一種篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)和方法。所述篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)包括畢赤酵母菌株和質(zhì)粒載體，所述的畢赤酵母菌株能表達(dá)β半乳糖苷酶C?末端ω肽；所述的質(zhì)粒載體含有編碼β半乳糖苷酶N?末端α肽的核苷酸序列；所述質(zhì)粒載體含有一段用于畢赤酵母基因組DNA插入的Linker DNA序列，其序列為SEQ ID NO：5。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)在培養(yǎng)平板通過篩查藍(lán)色畢赤酵母菌落就可以很方便的篩選到啟動(dòng)子序列。由于采用平板上直接觀察顏色的方法進(jìn)行篩選，因此，該方法除簡(jiǎn)便外，還非常高效。
【專利說明】
一種篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)和方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)由于其具有高表達(dá)、低成本、遺傳操 作簡(jiǎn)單、表達(dá)外源蛋白能進(jìn)行有限的加工修飾等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已經(jīng)成為重要的外源蛋白表達(dá)系 統(tǒng)，特別是在表達(dá)真核生物蛋白上顯示出了極其誘人的應(yīng)用前景。外源基因在畢赤酵母中 表達(dá)首先需要啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。目前在畢赤酵母中廣泛使用的驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的 啟動(dòng)子為A0X1和GAP啟動(dòng)子。如要在畢赤酵母中同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源蛋白，顯然可供選擇的啟 動(dòng)子數(shù)很少。目前研究已涉及將宿主細(xì)胞作為微工廠生產(chǎn)有應(yīng)用價(jià)值的代謝產(chǎn)物，這要求 將整個(gè)代謝途徑中的所有酶都在宿主細(xì)胞中表達(dá)，因此需要多個(gè)不同的啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)不同 基因的表達(dá)。就表達(dá)一種蛋白而言，Α0Χ1和GAP啟動(dòng)子也各自有其缺點(diǎn):GAP啟動(dòng)子為組成型 啟動(dòng)子，不利于表達(dá)對(duì)畢赤酵母細(xì)胞有毒害的蛋白；A0X1啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，但其誘導(dǎo) 劑為甲醇。在生產(chǎn)外源蛋白時(shí)如有甲醇?xì)埩?，將?huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒害。另外，甲醇為易燃易爆 物品，對(duì)生產(chǎn)也有一定的安全隱患。因此，急需建立一種有效的方法分離和鑒定更多的畢赤 酵母啟動(dòng)子，以期使外源基因在畢赤酵母中表達(dá)選擇啟動(dòng)子時(shí)具有更多的靈活性，并且可 以使畢赤酵母同時(shí)利用不同的啟動(dòng)子表達(dá)多個(gè)外源基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供共一種篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)和方法。
[0004] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：提供一種篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)，包括畢赤酵母 菌株和質(zhì)粒載體，所述的畢赤酵母菌株能表達(dá)β半乳糖苷酶C-末端ω肽，所述的β半乳糖苷 酶C-末端ω肽序列為SEQ ID Ν0:1;
[0005] 所述的質(zhì)粒載體含有編碼β半乳糖苷酶Ν-末端α肽的核苷酸序列，所述β半乳糖苷 酶Ν-末端α肽序列為SEQ ID Ν0:3;
[0006] 所述質(zhì)粒載體含有一段用于畢赤酵母基因組DNA插入的Linker DNA序列，其序列 為SEQ ID N0:5,所述Linker DNA序列連接在編碼β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列的 5'端。
[0007] 優(yōu)選的，上述的篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)中，編碼所述β半乳糖苷酶c-末端ω肽 的核苷酸序列為SEQ ID Ν0:2。
[0008] 優(yōu)選的，上述的篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)，其特征在于，編碼所述的β半乳糖苷 酶Ν-末端α肽的核苷酸序列為SEQ ID Ν0:4。
