專利名稱：一種動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體、其制備方法及專用銳孔噴射器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體、其制備方法及專用銳孔噴射器，更具體地說是利用微粒制備技術(shù)，使用脫脂棉制備可支持動物細胞生長的多孔微載體、其制備方法和專用設(shè)備，屬于生化工程和細胞工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是生物制藥行業(yè)的關(guān)鍵技術(shù)，目前一半以上獲得批準(zhǔn)用于臨床治療的生物制品均通過細胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)，而且，隨著大分子功能蛋白和人源(化)抗體的開發(fā)，基因治療和細胞治療的進步，以及組織工程和人造生物器官產(chǎn)品的研發(fā)，細胞培養(yǎng)技術(shù)將在生物制藥產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。多孔微載體(porous microcarriers)是近年來才發(fā)展起來的一種用于大規(guī)模高密度動物細胞培養(yǎng)的優(yōu)秀的細胞支持物。多孔微載體內(nèi)部有許多網(wǎng)狀的相互連通的小孔通向載體表面，細胞易于進入孔中生長、分裂。
目前多孔微載體具有理想細胞支持物的大部分特征，如生物相容性、簡便的無毒害固定化過程、良好的傳質(zhì)特性和機械穩(wěn)定性、最大的比表面積、適合細胞生長的形狀和大小、粒徑分布均一、能高壓滅菌、可重復(fù)利用、易于清洗、接種方便、易使細胞、載體與培養(yǎng)基分離、適合于貼壁細胞和懸浮細胞的培養(yǎng)等，尤其解決了細胞固定化和剪切力對細胞損傷兩大難題，能提高細胞培養(yǎng)密度，便于大規(guī)模細胞培養(yǎng)。
細胞固定化是連續(xù)灌流培養(yǎng)的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的實心微載體只能固定貼壁細胞，而且在培養(yǎng)后期，許多細胞由于老化而降低了貼壁能力，容易從微載體上脫落下來，細胞貼壁需要血清中的某些物質(zhì)和某些細胞因子的幫助，低血清培養(yǎng)基不利于實心微載體培養(yǎng)細胞。多孔微載體能使細胞在其內(nèi)部生長，可降低血清用量，增加細胞固定化穩(wěn)定性，適合于長期培養(yǎng)。多孔微載體不僅能培養(yǎng)貼壁細胞，也適合于懸浮細胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)。由于懸浮細胞個體較小，通過篩網(wǎng)過濾難于將細胞截留在反應(yīng)器中，因而在連續(xù)培養(yǎng)中要損失大量細胞，不利于提高培養(yǎng)密度。通過離心作用使細胞與培養(yǎng)基分離，設(shè)備投資與運行費用均較高，而多孔微載體內(nèi)部網(wǎng)狀小孔可以裹夾懸浮細胞，有效、低廉、簡便地解決了懸浮細胞固定化灌流培養(yǎng)的難題，大大提高了懸浮細胞的培養(yǎng)密度。
在細胞培養(yǎng)中，流體剪切力等容易對缺乏細胞壁的動物細胞帶來機械損傷，而用多孔微載體培養(yǎng)細胞，一方面可為細胞創(chuàng)造良好的微環(huán)境，細胞生長不受流體流動、氣泡凝聚破裂及各種機械碰撞的影響，另一方面還可增加攪拌強度，增大通氣量，提高氣體與培養(yǎng)基間的傳質(zhì)速率和培養(yǎng)基與細胞間的傳質(zhì)速率，適合于攪拌式、氣升式、固定床和流化床等各種生物反應(yīng)器的培養(yǎng)。
