專利名稱：一種動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體及其交聯(lián)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體，更具體地說是涉及一種無動物來源成分的含 精氨酸配基的微載體以及精氨酸配基與基質(zhì)的交聯(lián)方法，屬于生化工程和細(xì)胞工程領(lǐng)域，
背景技術(shù)：
微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，已廣泛 用于生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長因子、疫苗和單克隆抗體以及具有特殊功能的效應(yīng) 細(xì)胞等，已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵技術(shù)。動物細(xì)胞培養(yǎng)常常需要貼壁生長，在懸浮狀態(tài)下細(xì)胞生長緩慢，停止，甚至死亡。 微載體培養(yǎng)其原理是將對細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載 體，使貼壁細(xì)胞在微載體表面附著生長，同時(shí)通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。它 將細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)變?yōu)閼腋∨囵B(yǎng)，這樣可以大大增加細(xì)胞生長的表面積以提高細(xì)胞的生長 密度。細(xì)胞貼壁主要是靠靜電引力和范德華力，取決于細(xì)胞與微載體表面理化性質(zhì)和微載 體接觸概率有關(guān)。微載體其工作原理即是在經(jīng)過共價(jià)交聯(lián)的載體微球(主要提供固相吸 附表面)上引入電荷，使細(xì)胞以其表面所帶的性質(zhì)相反的電荷互相吸引以達(dá)到貼壁目的。 而一般細(xì)胞在進(jìn)入生理PH值時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加 快細(xì)胞貼壁速度。目前市場上常用的微載體有兩類，它們都是帶有不同基團(tuán)的葡聚糖交聯(lián) 而成的大分子，一類是以帶正電荷的化合物二乙基氨基乙基(DEAE)作為配基，用于一般的 動物細(xì)胞培養(yǎng)，如GE的Cytodex 1 ；另一類微載體用變性的動物明膠——豬膠原蛋白(Pig collagen)作為配基，通過共價(jià)交聯(lián)在葡聚糖微球表面形成一層明膠膜，為細(xì)胞的貼壁生長 提供附著，從而增加細(xì)胞附著和增殖。商品化的第二類微載體有GE的Cytodex 3。Cytodex 3常被選用作體外貼壁培養(yǎng)困難的細(xì)胞的微載體。特別是對上皮形態(tài)細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，更有 其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。其他細(xì)胞如肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞等，也用這種微載體進(jìn) 行過常規(guī)培養(yǎng)。利用豬膠原蛋白生產(chǎn)微載體，是將葡聚糖微球先用環(huán)氧氯丙烷 (Epichlorohydrin, ECH)活化，然后在堿性條件下將經(jīng)過變性的豬膠原蛋白交聯(lián)于葡聚糖 表面(圖1)。但因這種微載體含有豬膠原蛋白，當(dāng)用于生物制品的產(chǎn)業(yè)化過程會遇到很多 的困難并增加很多工作量。首先，添加動物來源成分，會給生物制品下游純化增加負(fù)擔(dān)，并 且會在最終產(chǎn)品中存在殘留；注入健康人體會產(chǎn)生嚴(yán)重的副反應(yīng)；另外，添加動物來源成 分會增加生物制品外源性病毒的風(fēng)險(xiǎn)。因此，對細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)原輔材料的質(zhì)量控制，除了 對其支持細(xì)胞增殖能力的控制之外，還應(yīng)考慮是否含有動物來源成分從而引起的安全性問 題。