?？梢酝ㄟ^將一個(gè)或多個(gè)帶電的配體結(jié)合至固相來提供電荷，或者，電荷可以是固相的固有性質(zhì)。所述固相可以是例如，純化柱、顆?；蛑樽印⒛せ?yàn)V器。一般而言，陰離子交換樹脂可用于純化具有小于約7的pi的多肽?？捎糜诒疚牡纳虡I(yè)上可獲得的陰離子交換材料包括，例如，Q Sepharose Fast Flow, Macroprep 25Q、Poros HQ50、Source 30Q、Source 15Q、Mini Q> Mono Q,優(yōu)選 Mini Q> Mono Q、Capto Q、Q Sepharose HP、Toyopearl QAE 550C、Unosphere Q、DEAE Sepharose FF> Fratoprep DEAE 禾口 Q HyperD 20。陰離子交換材料可以使用強(qiáng)的陰離子交換基團(tuán)，例如季胺。陰離子交換材料可以使用弱的陰離子交換基團(tuán)，例如二乙氨基乙基(DEAE)。技術(shù)人員可以根據(jù)例如待純化的特定多肽來選擇合適的陰離子交換材料?？梢愿鶕?jù)待純化的特定多肽和所用的條件例如pH、緩沖液、離子強(qiáng)度等來選擇陰離子交換材料。常規(guī)的陰離子交換色譜純化過程通常由選自下列的一個(gè)或多個(gè)步驟組成陰離子交換材料的平衡、加樣或裝載樣品、一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟、洗脫和離子交換材料的再生。用于離子交換色譜的標(biāo)準(zhǔn)方法可以見例如Remington，s Pharmaceutical Sciences。優(yōu)選在裝載感興趣的多肽之前平衡陰離子交換樹脂。該平衡步驟的目的是將陰離子交換材料的狀況調(diào)整至更加接近用于該方法的隨后步驟的狀況。為了避免色譜過程中流動(dòng)相的成分的改變，應(yīng)該將陰離子交換材料平衡至起始緩沖液的PH和離子組成(例如，導(dǎo)電性、緩沖液組成)。例如，可以將平衡緩沖液的離子強(qiáng)度(例如導(dǎo)電性、pH)選擇為盡可能類似于用于該方法的后續(xù)步驟的緩沖液的離子強(qiáng)度，例如用于裝載多肽的緩沖液和/或洗滌緩沖液的離子強(qiáng)度。因此，可以使用接近于后續(xù)步驟中使用的緩沖液或制劑的緩沖液來平衡陰離子交換材料。例如，對(duì)于陰離子交換材料的平衡和樣品的裝載，可以使用相同的緩沖液。對(duì)于陰離子交換材料的平衡和樣品裝載后陰離子交換材料的洗滌，可以使用相同的緩沖液。平衡緩沖液的PH可以與裝載制劑和/或洗滌緩沖液相同。平衡緩沖液的導(dǎo)電性可以與裝載制劑和/或洗滌緩沖液相同。平衡緩沖液使用的緩沖物質(zhì)可以與裝載制劑和/或洗滌緩沖液相同。平衡緩沖液的緩沖物質(zhì)的濃度可以與裝載制劑和/或洗滌緩沖液相同。平衡緩沖液可以含有同樣也存在于裝載制劑和/或洗滌緩沖液中的另外的成分，例如洗滌劑?？梢愿鶕?jù)待純化的特定多肽來確定平衡緩沖液的pH。例如，對(duì)于多種多肽例如因子IX而言，9.0或更高的PH不是最佳的，因?yàn)樵谶@些PH值時(shí)可以觀察到這些多肽的自動(dòng)活化和/或降解。用于本發(fā)明的平衡緩沖液可以配制為例如pH為約5. 0至約8. 5，例如pH5. 0至 PH8. 5。平衡緩沖液的pH可以是大于約5. 0，大于約5. 5，大于約6. 0，大于約6. 5，大于約 7. 0，大于約7. 5或大于約8. 0。平衡緩沖液的pH可以是小于約8. 5，小于約8. 0，小于約
7.5，小于約7.0，小于約6. 5，小于約6.0或小于約5. 5?？梢越M合這些端點(diǎn)的任意組合。例如，平衡緩沖液的PH可以是大于約7. 0和小于約8. 5。pH可以是例如約pH7. 0,7. 5、8. 0或
