應(yīng)用于大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的表達(dá)目的蛋白cho細(xì)胞株的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的表達(dá)目的蛋白CHO細(xì)胞株的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 從上世紀(jì)60年代開(kāi)始，人們就開(kāi)始了利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)各種大分 子生物制品。并且，伴隨著永久性細(xì)胞株的大量開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，以及在實(shí)際需要和商業(yè)利益需 求下，以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為工具的藥用蛋白研宄與生產(chǎn)開(kāi)始快速的發(fā)展起來(lái)，如病毒疫苗、抗 體、干擾素、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、和生長(zhǎng)因子等的研宄與生產(chǎn)。
[0003] 常用于外源蛋白表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞有CHO、NS0、雜交瘤等細(xì)胞，其中，CHO細(xì) 胞來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢，常用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研宄，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CH0)細(xì)胞是外源真核基因的最佳表達(dá)系統(tǒng)，是生物制藥中最常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0004] 1984年Genentech公司利用r-CHO細(xì)胞表達(dá)的組織型纖溶酶原激活劑t-PA，成為 第一個(gè)運(yùn)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)的生物技術(shù)藥物。當(dāng)今，CHO細(xì)胞已經(jīng)是工 業(yè)上生產(chǎn)重組蛋白最常用的細(xì)胞系。在已經(jīng)上市和正在進(jìn)行臨床研宄的基因工程藥物中， 約60-70%為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品，而CHO細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品占其中的絕大部分。
[0005] 中國(guó)倉(cāng)鼠最早用于研宄是在1919年，當(dāng)時(shí)是用于替代老鼠進(jìn)行肺炎雙球菌的測(cè) 定。1949年，中國(guó)倉(cāng)鼠被帶到美國(guó)，并在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行繁育。次年，人們發(fā)現(xiàn)，中國(guó)倉(cāng)鼠僅含 有11對(duì)染色體，因此被認(rèn)為是放射細(xì)胞遺傳學(xué)和組織培養(yǎng)的理想模型。1957年，Theodore T Puck得到一個(gè)雌性中國(guó)倉(cāng)鼠，并從由此獲得原始的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系，這種細(xì)胞的生 長(zhǎng)需要培養(yǎng)基中含有脯氨酸。從此以后，CHO細(xì)胞由于生長(zhǎng)快速以及蛋白產(chǎn)量高而被廣泛 使用。
[0006] CH0-K1來(lái)自于原始的CHO細(xì)胞系，與原始CHO細(xì)胞系相比，它含有較少的DNA。 CH0-K1突變產(chǎn)生了 CH0-DXB11 (也稱(chēng)作CHO-DUKX或CH0-DUK-XB11 )，它是二氫葉酸還 原酶（DHFR)缺陷型的，其中一個(gè)二氫葉酸還原酶等位基因（dhfr)位點(diǎn)缺失，另外一個(gè)位 點(diǎn)的dhfr發(fā)生了錯(cuò)義突變。之后，人們使用原始CHO細(xì)胞系中一株脯氣酸依賴(lài)的細(xì)胞株 (CH0-pro3)，經(jīng)過(guò)突變產(chǎn)生了 CH0-DG44,這株細(xì)胞的dhfr等位基因的兩個(gè)位點(diǎn)都是缺失 的。CH0-DXB11和CH0-DG44是兩株DHFR缺陷的細(xì)胞，他們生長(zhǎng)需要甘氨酸、次黃嘿呤和胸 苷(稱(chēng)為GHT)，這兩株細(xì)胞常作為宿主細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)染外源基因。由于外源基因和dhfr基因 一起轉(zhuǎn)染到DHFR缺陷CHO細(xì)胞中，因此可以在不含GHT的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因此，GHT缺陷培 養(yǎng)基可以用于篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞。