目前已有的微載體大多以動物膠原及其衍生物作為包被材料，但隨著對生物制品 安全性和質(zhì)量要求的不斷提高和行業(yè)對藥品生產(chǎn)GMP要求的不斷完善，在生產(chǎn)過程中添加 含動物源性材料一直是各國的監(jiān)管機(jī)構(gòu)在生物安全性方面監(jiān)管時(shí)高度關(guān)注的一項(xiàng)內(nèi)容。使 用不含有任何動物來源成分的原輔材料進(jìn)行疫苗等生物制品的生產(chǎn)，必然會成為生物制藥領(lǐng)域的發(fā)展趨勢。為克服因應(yīng)用含動物來源成分的微載體于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中而帶來引入病 毒的風(fēng)險(xiǎn)以及由此引起的產(chǎn)品申報(bào)和監(jiān)管困難，市場上迫切需要一種不含動物膠原等動物 源性材料作配基的新型微載體，以建立在整個(gè)生產(chǎn)過程中無動物來源成分的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 和方案
發(fā)明內(nèi)容
目前已有的動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體大多以動物膠原及其衍生物作為包被材料，本 發(fā)明的目的是提供一種無動物來源成分的含精氨酸配基的微載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這種微載體精氨酸配基與葡聚糖基質(zhì)的交聯(lián)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明使用以下技術(shù)方案本發(fā)明利用精氨酸(Arginine)或全人工合成的多聚精氨酸(Poly-Arginine)作 為配基，用烯丙基甘油醚作為交聯(lián)活化劑將之交聯(lián)于葡聚糖珠表面而合成的一種無動物來 源成分的微載體。由精氨酸聚合而成的多肽鏈，具有和動物明膠相似的性質(zhì)，為細(xì)胞提供一 個(gè)具有多聚正電荷的粘附生長環(huán)境，有利于細(xì)胞的快速附著和擴(kuò)展，有利于細(xì)胞的高密度 生長。它即模仿了動物明膠的表面結(jié)構(gòu)，但又不引入動物源性物質(zhì)，克服了細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 過程中因引入動物來源成分可能帶來的產(chǎn)品質(zhì)量及安全性問題。本發(fā)明的技術(shù)路線是利用烯丙基甘油醚通過葡聚糖凝膠表面的羥基，將葡聚糖珠 活化。溴化后通過氨基將精氨酸或多聚精氨酸交聯(lián)于活化的葡聚糖微球表面。具體的實(shí)施步驟為(見圖2):第一步，葡聚糖微球干粉加水膨脹后，加入NaOH以提供堿性環(huán)境；第二步，加入烯丙基甘油醚，攪拌并保溫，使烯丙基甘油醚的環(huán)氧基打開并與葡聚 糖微球表面的羥基進(jìn)行反應(yīng)，形成共價(jià)鍵；第三步，加入溴水，將烯丙基甘油醚的醚鍵打開，在堿性條件下與精氨酸或多聚精 氨酸的氨基進(jìn)行反應(yīng)，通過精氨酸的ε _氨基將其交聯(lián)于葡聚糖表面形成微載體。本發(fā)明的技術(shù)效果在于(1)通過烯丙基甘油醚的交聯(lián)，在葡聚糖珠表面接臂，從而使得多聚精氨酸配基向 外延伸，以減少細(xì)胞黏附時(shí)的位阻效應(yīng)。(2)通過烯丙基甘油醚的環(huán)氧基和葡聚糖珠交聯(lián)的配基具有穩(wěn)定性好和配基脫落 率低的優(yōu)點(diǎn)，這對微載體本身的性質(zhì)以及產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要。(3)由精氨酸聚合而成的多肽鏈，具有和動物明膠相似的性質(zhì)，都含有大量的陽性 電荷，可以模仿動物明膠的表面結(jié)構(gòu)，但又不引入動物源性物質(zhì)。


圖1為以豬膠原蛋白為配基，葡聚糖凝膠為基質(zhì)的微載體合成路線圖；圖2為通過烯丙基甘油醚交聯(lián)多聚精氨酸，以葡聚糖凝膠作為基質(zhì)的微載體合成 路線圖；圖3為用精氨酸作配基的微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞的顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中所用方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、微載體的制備如圖2所示，本發(fā)明微載體 配基與基質(zhì)的交聯(lián)步驟如下1.烯丙基甘油醚活化葡聚糖微球?qū)OOg葡聚糖干粉加入三頸燒瓶中，加入IOOOg水并攪拌使其充分溶脹。