現(xiàn)有技術(shù)中的多孔微載體存在著如下一些不足實心微載體只適合培養(yǎng)貼壁細胞，并且無法保護細胞免受機械攪拌傳質(zhì)供養(yǎng)所帶來的機械損傷，而且在長期培養(yǎng)的后期，細胞容易脫弱，細胞高密度培養(yǎng)維持時間較短，實心微載體不能用于懸浮細胞的培養(yǎng)。用膠原制備的微載體如Cultispher G能夠很好地支持貼壁細胞和懸浮細胞的培養(yǎng)，但機械強度差，在培養(yǎng)過程中由于機械攪拌而易導(dǎo)致微載體破碎，并且膠原多孔微載體不能采用常用的蒸汽高壓滅菌的方法滅菌，只能用γ射線照射滅菌，使用不很方便。膠原多孔微載體無法回收利用，使用成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種比表面積大、機械穩(wěn)定性良好、成本低廉的動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供這種多孔微載體的制備方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供制備這種動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的專用銳孔噴射器。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的制備方法，包括以下步驟(1)溶解用銅氨溶液溶解脫脂棉；(2)造粒將脫脂棉銅氨溶液經(jīng)銳孔噴射進入溫度低于-30℃的油性冷凍液中制成含冰晶的微球；(3)致孔用濃硫酸再生脫脂棉微球并溶解其中的冰晶形成多孔微球；(4)修飾用2-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽(DEAE鹽酸鹽，Sigma公司)修飾多孔微球表面，使其交聯(lián)-DEAE弱堿性陰離子交換基團，以促進細胞貼壁；(5)洗滌、滅菌。
所述步驟(1)溶解是指用含1％Cu2+、10％-12％氨的銅氨溶液將脫脂棉完全浸潤，搗爛成糊狀，并加入明膠，配成含1％-2％脫脂棉和0.1％明膠的銅氨溶液。
所述步驟(2)中的油性冷凍液為二甲基硅油201-500和正己烷按1∶4的比例配成的油性冷凍液。
所述步驟(3)致孔是指向造粒的油性冷凍液中加入-30℃、40wt％的H2SO4溶液不斷攪拌，形成多孔微球。
所述步驟(4)修飾是指將洗滌干凈的多孔微球，加至含0.1mol/L DEAE鹽酸鹽、0.5mol/L NaOH的溶液中，置60℃下不斷攪拌10h，使其交聯(lián)-DEAE弱堿性陰離子交換基團。
所述步驟(5)洗滌、滅菌是指將交聯(lián)后的多孔微載體用1％的檸檬酸溶液洗滌一次，再用蒸餾水洗滌三次，爾后用0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌3次，于121℃蒸汽滅菌30min后，吸出PBS，用含1％小牛血清的培養(yǎng)基洗滌二次后置4℃冰箱中備用。
根據(jù)上述方法制備得到的動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體。
一種制備動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的專用銳孔噴射器，由貯液器、頂蓋、液滴分散器和噴孔結(jié)構(gòu)組成；其中貯液器為上端敞口、下端設(shè)有開口的中空容器，其側(cè)壁上沿設(shè)有與頂蓋固定的結(jié)構(gòu)(螺口連接)，側(cè)壁下沿設(shè)有與液滴分散器固定的結(jié)構(gòu)(螺口連接)，可以通過螺接或類似方式固定。