8.5。這些pH值可以適用于用來純化如本文描述的多肽例如因子IX、因子VII或因子X 的陰離子交換材料的平衡。用于平衡緩沖液的合適的組分可以包括緩沖物質(zhì)，例如Tris、磷酸鹽、MES、Hepes 或碳酸鹽。對(duì)于陰離子交換色譜方法，優(yōu)選陽性緩沖離子例如Tris。此類緩沖物質(zhì)可用于將平衡緩沖液維持在如上所述的PH。在一個(gè)實(shí)施方式中，在整個(gè)陰離子交換色譜程序過程中使用相同的緩沖物質(zhì)和緩沖物質(zhì)濃度。例如，平衡緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液可以都包含相同緩沖物質(zhì)濃度的相同的緩沖物質(zhì)。緩沖物質(zhì)的濃度應(yīng)該足以在陰離子交換程序中維持緩沖液能力和恒定的PH。例如，可以將緩沖物質(zhì)和緩沖物質(zhì)濃度選擇為在加樣和洗脫過程中維持穩(wěn)定的PH和緩沖能力。合適的緩沖物質(zhì)濃度可以是例如5mM-50mM，例如 10mM-40mM。合適的緩沖物質(zhì)濃度可以是例如5mM、10mM、15mM、20mM或25mM。平衡緩沖液可以包含一種或多種另外的成分。平衡緩沖液可以包含添加劑，例如乙二醇、乙醇、脲或用于增強(qiáng)蛋白的溶解性的洗滌劑。用于陰離子交換色譜的洗滌劑應(yīng)該是中性的或與陰離子交換材料具有相同的電荷。可以以例如小于1%、小于0.5%、小于0. 1% 或小于0.01%的濃度使用非離子型洗滌劑例如Tween 80,Tween 20或Triton XlOO0可以使用非緩沖鹽例如NaCl來調(diào)節(jié)緩沖液的離子強(qiáng)度。將包含感興趣的多肽的樣品裝載至陰離子交換材料之上。這是通過在合適的條件 (例如導(dǎo)電性和/或PH)下將樣品暴露于陰離子交換材料從而將多肽固定在陰離子交換材料中或固定在陰離子交換材料上來實(shí)現(xiàn)的。這種固定或結(jié)合是通過多肽與陰離子交換材料的帶電基團(tuán)之間的離子相互作用來實(shí)現(xiàn)的。一般地，當(dāng)與陰離子交換材料接觸的流動(dòng)相的離子強(qiáng)度降低至感興趣的多肽的離子基團(tuán)開始作為陰離子交換材料上的帶電基團(tuán)的反荷離子的那個(gè)點(diǎn)時(shí)，發(fā)生此類結(jié)合。
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根據(jù)本發(fā)明的方法純化的樣品可以是包含如上所述的多肽的任意樣品。優(yōu)選地， 所述樣品包含同一多肽的多于一種的不同種類，其中所述種類的差別在于它們的Y羧基化的程度和/或位置。如上所述，可以使用任意常規(guī)程序獲得感興趣的多肽。例如，可以從體內(nèi)來源例如從動(dòng)物獲得多肽，或者，可以在體外例如在組織或細(xì)胞中產(chǎn)生多肽?？梢灾亟M產(chǎn)生感興趣的多肽，例如，通過誘導(dǎo)多肽在細(xì)胞中的表達(dá)。例如，可以在經(jīng)過編碼多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并能夠表達(dá)該多肽的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生感興趣的多肽?？梢栽谠试S多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)此類宿主細(xì)胞。然后，可以從培養(yǎng)基或者從宿主細(xì)胞自身中回收所述多肽。優(yōu)選地，在施加到陰離子交換樹脂之前對(duì)多肽進(jìn)行純化。例如，可以使多肽經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)純化步驟，例如沉淀、免疫沉淀、等電點(diǎn)聚焦、過濾、離心或色譜，例如其它的陰離子交換色譜。