專利名稱：紫色小麥二氫黃酮醇還原酶基因及其克隆與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于紫色小麥中二氫黃酮醇還原酶TaDFR1基因的克隆、重組及其催化形成花葵素、花青素、花翠素的功能分析及應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟先蠹Z食作物之一，也是我國主要的糧食作物。它含有豐富的食物纖維，維生素以及微量元素。目前，在小麥的抗性，高產(chǎn)方面的研究已取得了重大的成功，人們對小麥的農(nóng)藝性狀及品質(zhì)又提出了更高的要求。
現(xiàn)在，在紫色小麥的種皮中也發(fā)現(xiàn)了花青素，它存在于小麥的果皮中；而且這些花青素不同于普通小麥的一些色素，它是具有生物活性的一些化合物，有很多重要的作用。小麥本身可以加工成面包，色素也可以被提出來作為色素添加劑。更重要的是這種色素具有一些醫(yī)療作用，它可以降低癌病發(fā)生的幾率，防止一些慢性疾病的發(fā)生。
類黃酮作為次生代謝物在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的作用，象抵抗病原體生成花色素等?；ㄇ嗨鼐褪窃谥参锎紊x過程生成的一些類黃酮化合物，三種不同的花色素—花葵素、花青素與花翠素構(gòu)成了種皮的基本顏色。
在花青素的合成途徑中，PAL、C4H、CHS、F3’5’H、F3’H、DFR以及UFGT都對色素的生成有著重要的作用，尤其是F3’5’H與F3’H控制了由DFR起作用的底物的生成。F3’5’H能使香橙素(DHK)轉(zhuǎn)變?yōu)槎錀蠲窐淦に?DHM)，F(xiàn)3’H能把香橙素(DHK)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p氫槲皮素(DHQ)，F(xiàn)3’5’H也能使雙氫槲皮素(DHQ)變?yōu)槎錀蠲窐淦に?DHM)。這三種底物在DFR的作用下又被分別轉(zhuǎn)變?yōu)樵剀?、原翠雀素苷、原花青素苷，它們并最終轉(zhuǎn)變?yōu)榛?、翠雀素與花青素，構(gòu)成了植物種皮的基本色素。這三種色素在不同的PH值條件下，不同的比例配合而能顯出不同的顏色。曾有報道指出，在紫色小麥種皮中，含有較高比例的翠雀素與花青素。研究表明，植物的DFR基因?qū)ㄉ氐纳善鹬P(guān)鍵的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次從紫色小麥中分離出編碼二氫黃酮醇還原酶的基因的全長cDNA，分別命名為TaDFR1(AY707916)、TaDFR2(AY707917)、TaDFR3(AY707918)、TaDFR4(AY707919)、TaDFR5(AY707920)，并將TaDFR1構(gòu)建到表達載體上，利用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的轉(zhuǎn)基因植株葉片呈紫色，且萼片部分變紫。
小麥TaDFR1全長的cDNA為1230bp，包括起始密碼子和多聚A尾。開放閱讀框部分為1062bp，由此推得具有354個氨基酸的一段序列，將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表的水稻、玉米和擬南芥的DFR相比，氨基酸同源性分別為73％、75％和55％(見附圖1)，表明經(jīng)過上述克隆步驟得到了紫色小麥TaDFR1基因。該基因序列如下(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*長度1230堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源紫色小麥(f)序列描述SEQ ID NO.11ATGGACGGGA AGAAAGGGCC GGTGGTGGTG ACCGGAGCGT CGGGTTTCGT AGGGTCATGG 6061 CTCGTCATGA AGCTCCTCCA GGCCGGGTAC ACCGTCCGGG CCACCGTGCG CGACCCGGCC 120121 AACGTTGAGA AGAACAAGCC GTTGCTGGAG CTTCCCGGAG CCAAAGAGCG GCTGTCCATC 180181 TGGAAGGCCG ACCTGAGCGA CCAAGGCAGC TTCGACGACG CCATCGCCGG CTGCACCGGC 240241 GTCTTCCACG TCGCCACGCC CATGGACTTC GACTCCCAAG ACCCCGAGAA CGAGGTGATC 300301 AAGCCGACGG TGGAAGGGAT GCTGAGCATC ATGAGGGCCT GCAAAGAGGC TGGCACCGTG 360361 AAGCGCATCG TCTTCACCTC CTCCGCCGGC AGCGTCAACA TCGAGGAGCG GCAGCGGCCA 420421 GCCTACGACC AGGACAACTG GAGCGACATC GACTTCTGCC