貯液器下端的開口呈與噴孔(7號注射針頭，也可為其它型號的注射針頭)相配適的形狀，例如中空管狀，以放置入噴孔(7號注射針頭)結(jié)構(gòu)內(nèi)；頂蓋的中央設(shè)有進氣口，可與控制壓力的氣體管道連接，進氣口的氣體作用是將貯液器中的液體從噴孔壓出，頂蓋與貯液器連接的部位設(shè)有與貯液器側(cè)壁上沿相配適的固定結(jié)構(gòu)，并且中間夾有硅膠材料制成的密封墊圈；液滴分散器上端開口，其側(cè)壁的上沿設(shè)有與貯液器側(cè)壁下沿相配適的固定結(jié)構(gòu)(螺口連接)，其下端設(shè)有供噴孔(7號注射針頭)伸出的開口，其側(cè)壁上設(shè)有進氣口，進氣口處的管道可與外部調(diào)節(jié)氣壓的裝置連接；噴孔上端與貯液器下端開口結(jié)構(gòu)套合，噴孔(7號注射針頭)下端為中空管狀結(jié)構(gòu)，開口與液滴分散器下端開口齊平或比液滴分散器下端開口略長1-2mm，噴孔(7號注射針頭)外側(cè)壁與液滴分散器下端開口內(nèi)側(cè)壁之間有0.2-0.3mm的縫隙，以讓吹散氣體可以自由通過并將噴孔流出的較大液滴分散成直徑較小的液滴。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明提供的動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體(1)與實心微載體相比，具有非常大的比表面積，為細胞的生長提供了充分的生長空間；易實現(xiàn)貼壁細胞和懸浮細胞固定化，生長在多孔微載體上的細胞不易脫落；可很好地保護細胞免受流體剪切力、機械碰撞等引起的細胞損傷；(2)與用膠原制備的多孔微載體如Cultispher G相比，本發(fā)明制備的多孔微載體具有良好的機械穩(wěn)定性，可高壓滅菌，并可回收多次重復(fù)使用；(3)原料采用脫脂棉，來源充足，制作成本低廉。本發(fā)明提供的動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的制備方法操作簡單、高效、成本低，便于實施和推廣；其專用銳孔噴射器結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價格低。
下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，并非對本發(fā)明的限制。


圖1為用脫脂棉制備多孔微載體的制備方法示意2為制備多孔微載體采用的銳孔噴射裝置3為制備的多孔微載體4為CHO細胞在多孔微載體中生長的照片圖具體實施方式
實施例1、多孔微載體的制備如圖1所示，本發(fā)明多孔微載體的制備方法如下一、脫脂棉的溶解用CuSO4·5H2O和等當(dāng)量的NaOH反應(yīng)生成Cu(OH)2沉淀，加入氨水使沉淀逐步溶解最終配成含1％Cu2+、8％氨的銅氨溶液。取市售脫脂棉于適量銅氨溶液中(脫脂棉完全浸潤既可)，不斷搗爛，最終成糊狀，繼續(xù)加入銅氨溶液并不斷攪拌，并加入少許明膠，配成含約1.5％脫脂棉、0.1％明膠的銅氨溶液，置于4℃避光保存。
二、脫脂棉溶液冷凍成球?qū)⒍谆栌?01-500(北京化工二廠)和正己烷按1∶4的比例配成油性冷凍液，置于-70℃環(huán)境過夜。用銳孔噴射裝置(自制裝置，見圖2)將脫脂棉銅氨溶液加壓噴射進入溫度低于-30℃的油性冷凍液中(整個噴射過程油性冷凍液溫度都必須低于-30℃)，由于表面張力的作用，水溶液在非極性溶液中收縮成圓球，并冷凍成冰，此時，微球中包含了許多水和明膠等致孔物質(zhì)。溶液噴射過程中需要不斷地溫和攪拌冷凍液。微球的大小主要通過銳孔噴射裝置中的針頭孔徑調(diào)節(jié)，針頭孔徑越小，噴射形成的微球的粒徑越小。改變吹氣孔的氣體流量也可以調(diào)節(jié)形成微球的粒徑，氣體流量Q吹越大，霧化作用越強，形成的微球粒徑越小。在造粒過程中選擇的實驗條件是，7號針頭，P壓＝0.5bar，Q吹＝5L/min，1L冷凍液中可噴射約100mL脫脂棉銅氨溶液，此時形成的微球粒徑一般均在200μm-300μm。