此類純化可用于從樣品中部分地或完全地除掉一種或多種污染物，從而增加感興趣的多肽的純度。所述污染物可以是除了感興趣的多肽以外的任意分子。例如，所述污染物可以是不同的多肽、核酸或內(nèi)毒素。所述污染物可以是感興趣的多肽的變體，例如截短的或延伸的多肽，多肽的脫酰胺化形式，非正確折疊的多肽或具有不想要的糖基化的多肽形式。 所述污染物可以是可能干擾離子交換色譜的分子。優(yōu)選地，感興趣的多肽是至少75%純的，更優(yōu)選至少80%純的，至少90%純的或者純度更高。最優(yōu)選地，所述多肽是至少90%純的，例如至少95%，至少97%或至少99% 純的。純度意指由感興趣的多肽組成的總干重的比例。樣品可以包含低于25% wt的如上所述的污染物，例如低于25% wt的除了感興趣的多肽之外的蛋白，更優(yōu)選低于20%，低于 10%，低于5%，低于3%或低于1%。樣品可以是純的或基本上純的感興趣的多肽的樣品。 樣品可以是分離的或基本上分離的感興趣的多肽的樣品。施加到陰離子交換材料上的此類多肽樣品的形式可以是從多肽合成中直接獲得的形式，例如來自重組產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞的培養(yǎng)基的樣品的形式，或表達(dá)該多肽的裂解的細(xì)胞的樣品的形式。施加到陰離子交換材料上的多肽樣品的形式可以是如本文描述的純化的或部分純化的形式?？梢栽谑┘拥疥庪x子交換材料之前進(jìn)一步配制如本文描述的樣品。 例如，當(dāng)以固體形式提供多肽(或純化的多肽)時(shí)，可以將其配制于液體成分中以施加至陰離子交換材料。例如，可以將其配制于水、緩沖液或另一種溶劑中。優(yōu)選地，所述液體成分是含水的。當(dāng)以液體或水性形式提供多肽或純化的多肽時(shí)，或者當(dāng)固體多肽樣品已經(jīng)配制為如上所述的液體形式時(shí)，可以在施加到陰離子交換材料之前調(diào)節(jié)樣品的配制。例如，可以使用常規(guī)方法調(diào)節(jié)樣品或配制的樣品的導(dǎo)電性和/或pH?？梢詫悠返腜H調(diào)節(jié)為等于或基本上等于用于平衡陰離子交換材料和/或洗滌陰離子交換材料的緩沖液的PH?？梢詫悠返膶?dǎo)電性調(diào)節(jié)為等于或基本上等于用于平衡陰離子交換材料和/或洗滌陰離子交換材料的緩沖液的導(dǎo)電性?？梢允褂镁彌_物質(zhì)配制樣品，例如如上文中針對(duì)平衡緩沖液的組成而討論的任意緩沖物質(zhì)。可以在用于平衡陰離子交換材料和/或洗滌陰離子交換材料的相同緩沖液中配制樣品?？梢栽谂c用于平衡陰離子交換材料和/或洗滌陰離子交換材料的緩沖液相同的緩沖物質(zhì)中和/或相同的緩沖物質(zhì)濃度下和/或相同的PH 下和/或相同的導(dǎo)電性下配制樣品。在一個(gè)實(shí)施方式中，就用以施加到陰離子交換材料的感興趣的多肽而言，通過將其加入到與所用的平衡緩沖液相同的緩沖液中來配制。
然后，通過在允許多肽與陰離子交換材料結(jié)合的條件下將多肽的相關(guān)制劑通過或穿過陰離子交換材料而將所述多肽裝載至離子交換材料之上。此類方法是本領(lǐng)域中的常規(guī)操作。一旦將感興趣的多肽裝載至陰離子交換柱上之后，可以使該柱經(jīng)歷一次或多次洗滌。通過將合適的溶液穿過或通過陰離子交換材料來進(jìn)行洗滌。此類洗滌的目的可以包括 除掉未與陰離子交換材料結(jié)合的任意多肽或其它成分；除掉僅與陰離子交換材料較弱結(jié)合的任意多肽或其它成分；除掉與陰離子交換材料結(jié)合的雜質(zhì)，所述雜質(zhì)與陰離子交換材料的親和性小于感興趣的多肽與陰離子交換材料的親和性。在一個(gè)實(shí)施方式中，將多肽裝載至陰離子交換材料上之后，以緩沖液洗滌陰離子交換材料以除掉任何未結(jié)合的多肽、污染物或雜質(zhì)。例如，所述洗滌緩沖液可以與配制用于裝載至陰離子交換材料上的多肽的緩沖液相同或基本上相同。