[0007] 使用DHFR缺陷的CHO細(xì)胞作為宿主，表達(dá)外源基因的步驟為： 1.表達(dá)載體構(gòu)建：克隆目的基因，把目的基因和dhfr基因整合到一個(gè)載體上或者兩者 在不同的載體上。
[0008] 2.轉(zhuǎn)染：把表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到DHFR缺陷的CHO細(xì)胞中。
[0009] 3.選擇：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GHT缺陷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，存活下來(lái)的即為dhfr陽(yáng)性細(xì) 胞，通常也含有目的基因。
[0010] 4.基因擴(kuò)增：上一步驟中獲得的陽(yáng)性細(xì)胞常常僅含有目的基因的單個(gè)拷貝，為了 提高基因拷貝數(shù)，在培養(yǎng)基中添加甲氨蝶呤(MTX，二氫葉酸還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑）用于擴(kuò) 增dhfr，并進(jìn)而使得目的基因得到擴(kuò)增。
[0011] 5.細(xì)胞篩選：從經(jīng)過(guò)基因擴(kuò)增的細(xì)胞中挑選出產(chǎn)量高的細(xì)胞，并評(píng)估其穩(wěn)定性。
[0012] 以上步驟是傳統(tǒng)的篩選方法。
[0013] CHO細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)這個(gè)蛋白藥物生產(chǎn)制備的核心環(huán)節(jié)，是確保蛋白藥物的 研發(fā)、臨床用藥和生產(chǎn)銷(xiāo)售用量的根本。應(yīng)該可以這么認(rèn)為：蛋白藥物，特別是治療性單克 隆抗體及其融合蛋白藥物的發(fā)展是推動(dòng)這一技術(shù)發(fā)展的主要?jiǎng)右颉Ｔ趪?guó)內(nèi)，治療性單抗及 其融合蛋白藥物的研發(fā)和生產(chǎn)才剛起步，在這方面沒(méi)有多少技術(shù)積累。
[0014] 目前，國(guó)際上重組抗體及其融合蛋白的制備主要采用CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝，主要 為補(bǔ)料批式培養(yǎng)方式，其單位產(chǎn)量一般可達(dá)3~5g/L。（最高可達(dá)13g/L，但這是個(gè)例，同 時(shí)，與產(chǎn)品本身也有較大關(guān)系。）大型制藥企業(yè)的培養(yǎng)規(guī)模超過(guò)二十萬(wàn)升如：Amgen公司 200000L，Genentech公司250000L等，國(guó)內(nèi)重組抗體及其融合蛋白生產(chǎn)水平低于lg/L，流加 培養(yǎng)規(guī)模不超過(guò)3000L(中信國(guó)健。另，該公司單罐5000L規(guī)模，總30000L規(guī)模的生產(chǎn)線在 建中。），灌注培養(yǎng)規(guī)模不超過(guò)（500L )。
[0015] 蛋白藥物生產(chǎn)過(guò)程中單反應(yīng)器培養(yǎng)的規(guī)模每提高10倍，其綜合的生產(chǎn)成本就可 以降低20%以上?？梢?jiàn)，目前國(guó)內(nèi)的CHO細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模與單位產(chǎn)量導(dǎo)致了居高不下的生產(chǎn) 成本，不能滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)所要達(dá)到的低成本要求，同時(shí)，高企的生產(chǎn)成本也制約了針對(duì)國(guó)際 市場(chǎng)的委托加工（CMO)服務(wù)。