三、濃硫酸再生脫脂棉微球形成多孔微球盡量將上層的油性冷凍液取出(可重復(fù)使用)，加入-30℃、40％(wt％)的H2SO4溶液不斷攪拌，此時冷凍微球中溶解銅氨溶液里的脫脂棉會再生成固態(tài)，并熔化了微球中的冰晶，形成多孔微球。用100目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾收集多孔微球，而濾過液在自然分層后可回收其中的油性冷凍液。將收集的多孔微球置于80℃熱水中，加入家用洗衣粉反復(fù)洗滌多次以徹底洗除二甲基硅油。用不銹鋼篩網(wǎng)篩分其中的粒徑在200μm-300μm范圍內(nèi)的多孔微球。
四、多孔微球的表面修飾將用去離子水洗滌干凈的多孔微球，加至含0.1mol/L DEAE鹽酸鹽、0.5mol/LNaOH的溶液中，置60℃下不斷攪拌10h，使其交聯(lián)-DEAE弱堿性陰離子交換基團，以促進細胞貼壁。
五、洗滌、滅菌交聯(lián)后的多孔微載體(圖3)用1％的檸檬酸溶液洗滌一次，再用蒸餾水洗滌三次，爾后用0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，于121℃蒸汽滅菌30min后，吸出PBS，用含1％小牛血清的培養(yǎng)基洗滌二次后置4℃冰箱中備用。
本發(fā)明獲得的多孔微載體的理化指標(biāo)見表1。
表1自制多孔微載體物化特性

實施例2、多孔微載體的制備一、脫脂棉的溶解用CuSO4·5H2O和等當(dāng)量的NaOH反應(yīng)生成Cu(OH)2沉淀，加入氨水使沉淀逐步溶解最終配成含1％Cu2+、8％氨的銅氨溶液。取市售脫脂棉于適量銅氨溶液中(脫脂棉完全浸潤既可)，不斷搗爛，最終成糊狀，繼續(xù)加入銅氨溶液并不斷攪拌，并加入少許明膠，配成含約1.5％脫脂棉、0.1％明膠的銅氨溶液，置于4℃避光保存。
二、脫脂棉溶液冷凍成球?qū)⒍谆栌?01-500和正己烷按1∶4的比例配成油性冷凍液，置于-70℃環(huán)境過夜。用銳孔噴射裝置(自制裝置，見圖2)將脫脂棉銅氨溶液加壓噴射進入溫度低于-30℃的油性冷凍液中(整個噴射過程油性冷凍液溫度都必須低于-30℃)，由于表面張力的作用，水溶液在非極性溶液中收縮成圓球，并冷凍成冰，此時，微球中包含了許多水和明膠等致孔物質(zhì)。溶液噴射過程中需要不斷地溫和攪拌冷凍液。微球的大小主要通過銳孔噴射裝置中的針頭孔徑調(diào)節(jié)，針頭孔徑越小，噴射形成的微球的粒徑越小。改變吹氣孔的氣體流量也可以調(diào)節(jié)形成微球的粒徑，氣體流量Q吹越大，霧化作用越強，形成的微球粒徑越小。在造粒過程中選擇的實驗條件是，7號針頭，P壓＝0.5bar，Q吹＝5L/min，1L冷凍液中可噴射約100mL脫脂棉銅氨溶液，此時形成的微球粒徑一般均在200μm-300μm。
三、濃硫酸再生脫脂棉微球形成多孔微球盡量將上層的油性冷凍液取出(可重復(fù)使用)，加入-30℃、40％(wt％)的H2SO4溶液不斷攪拌，此時冷凍微球中溶解銅氨溶液里的脫脂棉會再生成固態(tài)，并熔化了微球中的冰晶，形成多孔微球。用100目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾收集多孔微球，而濾過液在自然分層后可回收其中的油性冷凍液。將收集的多孔微球置于80℃熱水中，加入家用洗衣粉反復(fù)洗滌多次以徹底洗除二甲基硅油。用不銹鋼篩網(wǎng)篩分其中的粒徑在200μm-300μm范圍內(nèi)的多孔微球。
四、多孔微球的表面修飾將用去離子水洗滌干凈的多孔微球，加至含0.1mol/L DEAE鹽酸鹽、0.5mol/LNaOH的溶液中，置60℃下不斷攪拌10h，使其交聯(lián)-DEAE弱堿性陰離子交換基團，以促進細胞貼壁。
五、洗滌、滅菌交聯(lián)后的多孔微載體(圖3)用1％的檸檬酸溶液洗滌一次，再用蒸餾水洗滌三次，爾后用0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，于121℃蒸汽滅菌30min后，吸出PBS，用含1％小牛血清的培養(yǎng)基洗滌二次后置4℃冰箱中備用。
本發(fā)明獲得的多孔微載體的理化指標(biāo)見表2。