所述洗滌緩沖液可以與平衡緩沖液相同或基本上相同。例如，可以使用與平衡緩沖液相同的緩沖液或與用于配制多肽的緩沖液相同的緩沖液來進(jìn)行洗滌。可以使用與平衡緩沖液或用于配制多肽的緩沖液具有相同或基本上相同的PH和/或相同或基本上相同的導(dǎo)電性的緩沖液來進(jìn)行洗滌?？梢允褂冒c用于平衡緩沖液中的或用于配制多肽的緩沖物質(zhì)相同并且濃度與其相同或基本上相同的緩沖物質(zhì)的緩沖液來進(jìn)行洗滌?？商娲鼗蛄硗?，可以使用不同于平衡緩沖液的緩沖液來進(jìn)行其它的洗滌。例如， 可以從陰離子交換材料中除掉與陰離子交換材料結(jié)合但其結(jié)合弱于感興趣的多肽的污染物。此類污染物從陰離子交換材料中的釋放比感興趣的多肽容易。例如，可以使用導(dǎo)電性或離子強(qiáng)度大于平衡緩沖液和/或裝載多肽的制劑的緩沖液來洗滌陰離子交換材料。通過增加緩沖液的離子強(qiáng)度，可以實(shí)現(xiàn)從陰離子交換材料中洗脫成分。優(yōu)選地，將洗滌緩沖液選擇為達(dá)到基本上沒有感興趣的多肽從陰離子交換材料中被洗脫，或者以足夠小的體積來使用洗滌緩沖液，以達(dá)到基本上沒有感興趣的多肽從陰離子交換材料中被洗脫。技術(shù)人員可以根據(jù)特定樣品和感興趣的多肽的性質(zhì)來選擇用于洗滌的緩沖液。例如，可以選擇具有特定PH或?qū)щ娦缘木彌_液以允許除掉那些與樹脂的結(jié)合弱于感興趣的多肽的特定多肽或雜質(zhì)?？梢酝ㄟ^簡單的常規(guī)實(shí)驗(yàn)來選擇此類緩沖液并優(yōu)化其使用，例如， 通過監(jiān)測從柱中除掉的溶液的成分。可以根據(jù)待純化的特定多肽來確定洗滌緩沖液的pH。例如，對(duì)于多種多肽例如因子IX而言，等于或大于9. 0的PH不是最佳的，因?yàn)樵谶@些PH值時(shí)可以觀察到多肽的自動(dòng)活化和/或降解。適用于本發(fā)明的洗滌緩沖液可以配制為例如PH為約5. 0至約8. 5，例如pH5. 0至 PH8. 5。洗滌緩沖液的pH可以是大于約5. 0，大于約5. 5，大于約6. 0，大于約6. 5，大于約 7. 0，大于約7. 5或大于約8. 0。洗滌緩沖液的pH可以是低于約8. 5，低于約8. 0，低于約
7.5，低于約7.0，低于約6. 5，低于約6.0或低于約5. 5?？梢越M合這些端點(diǎn)的任意組合。例如，洗滌緩沖液的PH可以是大于約7. 0和低于約8. 5。pH可以是例如約pH7. 0,7. 5、8. 0或
8.5。這些pH值可以適合于用來洗滌用于純化如本文描述的多肽例如因子IX、因子VII 或因子X的陰離子交換材料。用于洗滌緩沖液的合適的成分可以包括緩沖物質(zhì)，例如Tris、磷酸鹽、MES、Hepes或碳酸鹽。對(duì)于陰離子交換色譜法，優(yōu)選陽性緩沖離子例如Tris。此類緩沖物質(zhì)可用于將洗滌緩沖液維持在如上所述的PH。合適的緩沖物質(zhì)濃度可以是例如5mM-50mM，例如 10mM-40mM。合適的緩沖物質(zhì)濃度可以是例如5mM、10mM、15mM、20mM或25mM。洗滌緩沖液可以包含一種或多種另外的成分。洗滌緩沖液可以包含添加劑，例如乙二醇、乙醇、脲或用于增強(qiáng)蛋白的溶解性的洗滌劑。用于陰離子交換色譜的洗滌劑應(yīng)該是中性的或與陰離子交換材料具有相同的電荷。可以以例如小于1%、小于0.5%、小于0. 1% 或小于0.01%的濃度使用非離子型洗滌劑例如Tween 80,Tween 20或Triton XlOO0可以使用非緩沖鹽例如NaCl來調(diào)節(jié)緩沖液的離子強(qiáng)度。從陰離子交換材料中洗脫分子意思是從陰離子交換材料中除掉該分子。這一般是通過改變陰離子交換材料周圍的緩沖液的離子強(qiáng)度，從而緩沖液與分子競爭與陰離子交換材料的帶電基團(tuán)的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。