GCCGCGTCAA GATGACAGGA 480481 TGGATGTACT TCGTGTCCAA GGCCCTGGCA GAGAAGGCCG CCATGGAGTA CGCCAGCGAG 540541 AACGGCCTGG ACTTCATCAG CATCATCCCC ACGCTCGTCG CCGGCACCTT CCTCAGCGCC 600601 GGCATGCCGC CCAGCCTCGT CACCGCCCTC GCGCTCATCA CCGGGAACGA GGCCCACTAC 660661 TCGATCCTGA AGCAGGTGCA GCTGGTCCAC CTGGACGACC TCTGCGACGC CATGACCTTT 720721 CTCTTCGAGC ACCCGGAGGC CAACGGCCGC TACATCTGCT CCTCCCACGA CGCCACCATC 780781 CACGGCCTCG CCACGATGCT CCGGGACAGG TTCCCCGAGT ACCGCATCCC GCACAAGTTC 840841 CCGGGGGTCG ACGACGACCT CCAGCCCATC CACTTCTCCT CCAGGAAGCT CCTCGACCAC 900901 GGCTTCAGCT TCCGGTACAC CGCCGAGGAC ATGTTCGACG CCGCCATCCG CACCTGCAGG 960961 GAGAAGGGCC TCATTCCTCT CGGAGACGCC CCGCCGCCTG CAGCCGCCGG CAAGCTGGGA 10201021 GCTCTTGCTG CGGGGGAAGG CCAAGCCATT GGTGCCGAGA CATAATAAGC CAGCGCTGCT 10801081 GCATGAATAC TATTCTTGTG TTCGGAATTT GCATGGGCAG AGCCCTGTAA CTAGTGGGAT 1140
1141 ATCATGGACT ATGGAGTGCA TCAAATTTTT TTCACCTCGG CAGTAGTATG AAATAAAATT 12001201 GAAAATAACG CATAAAAAAA AAAAAAAAAA 1230(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*長度354氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述1 MDGKKGPVVV TGASGFVGSW LVMKLLQAGY TVRATVRDPA NVEKNKPLLE LPGAKERLSI 6061 WKADLSDQGS FDDAIAGCTG VFHVATPMDF DSQDPENEVI KPTVEGMLSI MRACKEAGTV 120121 KRIVFTSSAG SVNIEERQRP AYDQDNWSDI DFCRRVKMTG WMYFVSKALA EKAAMEYASE 180181 NGLDFISIIP TLVAGTFLSA GMPPSLVTAL ALITGNEAHY SILKQVQLVH LDDLCDAMTF 240241 LFEHPEANGR YICSSHDATI HGLATMLRDR FPEYRIPHKF PGVDDDLQPI HFSSRKLLDH 300301 GFSFRYTAED MFDAAIRTCR EKGLIPLGDA PPPAAAGKLG ALAAGEGQAI GAET354從不同顏色四個品種的小麥幼葉中提取基因組DNA，然后用HindIII限制性內(nèi)切酶進行酶切，以TaDFR1的一段序列為模板合成探針進行Southern雜交分析(見附圖2)。結(jié)果顯示，在小麥基因組中存在五個DFR基因的同源基因，這五個基因也就是TaDFR1、TaDFR2、TaDFR3、TaDFR4、TaDFR5。另外，通過對不同的小麥組織器官進行的Northen雜交分析以及不同顏色的種皮中mRNA分離后的雜交分析表明，TaDFR1基因在胚芽鞘以及種皮中均有表達(附圖3)。
構(gòu)建TaDFR1正義表達載體，利用滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲的種子在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選，將篩選出的抗性苗在GM培養(yǎng)基上與野生型共同培養(yǎng)。結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉片及其萼片的顏色不同程度的變紫(附圖4)。根據(jù)葉片顏色的深淺，我們應(yīng)用RT-PCR驗證可以得出，葉片顏色越深，TaDFR1基因的表達量越高。
根據(jù)上述技術(shù)，從小麥中分離到了TaDFR1、TaDFR2、TaDFR3、TaDFR4、TaDFR5基因，并構(gòu)建TaDFR1的正義表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。結(jié)果顯示，TaDFR1基因的過量表達能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片顏色變紫，且萼片部分變紫。天然的色素具有食用、醫(yī)療以及觀賞功能，因此，該基因轉(zhuǎn)化各種作物及蔬菜，將會使這些作物的食用部分變紫，具有非常重要的經(jīng)濟價值和社會價值。