[0009] 本發(fā)明提供的另一技術(shù)方案為:提供一種利用上述篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)篩 選畢赤酵母啟動(dòng)子的方法，將待篩選畢赤酵母基因組DNA和所述質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切后連接， 所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，提取培養(yǎng)后菌體的質(zhì)粒，將所述質(zhì)粒導(dǎo) 入所述畢赤酵母菌株，所述畢赤酵母菌株進(jìn)行培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，若出現(xiàn)藍(lán)色菌落，則待篩選 畢赤酵母基因組DNA含有啟動(dòng)子活性的基因組DNA片段。
[0010]本發(fā)明的有益效果如下：1、本發(fā)明篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)利用β半乳糖苷酶 作為報(bào)告蛋白檢測(cè)畢赤酵母啟動(dòng)子序列，如果有啟動(dòng)子序列存在，將會(huì)驅(qū)動(dòng)β半乳糖苷酶基 因的表達(dá)。β半乳糖苷酶分解無色底物分子5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)產(chǎn)生 不溶性的藍(lán)色不溶產(chǎn)物。在培養(yǎng)平板通過篩查藍(lán)色畢赤酵母菌落就可以很方便的篩選到啟 動(dòng)子序列。由于采用平板上直接觀察顏色的方法進(jìn)行篩選，因此，該方法除簡(jiǎn)便外，還非常 高效。2、本發(fā)明篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)中用于篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體只含有 編碼β半乳糖苷酶N-末端α肽序列。由于編碼β半乳糖苷酶N-末端α肽序列較小，篩選啟動(dòng)子 的質(zhì)粒載體可以插入更大的畢赤酵母基因組DNA片段。因此，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于適合 篩選大片段的畢赤酵母啟動(dòng)子序列。
【具體實(shí)施方式】
[0011]為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式 詳予說明。
[0012] 本發(fā)明關(guān)鍵構(gòu)思在于:本發(fā)明篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)利用β半乳糖苷酶作為 報(bào)告蛋白檢測(cè)畢赤酵母啟動(dòng)子序列，如果有啟動(dòng)子序列存在，將會(huì)驅(qū)動(dòng)β半乳糖苷酶基因的 表達(dá)。β半乳糖苷酶分解無色底物分子5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)產(chǎn)生不溶 性的藍(lán)色不溶產(chǎn)物。在培養(yǎng)平板通過篩查藍(lán)色畢赤酵母菌落就可以很方便的篩選到啟動(dòng)子 序列。由于采用平板上直接觀察顏色的方法進(jìn)行篩選，因此，該方法除簡(jiǎn)便外，還非常高效。
[0013] 本發(fā)明實(shí)施例中用到的材料與方法為：
[0014] 所采用的分子克隆技術(shù)參見J.薩母布魯克等編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
[0015] 分子克隆中所用到的所有工具酶和DNA純化試劑盒均購(gòu)自TaKaRa生物公司（大連， 中國(guó)），具體反應(yīng)條件和使用方法參考其商品說明書。
[0016] 商品化質(zhì)粒pAd/CMV/V5-GW/lacZ、pPICZ A、pGAPZ B，大腸桿菌ΤορΠ/和畢赤酵母 GS115菌株均購(gòu)自Invitrogen公司，畢赤酵母具體遺傳操作技術(shù)參照Invitrogen公司的操 作說明進(jìn)行。
[0017] 實(shí)施例！
[0018] l、pGAPZ B-LacZco 載體的構(gòu)建
[0019] β半乳糖苷酶C-末端ω肽由該酶的143-1019氨基酸組成。所述的β半乳糖苷酶C-末 端ω肽序列為SEQ ID Ν0:1，編碼所述β半乳糖苷酶C-末端ω肽的核苷酸序列為SEQ ID Ν0: 2。設(shè)計(jì)合成了擴(kuò)增編碼β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列的PCR引物L(fēng)acZ ω -F1和LacZ ω -R1，以 含有LacZ基因的質(zhì)粒pAd/CMV/V5-GW/lacZ為模板，使用高保真Primer Star DNA polymerase進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:95°C初始變性5min;94°C變性15s，55°C退火15s，72°C 延伸3min，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmiruPCR反應(yīng)擴(kuò)增得到一條2900bp的DNA片段。用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒回收該P(yáng)CR片段。
[0020] LacZ ω-FI：5'-CCGGAATTCACCATGAACTCGGCGTTTCATCTGT-3'(SEQ ID NO：6)
[0021] LacZ ω-R1：5'-CCGGAATTCTATTTTTGACACCAGACCAACTG-3'(SEQ ID NO：7)