加入 IlOg固體硫酸鈉，30°C下攪拌1小時(shí)。加入70g固體NaOH后并充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加入烯丙基甘油醚。將溫度升高?5°C 并反應(yīng)過夜。反應(yīng)完畢后用約10倍體積的水洗滌凝膠，然后再用10倍體積的乙醇與10倍 體積的水依次洗滌各一次。2.溴化烯丙基甘油醚將IL烯丙基甘油醚活化的葡聚糖微球加入到三頸瓶中并加入250mL水。加入30g 的無水乙酸鈉并充分?jǐn)嚢?。加入溴水直至懸液呈黃色，后繼續(xù)溴化10分鐘。加入甲酸鈉終 止反應(yīng)至黃色消失。繼續(xù)攪拌30分鐘后將凝膠在一燒結(jié)玻璃漏斗中抽干。3.交聯(lián)精氨酸(多聚精氨酸)配基將IOOg配基溶解于IL水中并制成0. lg/mL的配基溶液，加入到抽干的葡聚糖凝 膠中并用NaOH調(diào)pH值至9.0。45°C反應(yīng)24小時(shí)后，依次用IOOmM的Tris緩沖液(pH8. 0)， 50mM醋酸緩沖液(pH4. 0)，浸洗5次，然后用0. 9%的NaCl溶液浸洗一次。將洗滌好的微載體放置于燒結(jié)玻璃漏斗中，用丙酮脫水后在70°C的烘箱中徹底干 燥。將干燥好的微載體放置于密閉容器中保存。步驟1 3的反應(yīng)體系中所涉及的各物料用量可按比例放大。合成后的多聚精氨酸微載體，顆粒的直徑分布在30 μ m到300 μ m之間，表面電荷 的密度為30 200 μ mol/mL,培養(yǎng)試驗(yàn)表明此微載體適于Vero細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞密度可 達(dá) 8X105/mL。實(shí)施例2、用微載體培養(yǎng)非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero細(xì)胞)1、細(xì)胞培養(yǎng)為檢驗(yàn)以上制備的微載體的性能，我們將其用于非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero細(xì)胞) 的培養(yǎng)，并與商品化的豬膠原蛋白微載體(Cytodex 3)作對照試驗(yàn)，方法如下首先將微載體在PBS (磷酸鹽緩沖液)溶液中溶脹并高壓滅菌。接種前將微載體用 含青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基洗滌兩次。Ig的微載體干粉大約可膨脹到12mL的體積。用細(xì)胞 培養(yǎng)基烯釋至微載體濃度為6g/L。將細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中，接種密度為2 X IO5ceIls/ mL。然后將ImL的微載體懸液加入到相應(yīng)的培養(yǎng)孔，并于7% C02的培養(yǎng)箱中保溫過夜。二、細(xì)胞計(jì)數(shù)與觀察在顯微鏡下觀察分別用精氨酸微載體及豬膠原蛋白微載體連續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)、24小 時(shí)與72小時(shí)的細(xì)胞生長情況(圖3)。顯微鏡照片顯示，用精氨酸微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞， 圖3中顯示接種6小時(shí)后細(xì)胞開始附著，培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞已開始貼壁生長；培養(yǎng)72小時(shí) 后，微載體表面已為細(xì)胞所覆蓋。用精氨酸合成的非動物源性微載體與市售的豬膠原蛋白 微載體的效果無區(qū)別。細(xì)胞培養(yǎng)用微載體主要用于大規(guī)模、高密度的動物細(xì)胞培養(yǎng)，而動物細(xì)胞培養(yǎng)是疫苗及抗體及基因工程藥物生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。由于微載體的加入，使貼壁培養(yǎng)的動物細(xì)胞 能夠帖服于微載體表面而懸浮生長，從而極大的提高了生長密度并縮短了生長時(shí)間。對照 試驗(yàn)表明， 用精氨酸合成的非動物源性微載體適于Vero細(xì)胞貼壁生長，并能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密 度培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示細(xì)胞密度可達(dá)8X105/mL，與市售的豬膠原蛋白微載體的效果無區(qū) 別。精氨酸微載體和豬膠原蛋白微載體對細(xì)胞生長曲線及生長密度的作用相同，完全可以 替代豬膠原蛋白微載體用于動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。