表2自制多孔微載體物化特性

實施例3、多孔微載體的制備一、脫脂棉的溶解用CuSO4·5H2O和等當(dāng)量的NaOH反應(yīng)生成Cu(OH)2沉淀，加入氨水使沉淀逐步溶解最終配成含1％Cu2+、8％氨的銅氨溶液。取市售脫脂棉于適量銅氨溶液中(脫脂棉完全浸潤既可)，不斷搗爛，最終成糊狀，繼續(xù)加入銅氨溶液并不斷攪拌，并加入少許明膠，配成含約1.5％脫脂棉、0.1％明膠的銅氨溶液，置于4℃避光保存。
二、脫脂棉溶液冷凍成球?qū)⒍谆栌?01-500和正己烷按1∶4的比例配成油性冷凍液，置于-70℃環(huán)境過夜。用銳孔噴射裝置(自制裝置，見圖2)將脫脂棉銅氨溶液加壓噴射進入溫度低于-30℃的油性冷凍液中(整個噴射過程油性冷凍液溫度都必須低于-30℃)，由于表面張力的作用，水溶液在非極性溶液中收縮成圓球，并冷凍成冰，此時，微球中包含了許多水和明膠等致孔物質(zhì)。溶液噴射過程中需要不斷地溫和攪拌冷凍液。微球的大小主要通過銳孔噴射裝置中的針頭孔徑調(diào)節(jié)，針頭孔徑越小，噴射形成的微球的粒徑越小。改變吹氣孔的氣體流量也可以調(diào)節(jié)形成微球的粒徑，氣體流量Q吹越大，霧化作用越強，形成的微球粒徑越小。在造粒過程中選擇的實驗條件是，7號針頭，P壓＝0.5bar，Q吹＝5L/min，1L冷凍液中可噴射約100mL脫脂棉銅氨溶液，此時形成的微球粒徑一般均在200μm-300μm。
三、濃硫酸再生脫脂棉微球形成多孔微球盡量將上層的油性冷凍液取出(可重復(fù)使用)，加入-30℃、40％(wt％)的H2SO4溶液不斷攪拌，此時冷凍微球中溶解銅氨溶液里的脫脂棉會再生成固態(tài)，并熔化了微球中的冰晶，形成多孔微球。用100目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾收集多孔微球，而濾過液在自然分層后可回收其中的油性冷凍液。將收集的多孔微球置于80℃熱水中，加入家用洗衣粉反復(fù)洗滌多次以徹底洗除二甲基硅油。用不銹鋼篩網(wǎng)篩分其中的粒徑在200μm-300μm范圍內(nèi)的多孔微球。
四、多孔微球的表面修飾將用去離子水洗滌干凈的多孔微球，加至含0.1mol/L DEAE鹽酸鹽、0.5mol/LNaOH的溶液中，置60℃下不斷攪拌10h，使其交聯(lián)-DEAE弱堿性陰離子交換基團，以促進細胞貼壁。
五、洗滌、滅菌交聯(lián)后的多孔微載體(圖3)用1％的檸檬酸溶液洗滌一次，再用蒸餾水洗滌三次，爾后用0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，于121℃蒸汽滅菌30min后，吸出PBS，用含1％小牛血清的培養(yǎng)基洗滌二次后置4℃冰箱中備用。
本發(fā)明獲得的多孔微載體的理化指標(biāo)見表3。
表3自制多孔微載體物化特性

實施例4、用自制的多孔微載體培養(yǎng)基因重組中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)一、細胞培養(yǎng)培養(yǎng)的動物細胞是表達pro-UK的基因重組CHO細胞系CL-11G(中國專利ZL96119836.2)，培養(yǎng)基為DMEM/F12＝1/1，加入0.5g/L谷氨酰胺，1.8g/L Hepes，10KIU/ml Aprotini，1g/L蛋白胨，補加多種氨基酸和低血清添加劑，另加適量小牛血清和胰島素，過濾除菌。在100ml攪拌瓶中加入10ml溶漲的經(jīng)高壓滅菌的自制多孔微載體，并接種由方瓶培養(yǎng)制得的細胞懸液，接種密度為5×105cells/mL，加含1％小牛血清的培養(yǎng)基至50ml，置37℃培養(yǎng)箱中攪拌培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為30r/min。