專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高效表達(dá)目的蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)目的蛋白的方法。
背景技術(shù)：
抗體分子片段與其它蛋白融合，可得到具有多種生物學(xué)功能的融合蛋白，將酶、毒素、細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)的基因與抗體融合，可將這些生物活性靶向到特定的靶部位，能有效地發(fā)揮生物學(xué)功能，降低毒副作用。將抗體片段與細(xì)胞因子融合是靶向治療腫瘤的有效手段，此類(lèi)融合蛋白被稱(chēng)為“免疫細(xì)胞因子”。目前，免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)量成為目前制約其臨床大規(guī)模應(yīng)用的最大障礙。大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道中免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)量均低于20μg/ml，難以達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)的要求。迄今為止只有一種免疫細(xì)胞因子在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用。
已上市的以及正處于臨床試用中的基因工程抗體多達(dá)上百種，其中絕大多數(shù)都是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的，更確切地說(shuō)，是在CHO細(xì)胞中表達(dá)的。因此，對(duì)CHO細(xì)胞的改造以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化成為人們研究的熱點(diǎn)。如Pak等將胰島素樣生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞，使之成為能自分泌這兩種蛋白的超級(jí)CHO細(xì)胞(Pak SCO，Hunt SMN，Bridres MW et al.SuperCHO-a cell line capable of autocrine growth under fully defined protein freeconditions.Cytotechnology.1996，22139-146.)；利用基因工程的方法，將Bcl-2基因(細(xì)胞凋亡抑制基因)導(dǎo)入工程化的CHO細(xì)胞，可減少細(xì)胞凋亡，提高目的蛋白的產(chǎn)量(Figueroa B Jr，Sauerwald TM，Mastrangelo AJ，Hardwick JM，Betenbaugh MJ.omparison of Bcl-2to a Bcl-2 deletion mutant for mammaliancells exposed to culture insults.Biotechnol Bioeng.2001，73(3)211-22)；向CHO細(xì)胞中導(dǎo)入P21或P27基因，可使細(xì)胞阻滯于G1期，從而提高外源蛋白產(chǎn)量(Carvalhal AV，Marcelino I，Carrondo MJ.Metabolic changes during cellgrowth inhibition by p27 overexpression.Appl Microbiol Biotechnol.2003，63(2)164-73；Ibarra N，Watanabe S，Bi JX，Shuttleworth J，Al-Rubeai M.Modulation of cell cycle for enhancement of antibody productivity in perfusionculture of NSO cells.Biotechnol Prog.2003，19(1)224-8)。提高培養(yǎng)基的滲透壓，或在培養(yǎng)環(huán)境中加入丁酸鈉或AMP也可達(dá)到類(lèi)似效果。
培養(yǎng)溫度是影響重組蛋白類(lèi)藥物生產(chǎn)的重要因素之一。優(yōu)化培養(yǎng)溫度，可提高重組蛋白的產(chǎn)量。與其他方法相比，此方法操作簡(jiǎn)便，有較好的實(shí)用價(jià)值。但一些研究表明，僅通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)溫度，并不能使重組蛋白的產(chǎn)量提高到理想水平。(Yoon SK，Song JY，Lee GM.Effect of low culture temperatureon specific productivity，transcription level，and heterogeneity of erythropoietin inChinese hamster ovary cells.Biotechnol Bioeng.2003，82(3)289-98)這是因?yàn)榻档团囵B(yǎng)溫度可提高目的蛋白的比生成率，但同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制，降低了細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量，從而影響了目的蛋白產(chǎn)量的提高。因此，如何利用優(yōu)化培養(yǎng)溫度來(lái)提高重組蛋白產(chǎn)量仍需進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高重組融合蛋白的產(chǎn)量，本發(fā)明公開(kāi)了一種高效表達(dá)目的蛋白的方法，該方法包含兩個(gè)主要內(nèi)容1.優(yōu)化穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的工程化細(xì)胞株的培養(yǎng)溫度；2.進(jìn)行兩階段培養(yǎng)。