因此，所述分子與陰離子交換材料的結(jié)合強(qiáng)度降低，它們就分開了。在一些情況下，還可以通過使用改變感興趣的多肽的構(gòu)象的分子、從而降低結(jié)合強(qiáng)度并引起多肽從陰離子交換材料中釋放來實(shí)現(xiàn)從陰離子交換材料的洗脫。可以根據(jù)待純化的特定多肽來確定洗脫緩沖液的pH。例如，對(duì)于多種多肽例如因子IX而言，等于或大于9. 0的PH不是最佳的，因?yàn)樵谶@些PH值時(shí)可以觀察到多肽的自動(dòng)活化和/或降解。適用于本發(fā)明的洗脫緩沖液可以配制為例如pH為約5. 0至約8. 5，例如pH5. 0至 PH8. 5。洗脫緩沖液的pH可以是大于約5. 0，大于約5. 5，大于約6. 0，大于約6. 5，大于約 7. 0，大于約7. 5或大于約8. 0。洗脫緩沖液的pH可以是低于約8. 5，低于約8. 0，低于約
7.5，低于約7.0，低于約6. 5，低于約6.0或低于約5. 5?？梢越M合這些端點(diǎn)的任意組合。例如，洗脫緩沖液的PH可以是大于約7. 0和低于約8. 5。pH可以是例如約pH7. 0,7. 5、8. 0或
8.5。這些pH值可以適用于用來洗脫用于純化如本文描述的多肽例如因子IX、因子VII 或因子X的陰離子交換材料。用于洗脫緩沖液的合適的成分可以包括緩沖物質(zhì)，例如Tris、磷酸鹽、MES、Hepes 或碳酸鹽。對(duì)于陰離子交換色譜法，優(yōu)選陽性緩沖離子例如Tris。此類緩沖物質(zhì)可用于將洗脫緩沖液維持在如上所述的pH。合適的緩沖物質(zhì)濃度可以是例如5mM-50mM，例如 10mM-40mM。合適的緩沖物質(zhì)濃度可以是例如5mM、10mM、15mM、20mM或25mM。洗脫緩沖液可以包含一種或多種另外的成分。洗脫緩沖液可以包含添加劑，例如乙二醇、乙醇、脲或用于增強(qiáng)蛋白的溶解性的洗滌劑。用于陰離子交換色譜的洗滌劑應(yīng)該是中性的或與陰離子交換材料具有相同的電荷?？梢砸岳缧∮?%、小于0.5%、小于0. 1% 或小于0.01%的濃度使用非離子型洗滌劑例如Tween 80,Tween 20或Triton XlOO0可以使用非緩沖鹽例如NaCl來調(diào)節(jié)緩沖液的離子強(qiáng)度。為了用于本發(fā)明，洗脫緩沖液優(yōu)選包含一種或多種離液鹽，例如一種或多種選自乙酸銨、氯化銨和乙酸鈉的鹽。洗脫緩沖液中存在的離液鹽例如乙酸銨、氯化銨和/或乙酸鈉的濃度可以是至少0. 1M，至少0. 2M，至少0. 5M，至少1. OM或至少1. 5M。離液鹽例如乙酸銨、氯化銨和/或乙酸鈉的存在的濃度可以是至多2. 0M，至多1. 9M，至多1. 5M或至多1. OM0 這些下限值中的任一項(xiàng)可以與這些上限值中的任一項(xiàng)組合以形成合適的濃度范圍。離液鹽例如乙酸銨、氯化銨和/或乙酸鈉的存在的濃度可以是至多約2. OM的任意濃度。例如，離液鹽例如乙酸銨、氯化銨和/或乙酸鈉的存在的濃度可以是至多約0. 1，約0. 2，約0. 3，約
0.4，約0.5，約 0.6，約 0.7，約 0.8，約 0.9，約 1.0，約 1. 1，約 1.2，約 1.3，約 1.4，約 1.5，約