圖1小麥中TaDFR1、TaDFR2、TaDFR3、TaDFR4、TaDFR5與水稻、玉米、擬南芥中DFR氨基酸的同源性比較。
圖2TaDFR1基因Southern雜交A白農(nóng)66；B揚麥158；C漯珍一號；D黑麥76圖3TaDFR1基因Northern雜交R根；S莖；L葉C13天的胚芽鞘；C26天的胚芽鞘G1黑麥76的25天種皮；G2漯珍一號的25天種皮；G3揚麥158的25天種皮；G4白農(nóng)66的25天種皮圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型的對比W野生型擬南芥；T轉(zhuǎn)基因擬南芥；A野生型擬南芥的葉片；B轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片；C轉(zhuǎn)基因擬南芥的早期萼片；D轉(zhuǎn)基因擬南芥的后期萼片；E野生型擬南芥的萼片(五)具體發(fā)明實施方式實施方式1紫色小麥TaDFR1基因的克隆方法(1)RNA的提取利用RNA kit提取總RNA。
(2)DNA第一條鏈的合成取2μg總RNA，加入5×反應(yīng)緩沖液4μl，10mM脫氧核糖核酸(dNTP)2μl，核糖核酸酶抑制劑(40-200u/μl)0.5μl，引物oligodT(1μg/μl)1μl，反轉(zhuǎn)錄酶(10u/μl)2μl，42℃反應(yīng)60分鐘，85℃放置10分鐘終止反應(yīng)，稀釋至200μl。
(3)CR反應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑與條件為首先將下列試劑混在一起10×反應(yīng)緩沖液 5μl脫氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl正向引物(5μM) 4μl反向引物(5μM) 4μl模板cDNA 4μlTaq DNA聚合酶0.5μl總體積 50μlPCR反應(yīng)條件為94℃ 3分鐘；然后進入下列循環(huán)94℃ 1分鐘，56℃1分鐘，72℃ 1分鐘，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。
(4)基因克隆取2μl PCR與pGEM-T載體進行連接，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T and pGEM-T easy Vector system說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
(5)質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA。
(6)序列測定本工作在大連寶生物工程公司進行。
(7)3′序列的分離按Clontech公司的SMART RACE cDNAAmplification Kit說明書進行。
(8)同源檢索利用BLAST軟件將分離出的序列與基因銀行中的序列進行比較。
實施方式2紫色小麥中二氫黃酮醇還原酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列見“發(fā)明內(nèi)容”部分。
實施方式3表達載體的構(gòu)建(1)根據(jù)分離出的TaDFR1的核苷酸序列，設(shè)計引物正向引物5′-GTTCTAGAATGGACGGGAANAAAGGG-3′反向引物5′-AGGTCGACTTATGTCTCGGCACCAAT-3′以種皮總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
(2)取2μl PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體進行連接，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T and pGEM-T easy Vector system說明書進行。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。堿法提取質(zhì)粒DNA，進行序列測定。
(3)用XabI和SacI兩個限制性內(nèi)切酶將該基因從pGEM-T載體上切下，與相同酶酶切的pBI121連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細胞，然后在含氨芐青霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，對菌落進行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。
(4)將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。