本發(fā)明的方法如下第一階段在36.5℃-37.8℃的培養(yǎng)溫度下使穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的工程化CHO細(xì)胞株生長(zhǎng)至合適密度，第二階段將培養(yǎng)溫度降至25℃-32℃，繼續(xù)培養(yǎng)至合適時(shí)間，收集上清并純化蛋白。
其中培養(yǎng)溫度的優(yōu)化通過(guò)以下方法進(jìn)行培養(yǎng)溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響將經(jīng)篩選得到的穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株，分別在25℃-32℃和36.5℃-37.8℃下進(jìn)行培養(yǎng)，25℃-32℃下重組蛋白的比生成率顯著高于36.5℃-37.8℃，同時(shí)細(xì)胞增殖明顯受到抑制。重組蛋白的產(chǎn)量沒(méi)有得到有效提高。
兩階段培養(yǎng)方法的應(yīng)用在36.5℃-37.8℃下使細(xì)胞增殖至90％鋪滿，將培養(yǎng)溫度降低至25℃-32℃繼續(xù)培養(yǎng)。于合適時(shí)間收集上清，經(jīng)檢測(cè)重組蛋白的產(chǎn)量得到顯著提高。
本發(fā)明是基于優(yōu)化培養(yǎng)溫度和兩階段培養(yǎng)方法，提高重組蛋白產(chǎn)量。即當(dāng)細(xì)胞增殖到理想密度后，再降低培養(yǎng)溫度，使目的蛋白的產(chǎn)量得到有效提高。目前在免疫細(xì)胞因子類(lèi)重組蛋白的表達(dá)中，未見(jiàn)有此種策略的應(yīng)用報(bào)道。將本發(fā)明應(yīng)用于免疫細(xì)胞因子類(lèi)重組蛋白的真核表達(dá)可有效提高目的蛋白產(chǎn)量。其優(yōu)點(diǎn)在于方法簡(jiǎn)便、易行，提高產(chǎn)量，但不提高成本。大大節(jié)省了時(shí)間、人力、物力和財(cái)力。無(wú)論對(duì)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；蛏虡I(yè)化生產(chǎn)均有較好的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為不同溫度下融合蛋白表達(dá)量隨時(shí)間變化示意2為不同溫度下細(xì)胞增殖情況示意3為不同溫度下細(xì)胞活力變化示意4為不同溫度下細(xì)胞凋亡情況示意5為FACS分析融合蛋白與Her2表面陽(yáng)性細(xì)胞的結(jié)合活性，其中左圖為陰性對(duì)照，右圖為融合蛋白圖6為MTT法檢測(cè)在不同溫度下生產(chǎn)的融合蛋白的生物學(xué)活性具體實(shí)施方式
利用兩階段培養(yǎng)方法提高融合蛋白(HFI)在重組CHO細(xì)胞中的表達(dá)量1.材料穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白HFI的CHO細(xì)胞株(Shi，M.，Xie，Z.，F(xiàn)eng，J.，Sun，Y.，Yu，M.，Shen，B.，Guo，N.，2003.A recombinant anti-ErbB2，scFv-Fc-IL-2 fusion protein retains antigenspecificity and cytokine function.Biotechnol.Lett.25，815-819)；DMEM培養(yǎng)基和無(wú)蛋白培養(yǎng)基HyQSFM4CHO由HyClone公司生產(chǎn)；羊抗人IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。
2.方法和結(jié)果將穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白anti-erbB2-ScFv-Fc-IL-2的重組CHO細(xì)胞株以2×106/瓶的數(shù)量，接種于底面積為25cm2的培養(yǎng)瓶中，共16瓶。應(yīng)用的培養(yǎng)基為DMEM+10％FBS，在36.5℃-37.8℃下培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗三次，加入5ml的無(wú)蛋白培養(yǎng)基HyQSFM4CHO。其中8瓶放入36.5℃-37.8℃繼續(xù)培養(yǎng)，另外8瓶放于25℃-32℃培養(yǎng)。每間隔24小時(shí)取出一瓶細(xì)胞，檢測(cè)以下各種指標(biāo)的變化。
1.不同溫度下融合蛋白HFI表達(dá)量變化情況采用夾心ELISA法檢測(cè)融合蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。用羊抗人IgG(10μg/ml，pH9.6)包被ELISA板4℃過(guò)夜，充分洗滌后用含1％BSA的PBS 37℃封閉1h，洗滌后加入待測(cè)上清37℃孵育1h，洗滌后加入HRP-GAH IgG 37℃孵育l h，洗滌后以O(shè)PD顯色，洗液為含0.05％Tween20的PBS。結(jié)果顯示應(yīng)用兩階段培養(yǎng)策略可使融合蛋白的產(chǎn)量提高2倍以上，見(jiàn)圖1。