[0016] 與單位產(chǎn)量密切相關(guān)的活細(xì)胞密度方面，國(guó)外已經(jīng)能夠達(dá)到5X107cell S/ml的水 平，而最高還不到2X107cells/ml的水平，平均在0. 7X10Tcells/ml左右的水平。在CHO細(xì)胞 的培養(yǎng)過(guò)程中密度及單位產(chǎn)量的提高，不僅僅受到非常重要的培養(yǎng)基系統(tǒng)及其補(bǔ)料工藝的 影響，還與工藝參數(shù)精細(xì)控制有關(guān)，在培養(yǎng)規(guī)模放大的過(guò)程中需要即時(shí)和精密的調(diào)控，經(jīng)驗(yàn) 不豐富的培養(yǎng)工程師，要做到這一點(diǎn)很難。在這個(gè)領(lǐng)域中，國(guó)內(nèi)的所謂核心技術(shù)和國(guó)際水平 有很大差距，相應(yīng)的生產(chǎn)工藝根本沒(méi)有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，只是對(duì)過(guò)期專(zhuān)利技術(shù)的照搬或模仿， 是相對(duì)落后的。同時(shí)，與細(xì)胞株的本身以及其篩選過(guò)程也有非常大的關(guān)系，這也是本項(xiàng)研宄 產(chǎn)生的原因。
[0017] 在目前，許多研宄單位和企業(yè)，對(duì)于細(xì)胞株篩選也是非?？粗?，關(guān)注點(diǎn)主要集中在 蛋白藥物的表達(dá)量情況和質(zhì)量情況。同時(shí)，也會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基及補(bǔ)料策略相關(guān)的效果進(jìn)行 關(guān)注，這方面主要是用一致的未經(jīng)過(guò)個(gè)性化優(yōu)化的初步培養(yǎng)工藝在小規(guī)模條件下，對(duì)各個(gè) 候選細(xì)胞株進(jìn)行比較，挑選出獲得的蛋白符合質(zhì)量要求及表達(dá)量最高的細(xì)胞株，并確定其 活性等基本情況。
[0018] 但是，在細(xì)胞株篩選時(shí)，對(duì)于各個(gè)細(xì)胞株規(guī)模放大培養(yǎng)和工藝優(yōu)化的適應(yīng)性比較 方面，或者是對(duì)于細(xì)胞株能否適應(yīng)將來(lái)規(guī)模放大培養(yǎng)及其工藝進(jìn)一步優(yōu)化要求方面，無(wú)論 是文獻(xiàn)報(bào)道，還是實(shí)際研宄中鮮有出現(xiàn)。
[0019] 在細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模放大過(guò)程及其工藝優(yōu)化中，需要比較，或者是會(huì)產(chǎn)生的要求主要 有：在非常明確的同等條件下，細(xì)胞群整體單位產(chǎn)量和乳酸積累情況的比較，對(duì)剪切力的耐 受，對(duì)滲透壓的耐受等情況的要求與區(qū)別。
[0020] 同時(shí)，在各細(xì)胞株經(jīng)過(guò)前期篩選后，當(dāng)遇到仍然有較多基本情況相似的候選細(xì)胞 株時(shí)，如果再進(jìn)行規(guī)模放大過(guò)程及其工藝優(yōu)化的后續(xù)比較，將會(huì)產(chǎn)生極大的時(shí)間和資金成 本，因此，在實(shí)際工作中基本上是不會(huì)進(jìn)行后續(xù)的比較，而是根據(jù)非常接近的前期篩選數(shù) 據(jù)，對(duì)現(xiàn)有的各后續(xù)細(xì)胞株進(jìn)行類(lèi)似于隨機(jī)方式的選擇。這樣，其實(shí)所選擇的細(xì)胞株并不一 定是最適合于后續(xù)大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞株，會(huì)讓許多項(xiàng)目失去獲得盡量向最佳成果靠近 的機(jī)會(huì)。
[0021] 因此，需要有一種應(yīng)用于大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的表達(dá)目的蛋白CHO細(xì)胞株的篩選方 法，以便從眾多在前期篩選中基本情況相似的候選細(xì)胞株中，選擇出綜合情況更適合于大 規(guī)模懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞株，即通過(guò)這種篩選方式獲得的細(xì)胞株，將比在此階段通過(guò)類(lèi)似于隨 機(jī)方式選擇出的細(xì)胞株，在進(jìn)行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)時(shí)得到更高的蛋白表達(dá)產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用于大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的表達(dá)目的蛋白CHO細(xì)胞株 的篩選方法。