1.6，約1. 7，約1. 8，約1. 9或約2. 0M，最優(yōu)選的濃度是約0. 6M。在一個(gè)實(shí)施方式中，洗脫緩沖液的組成與洗滌緩沖液和/或平衡緩沖液相同，只不過洗脫緩沖液另外含有離液鹽。優(yōu)選的離液鹽是乙酸銨、氯化銨和/或乙酸鈉中的一種或多種。因此，洗脫緩沖液可以具有本文描述的用于洗滌緩沖液或平衡緩沖液的任意成分， 但是可以另外包含乙酸銨、氯化銨和/或乙酸鈉。在一個(gè)實(shí)施方式中，平衡緩沖液和洗滌緩沖液是相同的，并且洗脫緩沖液與它們的區(qū)別僅在于洗脫緩沖液還包含乙酸銨、氯化銨或乙酸鈉?？梢允褂秒x液鹽的等度或線性梯度來進(jìn)行洗脫，例如乙酸銨、氯化銨或乙酸鈉的等度或線性梯度。可以通過逐步改變緩沖液中的離液鹽的濃度來進(jìn)行洗脫?？梢酝ㄟ^這些洗脫方法的任意組合來進(jìn)行洗脫。例如，可以以給定濃度的離液鹽進(jìn)行等度洗脫，然后以梯度或一個(gè)或多個(gè)步驟的形式通過濃度漸增的鹽進(jìn)行洗脫。在任意此類洗脫方法中，將會(huì)在不同的時(shí)間從陰離子交換材料中釋放不同的成分，這取決于它們的結(jié)合強(qiáng)度。結(jié)合較弱的成分傾向于較早釋放，或者在較低緩沖液導(dǎo)電性例如較低鹽濃度時(shí)被釋放。結(jié)合較強(qiáng)的成分傾向于在陰離子交換材料上保留較長時(shí)間或者在較高鹽濃度下保持?？梢员O(jiān)測穿過或通過陰離子交換材料的洗脫液以鑒定特定成分何時(shí)被洗脫?？梢栽诓煌臅r(shí)間點(diǎn)匯集洗脫液，并且分析每個(gè)匯集物以確定在哪些匯集物中存在哪些成分。然后可以選擇具有想要的制劑的特定匯集物，例如具有濃度增高的特定多肽種類或濃度降低的其它多肽種類的特定匯集物。如本文描述的等度洗脫使用固定的或穩(wěn)定的濃度的鹽。使用的洗脫緩沖液包含該濃度的鹽，例如如上文討論的任意濃度。洗脫緩沖液穿過或通過陰離子交換材料，監(jiān)測洗脫液以鑒定何時(shí)發(fā)生洗脫。使用等度洗脫，當(dāng)使用較小體積的洗脫緩沖液時(shí)，與陰離子交換材料的結(jié)合親和性較低的成分的釋放將會(huì)早于具有較高結(jié)合親和性的成分，后者需要更大體積的洗脫緩沖液以穿過或通過陰離子交換材料。通過選擇在不同的時(shí)間段獲得的特定的匯集物或洗脫液的批次，可以獲得具有多肽種類的不同成分的樣品。可以通過增加緩沖液中的鹽濃度直至最終的最大濃度，例如上文討論的濃度，來進(jìn)行梯度洗脫。例如，線性梯度可以使用0%-100%的最終濃度的離液鹽。可以在一段時(shí)間內(nèi)將該梯度應(yīng)用于陰離子交換材料，例如超過10、20、30、40、50、70、100、150或更多個(gè)柱體積。使用此類梯度洗脫，與陰離子交換材料的結(jié)合親和性較低的成分將會(huì)在較低濃度的鹽較早釋放，而具有較高結(jié)合親和性的成分將會(huì)晚于前者的釋放，它們需要更高濃度的鹽以發(fā)生洗脫。通過選擇在不同的時(shí)間段獲得的特定的匯集物或洗脫物的批次，可以獲得具有多肽種類的不同成分的樣品。除了使用逐級(jí)(gradual)的梯度來增加離液鹽的濃度以外，還可以使用逐步 (stepwise)的增加。即，鹽的濃度可以在一個(gè)或多個(gè)不連續(xù)的階段中增加至最終的最大濃度。這可以用于反映梯度洗脫的效應(yīng)，其中在不同的濃度、從而在不同的階段中釋放不同的成分。逐步洗脫可以替代性地與等度洗脫組合。例如，可以將鹽濃度的逐步增加維持多個(gè)柱體積的緩沖液，從而允許發(fā)生在該濃度的等度洗脫，隨著所用的緩沖液體積的增加而洗脫不同的成分。也可以使用鹽濃度中的后續(xù)的另外的步驟。
在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)洗脫緩沖液與洗滌緩沖液的差別僅在于在洗脫緩沖液中存在例如乙酸銨、氯化銨或乙酸鈉的鹽時(shí)，可以通過向洗滌緩沖液中添加一定數(shù)量的鹽來獲得用于等度洗脫的洗脫緩沖液，可以通過逐漸向洗滌緩沖液中添加鹽來實(shí)現(xiàn)梯度洗脫，可以通過向洗滌緩沖液中添加一定數(shù)量的鹽以在不連續(xù)的階段中增加緩沖液中的鹽濃度來實(shí)現(xiàn)逐步洗脫。實(shí)施例實(shí)施例1 :FIX的不同的Y羧基化種類的活性分析在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中產(chǎn)生重組人類因子IX(FIX)。