權(quán)利要求
一種動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體，由配基與基質(zhì)通過交聯(lián)劑交聯(lián)而成，其特征在于配基為精氨酸聚合而成的多肽鏈。
2.如權(quán)利要求1中所述的動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體，其特征在于其配基由天然精氨酸或 全人工合成多聚精氨酸聚合而成。
3.如權(quán)利要求1中所述的動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體，其特征在于基質(zhì)為葡聚糖。
4.如權(quán)利要求1至3任一權(quán)利要求項(xiàng)中所述的的動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體，其特征在于 配基通過交聯(lián)劑烯丙基甘油醚交聯(lián)于基質(zhì)表面。
5.一種用于權(quán)利要求4中所述的動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體的交聯(lián)方法，其特征在于配基 通過交聯(lián)劑烯丙基甘油醚與基質(zhì)連接。
6.如權(quán)利要求5中所述的動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體的交聯(lián)方法，包括以下步驟(1)烯丙基甘油醚活化葡聚糖微球?qū)00g葡聚糖干粉加入三頸燒瓶中，加入1000g水并攪拌使其充分溶脹，加入110g固 體硫酸鈉，30°c下攪拌1小時(shí)，加入70g固體NaOH后并充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加入烯丙基甘?醚，將溫度升高至55°C并反應(yīng)過夜，反應(yīng)完畢后用約10倍體積的水洗滌凝膠，然后再用10 倍體積的乙醇與10倍體積的水依次洗滌各一次；(2)溴化烯丙基甘油醚將1L烯丙基甘油醚活化的葡聚糖微球加入到三頸瓶中并加入250mL水，加入30g的無 水乙酸鈉并充分?jǐn)嚢?，加入溴水直至懸液呈黃色，后繼續(xù)溴化10分鐘，加入甲酸鈉終止反 應(yīng)至黃色消失，繼續(xù)攪拌30分鐘后將凝膠在一燒結(jié)玻璃漏斗中抽干；(3)交聯(lián)精氨酸(多聚精氨酸)配基將100g配基溶解于1L水中并制成0. lg/mL的配基溶液，加入到抽干的葡聚糖凝膠中 并用NaOH調(diào)pH值至9. 0，45°C反應(yīng)24小時(shí)后，依次用100mM的Tris緩沖液(pH8. 0), 50mM 醋酸緩沖液(PH4. 0)，浸洗5次，然后用0. 9%的NaCl溶液浸洗一次，將洗滌好的微載體置 于燒結(jié)玻璃漏斗中，用丙酮脫水后在70°C的烘箱中徹底干燥，將干燥好的微載體放置于密 閉容器中保存，步驟⑴ ⑶反應(yīng)體系中所涉及的各物料用量可按比例放大。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體及交聯(lián)方法。該微載體是利用精氨酸(Arginine)或全人工合成的多聚精氨酸(Poly-Arginine)作為配基，用烯丙基甘油醚作為交聯(lián)活化劑將之交聯(lián)于葡聚糖珠表面而合成的一種無動物來源成分的微載體。該微載體由精氨酸聚合而成的多肽鏈，具有和動物明膠相似的性質(zhì)，為細(xì)胞提供一個(gè)具有多聚正電荷的粘附生長環(huán)境，有利于細(xì)胞的快速附著和擴(kuò)展及細(xì)胞的高密度生長。該精氨酸配基既模仿了動物明膠的表面結(jié)構(gòu)，但又不引入動物源性物質(zhì)，克服了細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中因引入動物來源成分可能帶來的產(chǎn)品質(zhì)量及安全性問題。
文檔編號C08B37/02GK101864391SQ201010178279
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者張平, 張洪 申請人:博格隆(上海)生物技術(shù)有限公司