培養(yǎng)3d后每天換液20mL，12d后用MTT法染色可見所有的微載體上都長有細胞，用結(jié)晶紫染色法記數(shù)細胞，細胞密度可達約5×106cells/mL，收獲的培養(yǎng)上清中pro-UK濃度一般在1000IU/mL-2000IU/mL。多孔微載體中長滿細胞后，將長有細胞的多孔微載體直接轉(zhuǎn)入1000ml攪拌瓶中，并加入50ml自制微載體，加培養(yǎng)基至500ml，接種密度為5×105cells/mL，于37℃攪拌培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為50r/min，培養(yǎng)3d后每天換液200-300mL，12d后所有的微載體上都長有細胞，細胞密度可達約5×106cells/mL，收獲的培養(yǎng)上清中pro-UK濃度一般在1000IU/mL-2000IU/mL。培養(yǎng)15d后，將培養(yǎng)基中的血清濃度從1％降至0.1％，每天分兩次換液300mL-500mL，培養(yǎng)上清中的pro-UK濃度一般在2000IU/mL-2500IU/mL，培養(yǎng)30d MTT染色，所有的微載體上均長滿細胞(圖4)。表明自制的微載體可以較好支持CHO細胞生長，并且可使用低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，而且細胞放大培養(yǎng)時，無需消化細胞再轉(zhuǎn)至更大規(guī)模的反應(yīng)器中培養(yǎng)，由于細胞可在在新舊微載體之間的自動轉(zhuǎn)移，直接接種長滿細胞的多孔微載體即可，大大簡化了接種和放大培養(yǎng)過程。
二、細胞記數(shù)與觀察1.MTT染色法取出樣品后用5mg/ml MTT溶液染色，置37℃下2h～4h后，在顯微鏡下觀察，長有細胞的多孔微載體為黑色(見圖4)，未長細胞的多孔微載體仍為本白色。
2.結(jié)晶紫染色法取樣5ml于10ml試管中，待多孔微載體沉降后用吸管盡可能多地吸出上清，爾后加入等量的含0.1％結(jié)晶紫的0.1mol/L檸檬酸溶液，每隔1h用吸管吹打、搖蕩，置于37℃下3小時后，搖勻待微載體稍沉降后，用吸管緊靠液面吸取適量液體于血球計數(shù)板上，數(shù)出被染成深紫色的細胞核數(shù)。
實施例5、自制的多孔微載體的回收自制的多孔微載體機械強度高，可回收重復(fù)使用?；厥辗椒ㄈ缦?1)將約50mL內(nèi)部長有細胞的多孔微載體置于1000mL瓶中，加500mL水，用力振蕩2分鐘后，用150目不銹鋼濾網(wǎng)濾除液體，以初步去除脫落的細胞及細胞碎片。(2)將微載體重新懸浮于0.2mol/L的檸檬酸溶液中，置于室溫6小時，并每隔1小時振蕩2分鐘，使多孔微載體內(nèi)部中的大多數(shù)細胞裂解并脫落出來，用150目濾網(wǎng)濾除液體。(3)重復(fù)第一步，用水多次清洗多孔微載體，直至待微載體沉降后液體清亮透明為止。如果有必要，可再次用檸檬酸溶液浸泡洗滌。(4)用5％(wt％)的碳酸氫鈉溶液浸泡洗滌一次，爾后用水洗滌三次。(5)顯微鏡下觀察，如果多孔微載體內(nèi)部還有較多的死細胞，可用0.2％的粗胰酶溶液浸泡，于37℃孵育3小時并每隔半小時搖蕩2分鐘，之后用水清洗至液體清亮透明。(6)如果發(fā)現(xiàn)回收的微載體吸附細胞的能力減弱，可以用DEAE鹽酸鹽再次修飾微載體，將回收的微載體加至含0.02mol/L-0.05mol/L DEAE鹽酸鹽、0.2mol/L NaOH的溶液中，置60℃下不斷攪拌10h，使其交聯(lián)-DEAE弱堿性陰離子交換基團。交聯(lián)后用1％的檸檬酸溶液洗滌一次，再用蒸餾水洗滌三次，爾后用0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，于121℃蒸汽滅菌30min后。(7)吸出PBS，用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌2次，再用DMEM/F12培養(yǎng)基浸泡置4℃?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明提供的多孔微載體具有非常大的比表面積，為細胞的生長提供了充分的生長空間；易實現(xiàn)貼壁細胞和懸浮細胞固定化，生長在多孔微載體上的細胞不易脫落；可很好地保護細胞免受流體剪切力、機械碰撞等引起的細胞損傷；具有良好的機械穩(wěn)定性，可高壓滅菌，并可回收多次重復(fù)使用，制作成本低廉。