實施方式4基因功能分析(1)種植擬南芥。
(2)挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單克隆于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)。
(3)離心收集菌體，沉淀用滲透培養(yǎng)基(5％蔗糖，0.1M MgCl2，0.5％Silwet L-77)懸浮，菌液OD600在0.8左右。
(4)將擬南芥花序浸入滲透液中，浸泡5分鐘。
(5)收獲的種子在篩選培養(yǎng)基(1×MS鹽，1％蔗糖，pH5.7，0.8％瓊脂，卡那霉素30μg/ml)篩選，得到抗性植株。
(6)轉(zhuǎn)基因植株表型分析(見附圖4)。
序列表<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>紫色小麥二氫黃酮醇還原酶基因及其克隆與應(yīng)用<160>1<170>patent In 3.1<210>1<211>1230<212>cDNA<213>小麥(Triticum aestivum)<221>1-1230<400>11ATGGACGGGA AGAAAGGGCC GGTGGTGGTG ACCGGAGCGT CGGGTTTCGT AGGGTCATGG 6061 CTCGTCATGA AGCTCCTCCA GGCCGGGTAC ACCGTCCGGG CCACCGTGCG CGACCCGGCC 120121 AACGTTGAGA AGAACAAGCC GTTGCTGGAG CTTCCCGGAG CCAAAGAGCG GCTGTCCATC 180181 TGGAAGGCCG ACCTGAGCGA CCAAGGCAGC TTCGACGACG CCATCGCCGG CTGCACCGGC 240241 GTCTTCCACG TCGCCACGCC CATGGACTTC GACTCCCAAG ACCCCGAGAA CGAGGTGATC 300301 AAGCCGACGG TGGAAGGGAT GCTGAGCATC ATGAGGGCCT GCAAAGAGGC TGGCACCGTG 360361 AAGCGCATCG TCTTCACCTC CTCCGCCGGC AGCGTCAACA TCGAGGAGCG GCAGCGGCCA 420421 GCCTACGACC AGGACAACTG GAGCGACATC GACTTCTGCC GCCGCGTCAA GATGACAGGA 480481 TGGATGTACT TCGTGTCCAA GGCCCTGGCA GAGAAGGCCG CCATGGAGTA CGCCAGCGAG 540541 AACGGCCTGG ACTTCATCAG CATCATCCCC ACGCTCGTCG CCGGCACCTT CCTCAGCGCC 600601 GGCATGCCGC CCAGCCTCGT CACCGCCCTC GCGCTCATCA CCGGGAACGA GGCCCACTAC 660661 TCGATCCTGA AGCAGGTGCA GCTGGTCCAC CTGGACGACC TCTGCGACGC CATGACCTTT 720721 CTCTTCGAGC ACCCGGAGGC CAACGGCCGC TACATCTGCT CCTCCCACGA CGCCACCATC 780781 CACGGCCTCG CCACGATGCT CCGGGACAGG TTCCCCGAGT ACCGCATCCC GCACAAGTTC 840841 CCGGGGGTCG ACGACGACCT CCAGCCCATC CACTTCTCCT CCAGGAAGCT CCTCGACCAC 900901 GGCTTCAGCT TCCGGTACAC CGCCGAGGAC ATGTTCGACG CCGCCATCCG CACCTGCAGG 960961 GAGAAGGGCC TCATTCCTCT CGGAGACGCC CCGCCGCCTG CAGCCGCCGG CAAGCTGGGA 10201021 GCTCTTGCTG CGGGGGAAGG CCAAGCCATT GGTGCCGAGA CATAATAAGC CAGCGCTGCT 10801081 GCATGAATAC TATTCTTGTG TTCGGAATTT GCATGGGCAG AGCCCTGTAA CTAGTGGGAT 11401141 ATCATGGACT ATGGAGTGCA TCAAATTTTT TTCACCTCGG CAGTAGTATG AAATAAAATT 12001201 GAAAATAACG CATAAAAAAA AAAAAAAAAA 1230
權(quán)利要求