經(jīng)測定FIX的比活性是約50%。分級(jí)主要是#1-8-、#1-9-、#1-10-、#1-11-和 #l_12_Gla 的各個(gè) FIX 種類。使用凝結(jié)測驗(yàn)來測定FIX活性依賴性的形成纖維蛋白凝塊所需時(shí)間。使用接觸激活劑(APTT試劑中的鞣花酸)來刺激FXIIa的產(chǎn)生，其進(jìn)一步通過重新鈣化和添加的磷脂被觸發(fā)。測定針對(duì)BeneFIX和正常匯集的人類血漿的活性，并且就WHO人類FIX標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行校正。使用商售的名稱為‘Hyphen BioMed Chromogenic Factor IX kit (Aniara)，的測定試劑盒來測定rhFIX的活性水平。在該測驗(yàn)中，因子XIa將因子IX激活為因子IXa，因子 IXa與激活的因子VIII :C、磷脂和Ca2+ —起將因子X激活為因子Xa。通過在405nm處從因子Xa特異性發(fā)色底物SXa-Il中釋放的pNA的量來測定所產(chǎn)生的因子Xa的量。發(fā)現(xiàn)#1-11-和#l-12_Gla種類在凝固和兩步活性測定中完全具有活性。#11、 #1-9-和#1-10-Gla種類的活性分別下降至約2_5%、14_22%和27-36 %，這取決于所用的測驗(yàn)。實(shí)施例2 =FIX的不同的Y羧基化的種類的純化和分析使用陰離子交換色譜來分離不同、羧基化形式的重組人類因子IX(rhFIX)。該方法使用SOURCE 15Q柱(GE Healthcare)，其柱床體積是6ml，流速是3ml/分鐘，溫度是4°C。裝載至柱上的樣品(“裝載樣品”)是rhFIX。總共裝載約13mg。使用0. IM NaOH 將裝載樣品調(diào)節(jié)至PH 8.0。使用的緩沖液如下平衡緩沖液20mMTris/NaOH、pH 8. 0,0. 01% Tween80。洗脫緩沖液:20mMTris/HClU. 5M 乙酸銨、pH 8. 0、0· 01% Tween80。CIP IM NaOH陰離子交換色譜程序如下
權(quán)利要求
1.從包含具有不同含量的Y羧基谷氨酸的多肽種類的混合物的樣品中純化具有想要的含量的Y羧基谷氨酸的所述多肽的方法，所述方法包括以下步驟(a)將所述樣品裝載至陰離子交換色譜材料之上；(b)使用pH小于9.O的包含至少一種選自乙酸銨、氯化銨和乙酸鈉的鹽的溶液來洗脫所述多肽；(c)選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中所述級(jí)分中的多肽具有想要的含量的Y羧基谷氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，包括以下步驟(a)以pH小于9.O的緩沖液平衡陰離子交換材料；(b)將所述樣品裝載至所述陰離子交換材料之上；(c)任選地以pH小于9.O的緩沖液洗滌所述陰離子交換材料；(d)使用pH小于9.O的包含至少一種選自乙酸銨、氯化銨和乙酸鈉的鹽的溶液從陰離子交換材料洗脫所述多肽；和(e)選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中所述級(jí)分中的多肽具有想要的含量的Y羧基谷氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中待純化的多肽選自因子IX、因子VII、因子Vila、 因子X、凝血酶原、蛋白-S、蛋白-C、蛋白Ζ、骨鈣蛋白、基質(zhì)-gla-蛋白、生長抑制特異性-6、 富含脯氨酸的Gla-I、富含脯氨酸的Gla-2、富含脯氨酸的Gla_3和富含脯氨酸的Gla_4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽是因子IX。