實施例6、銳孔噴射器如圖2所示，制備動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的專用銳孔噴射器1，由貯液器11、頂蓋12、液滴分散器14和噴孔結(jié)構(gòu)13組成；其中貯液器11為上端敞口、下端設(shè)有開口的中空容器，其側(cè)壁上沿設(shè)有與頂蓋12固定的結(jié)構(gòu)111(螺口連接)，側(cè)壁下沿設(shè)有與液滴分散器固定的結(jié)構(gòu)112(螺口連接)，可以通過螺接或類似方式固定。貯液器下端的開口呈與噴孔13(7號注射針頭，也可為其它型號的注射針頭)相配適的形狀，例如中空管狀，以放置入噴孔13(7號注射針頭)結(jié)構(gòu)內(nèi)；頂蓋的中央設(shè)有進氣口121，可與控制壓力的氣體管道連接，進氣口121的氣體作用是將貯液器11中的液體從噴孔13壓出，頂蓋12與貯液器11連接的部位設(shè)有與貯液器11側(cè)壁上沿相配適的固定結(jié)構(gòu)122，并且中間夾有硅膠材料制成的密封墊圈15液滴分散器14上端開口，其側(cè)壁的上沿設(shè)有與貯液器11側(cè)壁下沿相配適的固定結(jié)構(gòu)142(螺口連接)，其下端設(shè)有供噴孔13(7號注射針頭)伸出的開口，其側(cè)壁上設(shè)有進氣口141，進氣口121處的管道可與外部調(diào)節(jié)氣壓的裝置2和3連接；噴孔3上端與貯液器11下端開口結(jié)構(gòu)113套合，噴孔13(7號注射針頭)下端為中空管狀結(jié)構(gòu)，開口與液滴分散器下端開口齊平或比液滴分散器下端開口略長1-2mm，噴孔(7號注射針頭)外側(cè)壁與液滴分散器下端開口內(nèi)側(cè)壁之間有0.2-0.3mm的縫隙，以讓吹散氣體可以自由通過并將噴孔流出的較大液滴分散成直徑較小的液滴。
權(quán)利要求
1.一種動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的制備方法，包括以下步驟(1)溶解用銅氨溶液溶解脫脂棉；(2)造粒將脫脂棉銅氨溶液經(jīng)銳孔噴射進入溫度低于-30℃的油性冷凍液中制成含冰晶的微球；(3)致孔用濃硫酸再生脫脂棉微球并溶解其中的冰晶形成多孔微球；(4)修飾用2-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽修飾多孔微球表面，使其交聯(lián)-DEAE弱堿性陰離子交換基團；(5)洗滌、滅菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的制備方法，其特征在于所述步驟(1)溶解是指用含1％Cu2+、8％氨的銅氨溶液將脫脂棉完全浸潤，搗爛成糊狀，并加入明膠，配成含1％-2％脫脂棉和0.1％明膠的銅氨溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的油性冷凍液為二甲基硅油201-500和正己烷按1∶4的比例配成的油性冷凍液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的制備方法，其特征在于所述步驟(3)致孔是指向造粒的油性冷凍液中加入-30℃、40wt％的H2SO4溶液不斷攪拌，形成多孔微球。