1.一種克隆的紫色小麥二氫黃酮醇還原酶基因TaDFR1，其特征在于它具有下述所示的序列1 ATGGACGGGA AGAAAGGGCC GGTGGTGGTG ACCGGAGCGT CGGGTTTCGT AGGGTCATGG 6061CTCGTCATGA AGCTCCTCCA GGCCGGGTAC ACCGTCCGGG CCACCGTGCG CGACCCGGCC 120121 AACGTTGAGA AGAACAAGCC GTTGCTGGAG CTTCCCGGAG CCAAAGAGCG GCTGTCCATC 180181 TGGAAGGCCG ACCTGAGCGA CCAAGGCAGC TTCGACGACG CCATCGCCGG CTGCACCGGC 240241 GTCTTCCACG TCGCCACGCC CATGGACTTC GACTCCCAAG ACCCCGAGAA CGAGGTGATC 300301 AAGCCGACGG TGGAAGGGAT GCTGAGCATC ATGAGGGCCT GCAAAGAGGC TGGCACCGTG 360361 AAGCGCATCG TCTTCACCTC CTCCGCCGGC AGCGTCAACA TCGAGGAGCG GCAGCGGCCA 420421 GCCTACGACC AGGACAACTG GAGCGACATC GACTTCTGCC GCCGCGTCAA GATGACAGGA 480481 TGGATGTACT TCGTGTCCAA GGCCCTGGCA GAGAAGGCCG CCATGGAGTA CGCCAGCGAG 540541 AACGGCCTGG ACTTCATCAG CATCATCCCC ACGCTCGTCG CCGGCACCTT CCTCAGCGCC 600601 GGCATGCCGC CCAGCCTCGT CACCGCCCTC GCGCTCATCA CCGGGAACGA GGCCCACTAC 660661 TCGATCCTGA AGCAGGTGCA GCTGGTCCAC CTGGACGACC TCTGCGACGC CATGACCTTT 720721 CTCTTCGAGC ACCCGGAGGC CAACGGCCGC TACATCTGCT CCTCCCACGA CGCCACCATC 780781 CACGGCCTCG CCACGATGCT CCGGGACAGG TTCCCCGAGT ACCGCATCCC GCACAAGTTC 840841 CCGGGGGTCG ACGACGACCT CCAGCCCATC CACTTCTCCT CCAGGAAGCT CCTCGACCAC 900901 GGCTTCAGCT TCCGGTACAC CGCCGAGGAC ATGTTCGACG CCGCCATCCG CACCTGCAGG 960961 GAGAAGGGCC TCATTCCTCT CGGAGACGCC CCGCCGCCTG CAGCCGCCGG CAAGCTGGGA 10201021 GCTCTTGCTG CGGGGGAAGG CCAAGCCATT GGTGCCGAGA CATAATAAGC CAGCGCTGCT 10801081 GCATGAATAC TATTCTTGTG TTCGGAATTT GCATGGGCAG AGCCCTGTAA CTAGTGGGAT 11401141 ATCATGGACT ATGGAGTGCA TCAAATTTTT TTCACCTCGG CAGTAGTATG AAATAAAATT 12001201 GAAAATAACG CATAAAAAAA AAAAAAAAAA 1230
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆的紫色小麥二氫黃酮醇還原酶基因TaDFR1的功能，其特征在于該基因在擬南芥中過量表達，顯著促進花色素的生成。
全文摘要
本發(fā)明涉及紫色小麥二氫黃酮醇還原酶TaDFR1基因的克隆、重組及促進花色苷生成的功能分析與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。從紫色小麥種皮中提取總RNA，然后將2微克總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)其它植物中的二氫黃酮醇還原酶保守的氨基酸序列，設(shè)計一對正向特異引物應(yīng)用于3’RACE，進行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，PCR產(chǎn)物連接到pGEM－T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α細胞，進行序列測定。然后用3’特異引物和5’兼并引物快速擴增獲得全長的cDNA。進一步構(gòu)建正義表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片呈現(xiàn)紫色且萼片部分變紫。天然的色素具有許多醫(yī)療、保健功能以及重要的觀賞價值。因此，該基因轉(zhuǎn)化各種作物及蔬菜，具有非常重要的經(jīng)濟價值和社會價值。
文檔編號C12N15/53GK1632125SQ20041003591
公開日2005年6月29日 申請日期2004年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月13日
發(fā)明者張憲省, 劉茂森, 李祥 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)