[0023] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案： 一種應(yīng)用于大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的表達(dá)目的蛋白CHO細(xì)胞株的篩選方法，其特征在于該方 法的具體步驟為： a. 使用傳統(tǒng)篩選方法獲得若干個(gè)候選細(xì)胞株，簡(jiǎn)要步驟如下：采用的細(xì)胞株為CHO細(xì) 胞，在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，根據(jù)實(shí)際需要，篩選出Qp值符合要求的細(xì)胞 株作為種子進(jìn)行保存； b. 對(duì)步驟a所得到的細(xì)胞株進(jìn)行連續(xù)式培養(yǎng)篩選，具體步驟如下： b-Ι.取步驟a所篩選出的細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇操作后，分別接種于無(wú)血清培養(yǎng)基中，接種 的密度為1~5X105cellS/ml，得到細(xì)胞懸浮液，進(jìn)行后續(xù)的互不干擾的平行培養(yǎng)過(guò)程； b-2.將步驟b-Ι所得各細(xì)胞懸液進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，搖床速度50~150rpm，二氧化碳濃度 3~8%，培養(yǎng)溫度35~37°C，培養(yǎng)48~92小時(shí)后，在離心條件為800~1500rpm下，離心 分離3~8分鐘，取細(xì)胞沉淀接種于無(wú)血清培養(yǎng)基中，得到接種密度為3±0. 15X105Cells/ ml的細(xì)胞懸液； b-3.將b-2步驟所得各細(xì)胞懸液進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，搖床速度50~150rpm，二氧化碳濃度 3~8%，培養(yǎng)溫度35~37°C，至活細(xì)胞密度達(dá)到2~3X106cells/ml ; b-4.將步驟b-2所得各細(xì)胞懸液進(jìn)行離心分離，離心條件為800~1500rpm，3~8分 鐘，收集上清，在-25~-15°C條件下，密封保存； b-5.將步驟b-4所得各細(xì)胞沉淀懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，該無(wú)血清培養(yǎng)基的量與步驟 b-2中所使用的無(wú)血清培養(yǎng)基體積相同； b-6.將步驟b-5所得各懸浮液進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，搖床速度50~150rpm，二氧化碳濃度 3~8%，培養(yǎng)溫度35~37°C，培養(yǎng)20~28小時(shí)后，取樣計(jì)量活細(xì)胞密度； b-7.取步驟b-6所得懸浮液重復(fù)步驟b-4到步驟b-6,至活細(xì)胞密度達(dá)到穩(wěn)定值，進(jìn)入 連續(xù)式培養(yǎng)的穩(wěn)定期，維持穩(wěn)定期操作3~10天； b-8.檢測(cè)各上清液中的每20~28小時(shí)的目的蛋白的單位產(chǎn)量，按實(shí)際需要篩選出蛋 白單位產(chǎn)量符合要求的細(xì)胞株； C.對(duì)步驟b篩選出的各細(xì)胞株的懸浮液進(jìn)行通氣干涉連續(xù)式培養(yǎng)篩選，具體步驟如 下： c-Ι.在20~30ml/min的流速通入空氣的條件下，重復(fù)步驟b-4到步驟b-6,到活細(xì)胞 密度達(dá)到穩(wěn)定期后3~10天； c-2.調(diào)整通氣量，增幅為20~30ml/min，并重復(fù)步驟b-4到步驟b-6,到活細(xì)胞密度達(dá) 到穩(wěn)定期后3~10天； c-3.重復(fù)步驟c-2,直至細(xì)胞群全部死亡； c-4.根據(jù)能夠重復(fù)步驟c-2的次數(shù)和實(shí)際需要，篩選出符合要求的細(xì)胞株； d. 對(duì)步驟c所篩選出的各細(xì)胞株進(jìn)行滲透壓干涉連續(xù)式培養(yǎng)篩選，具體步驟如下： d-Ι.實(shí)行步驟b-Ι到b-7的操作，不保存上清； d-2.調(diào)整其滲透壓值，增幅為40± lOmOsm/kg，在新的滲透壓條件下，重復(fù)步驟b-4到 步驟b-6,不保存上清，到活細(xì)胞密度達(dá)到穩(wěn)定期后3~10天； d-3.重復(fù)步驟d-2，直至細(xì)胞群基本全部死亡； d-4.根據(jù)能夠重復(fù)步驟d-2的次數(shù)和實(shí)際需要，篩選出符合要求的細(xì)胞株； e. 對(duì)步驟d中所篩選出的各細(xì)胞株進(jìn)行補(bǔ)料批式培養(yǎng)篩選，最后篩選出符合要求的 細(xì)胞株。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過(guò)實(shí)際實(shí)驗(yàn)的