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的制備方法，其特征在于所述步驟(4)修飾是指將洗滌干凈的多孔微球，加至含0.1mol/L DEAE鹽酸鹽、0.5mol/L NaOH的溶液中，置60℃下不斷攪拌10h，使其交聯(lián)-DEAE弱堿性陰離子交換基團。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的制備方法，其特征在于所述步驟(5)洗滌、滅菌是指將交聯(lián)后的多孔微載體用1％的檸檬酸溶液洗滌一次，再用蒸餾水洗滌三次，爾后用0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌3次于121℃蒸汽滅菌30min后，吸出PBS，用含1％小牛血清的培養(yǎng)基洗滌二次后置4℃冰箱中備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項所述方法制備的動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體。
8.一種制備動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體的專用銳孔噴射器，其特征在于該銳孔噴射器由貯液器、頂蓋、液滴分散器和噴孔結(jié)構(gòu)組成；其中貯液器為上端敞口、下端設(shè)有開口的中空容器，其側(cè)壁上沿設(shè)有與頂蓋固定的結(jié)構(gòu)，側(cè)壁下沿設(shè)有與液滴分散器固定的結(jié)構(gòu)，可以通過螺接或類似方式固定；貯液器下端的開口呈與噴孔相配適的形狀，以放置入噴孔結(jié)構(gòu)內(nèi)；頂蓋的中央設(shè)有進氣口，可與控制壓力的氣體管道連接，進氣口的氣體作用是將貯液器中的液體從噴孔壓出，頂蓋與貯液器連接的部位設(shè)有與貯液器側(cè)壁上沿相配適的固定結(jié)構(gòu)，并且中間夾有硅膠材料制成的密封墊圈；液滴分散器上端開口，其側(cè)壁的上沿設(shè)有與貯液器側(cè)壁下沿相配適的固定結(jié)構(gòu)，其下端設(shè)有供噴孔伸出的開口，其側(cè)壁上設(shè)有進氣口，進氣口處的管道可與外部調(diào)節(jié)氣壓的裝置連接；噴孔上端與貯液器下端開口結(jié)構(gòu)套合，噴孔下端為中空管狀結(jié)構(gòu)，開口與液滴分散器下端開口齊平或比液滴分散器下端開口略長1-2mm，噴孔外側(cè)壁與液滴分散器下端開口內(nèi)側(cè)壁之間有0.2-0.3mm的縫隙，以讓吹散氣體可以自由通過并將噴孔流出的較大液滴分散成直徑較小的液滴。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動物細胞培養(yǎng)用多孔微載體及其制備方法，屬于生化工程和細胞工程領(lǐng)域。該方法包括以下步驟(1)溶解用銅氨溶液溶解脫脂棉；(2)造粒將脫脂棉銅氨溶液經(jīng)銳孔噴射進入溫度低于－30℃的油性冷凍液中制成含冰晶的微球；(3)致孔用濃硫酸再生脫脂棉微球并溶解其中的冰晶形成多孔微球；(4)修飾用2－二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽修飾多孔微球表面，使其交聯(lián)－DEAE弱堿性陰離子交換基團；(5)洗滌、滅菌。用這種方法制備的多孔微載體培養(yǎng)動物細胞，細胞密度高，比表面積大，可保護細胞免受機械損傷，機械強度高，可高壓滅菌和回收利用，成本低廉。
文檔編號C12N11/04GK1556202SQ20031012425
公開日2004年12月22日 申請日期2003年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者胡顯文, 肖成祖, 高麗華, 李佐虎, 胥照平, 賈煦華, 王菲, 李世崇 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工