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述方法包括選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中相較于被純化的樣品中#l-ll_Gla和/或#1-12-Gla形式的因子IX的比例，所述級(jí)分中 #1-11-Gla和/或#1-12-Gla形式的因子IX的比例有所增加。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述方法包括選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中相較于被純化的樣品中#l-10_Gla形式的因子IX的比例，所述級(jí)分中#1-10-Gla形式的因子IX 的比例有所降低。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽是因子VII或因子Vila。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述方法包括選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中相較于被純化的樣品中#1_10-Gla和/或#1-11-Gla形式的因子VII或因子VIIa的比例，所述級(jí)分中#1_10-Gla和/或#l-ll-Gla形式的因子VII或因子VIIa的比例有所增加。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述方法包括選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中相較于被純化的樣品中#1_9-Gla形式的因子VII或因子VIIa的比例，所述級(jí)分中#l_9_Gla形式的因子VII或因子VIIa的比例有所降低。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH是5.0-8. 5。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中乙酸銨、氯化銨或乙酸鈉以0.1M-2. OM的濃度存在于洗脫緩沖液中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中乙酸銨、氯化銨或乙酸鈉以約0.6M的濃度存在于洗脫緩沖液中。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述離子交換色譜使用pH為5.0-8. 5的平衡緩沖液。
14.通過如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的 方法獲得的多肽制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用離子交換色譜純化不同的γ羧基化形式的多肽。具體地，本發(fā)明提供了從包含具有不同含量的γ羧基谷氨酸的多肽種類的混合物的樣品中純化具有想要的含量的γ羧基谷氨酸的所述多肽的方法，所述方法包括以下步驟(a)將所述樣品裝載至陰離子交換色譜材料之上；(b)使用pH小于9.0的包含至少一種選自乙酸銨、氯化銨和乙酸鈉的鹽的溶液來洗脫所述多肽；和(c)選擇從所述洗脫獲得的級(jí)分，其中所述級(jí)分中的多肽具有想要的含量的γ羧基谷氨酸。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102239175SQ200980149078
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日
發(fā)明者J·R·布杰克 申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克保健股份有限公司