2.不同溫度下細(xì)胞增殖情況計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)觀察細(xì)胞增殖情況，結(jié)果見(jiàn)圖2；3.不同溫度下細(xì)胞活力檢測(cè)用苔盼藍(lán)染色的法檢測(cè)細(xì)胞活力，吸出培養(yǎng)液，加入消化液，在37℃條件下消化1-2分鐘，然后加入5ml培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。取0.5ml苔盼藍(lán)溶液(4％的苔盼藍(lán)溶液，用PBS配置)、0.5ml培養(yǎng)液，充分混勻，然后放置15分鐘，取10ul混合液，注入細(xì)胞計(jì)數(shù)板小室。計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，并計(jì)數(shù)其中著色細(xì)胞。細(xì)胞活力(％)＝(細(xì)胞總數(shù)-著色細(xì)胞)÷總細(xì)胞數(shù)×100％。結(jié)果顯示細(xì)胞在30℃的培養(yǎng)條件下可在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持較高的活力，見(jiàn)圖3。
4.用PI染色法及FACS法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況的變化細(xì)胞用消化液消化后，用預(yù)冷PBS洗2次后，移入1.5ml Ep管中，離心去上清。每管加入1ml 70％乙醇，4℃下固定18小時(shí)以上。離心去乙醇，再用PBS洗2次，加入100ul RNAaseA(0.1mg/ml)，于37℃消化30分鐘。加入0.1mg/ml碘化丙啶(PI)染液100ul，4℃避光染色30分鐘。2小時(shí)內(nèi)測(cè)FACS，以ModFit LT軟件分析。結(jié)果顯示30℃下細(xì)胞凋亡的比例明顯少于37℃下培養(yǎng)的細(xì)胞，見(jiàn)圖4。
5.用FACS法和MTT法分析融合蛋白生物活性的變化
0.02％EDTA消化SK-BR-3細(xì)胞，用冷PBA(PBS，2％BSA，0.1％NaN3)離心洗滌2次；與融合蛋白(100ng/ml)0℃振蕩孵育30min，以冷PBA離心洗滌2次，與FITC-GAH IgG 0℃振蕩孵育30min；冷PBA離心洗滌2次，PBS重懸細(xì)胞，用FACSCalibur儀器進(jìn)行分析，結(jié)果顯示30℃下生產(chǎn)的融合蛋白可與SK-BR-3細(xì)胞結(jié)合，見(jiàn)圖5。
將IL-2依賴(lài)的CTLL-2細(xì)胞，用含15％小牛血清的1640培養(yǎng)基洗3次，以3×104/孔的數(shù)量傳入96孔板，同時(shí)將經(jīng)過(guò)定量后的表達(dá)上清以不同濃度梯度加入96孔板，37℃培養(yǎng)20小時(shí)。加入MTT(5ng/ml，用PBS配置)10ul。4小時(shí)后加入DMSO裂解細(xì)胞，OD570比色，結(jié)果顯示在低溫下生產(chǎn)的融合蛋白的生物學(xué)活性與37℃下無(wú)顯著差別，見(jiàn)圖6。
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)免疫細(xì)胞因子類(lèi)重組蛋白的方法，其特征在于優(yōu)化工程化CHO細(xì)胞株培養(yǎng)溫度和兩階段培養(yǎng)策略。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于兩階段培養(yǎng)的第一階段，是在常規(guī)培養(yǎng)溫度36.5℃-37.8℃下，使穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的工程化CHO細(xì)胞株生長(zhǎng)至適當(dāng)密度；第二階段是將溫度降低至25℃-32℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中免疫細(xì)胞因子類(lèi)重組蛋白為融合蛋白anti-erbB2-ScFv-Fc-IL-2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高效表達(dá)目的蛋白的方法。該方法通過(guò)優(yōu)化穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的工程化CHO細(xì)胞株的培養(yǎng)溫度，并利用兩階段培養(yǎng)策略，使融合蛋白表達(dá)量得到顯著提高。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單、易行、高效，不提高成本。無(wú)論對(duì)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；蛏虡I(yè)化生產(chǎn)均有較好的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1869214SQ20051001177
公開(kāi)日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2005年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日
發(fā)明者施明, 郭寧, 沈倍奮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所