[0022] 用限制性內(nèi)切酶EcoR I分別酶切載體pGAPZ B和PCR的片段，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0膠回收試劑盒分別進(jìn)行回收，并對(duì)回收后的 DNA片段進(jìn)行定量。將EcoR I酶切純化的線性化載體pGAPZ Β和PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化大腸桿菌ΤορΠΤ感受態(tài)細(xì)胞，涂含25μg/ml Zeocin抗菌素的低鹽LB平板（1 %蛋白胨； NaCl 0.5 % ; 0.5%酵母浸提物，1.5 %瓊脂），37°C培養(yǎng)12-16h。挑選若干在平板上長(zhǎng)出的菌 落，用5'A0X1通用引物和LacZco-Rl引物進(jìn)行PCR鑒定，鑒定重組質(zhì)粒中插入片段和方向。鑒 定正確的質(zhì)粒經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序測(cè)定確認(rèn)沒有突變后命名為pGAPZ B-LacZco。
[0023] 2、畢赤酵母菌株Gazll5co的構(gòu)建及其功能
[0024] 1)、用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0質(zhì)粒提取試劑盒提 取質(zhì)粒pGAPZ B-LacZco。用Sal I限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pGAPZ B-LacZco,使其線性化。酚/ 氯仿抽提、乙醇沉淀回收線性化質(zhì)粒。取5-1 Oyg線性化的pGAPZ B-LacZc〇質(zhì)粒加到80yL畢 赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。將混有質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入0.2mL的電轉(zhuǎn)杯并置于冰 浴上。通過電轉(zhuǎn)化儀將質(zhì)粒導(dǎo)入到畢赤酵母GS115細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)化條件為：1500V，25yF，200 Ω。轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母細(xì)胞涂抹到MD篩選平板上，于30°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)2-4d直至菌落 出現(xiàn)。
[0025] MD篩選平板上長(zhǎng)出的畢赤酵母用PCR的方法進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)編碼β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列已整合到畢赤酵母的基因組上。具體方法如下：提取MD平板上長(zhǎng)出的畢赤酵 母菌落基因組DNA。設(shè)計(jì)合成了鑒定β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列的PCR引物L(fēng)acZ ω -F2和 LacZco-R2,以MD平板上長(zhǎng)出的畢赤酵母菌落基因組DNA為模板，使用rTaq DNA聚合酶進(jìn)行 擴(kuò)增。？〇?反應(yīng)條件：95°(：初始變性51^11;94°(：變性308,55°(：退火308,72°(：延伸458,30個(gè)循 環(huán);最后72°C延伸TmiruPCR反應(yīng)擴(kuò)增得到一個(gè)600bp的DNA片段。成功整合有編碼β半乳糖苷 酶C-末端ω肽序列的畢赤酵母命名為Gazll5c〇。
[0026] LacZco-F2:5，-CGGCGTTTCATCTGTGGTGC-3，（SEQ ID N0:8);
[0027] LacZco-R2:5，-GCCGTTCAGCAGCAGCAGAC-3，（SEQ ID N0:9);
[0028] 2)、畢赤酵母菌株Gazll5 ω的功能測(cè)定
[0029] 構(gòu)建能表達(dá)β半乳糖苷酶Ν-末端α肽的表達(dá)載體pPICZ A-LacZaj半乳糖苷酶Ν-末 端a肽由該酶的1-142氨基酸組成。所述β半乳糖苷酶Ν-末端a肽序列為SEQ ID Ν0:3,編碼β 半乳糖苷酶Ν-末端a肽的核苷酸序列為SEQ ID NO:4。
[0030] 設(shè)計(jì)合成了擴(kuò)增編碼β半乳糖苷酶N-末端a肽序列的PCR引物L(fēng)acZa-F和LacZa-R， 以含有LacZ基因的質(zhì)粒pAd/CMV/V5-GW/lacZ為模板，使用高保真Primer Star DNA polymerase進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:95°C初始變性5min;94°C變性15s，58°C退火15s，72°C 延伸308,30個(gè)循環(huán)；最后72°(：延伸71^11。？〇?反應(yīng)擴(kuò)增得到一個(gè)442&?的0嫩片段。用了31^1^ MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒回收該P(yáng)CR片段。
[0031] LacZa-F:5，-CCGGAATTCACCATGATAGATCCCGTCG-3，（SEQ ID N0:10);
[0032] LacZa-R:5，-CGGAATTCTTAAACGCCATCAAAAATAATT-3，（SEQ ID NO:11);
[0033] 用限制性內(nèi)切酶EcoR I分別酶切載體pPICZ A和PCR片段，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0膠回收試劑盒分別進(jìn)行回收，并對(duì)回收后的 DNA片段進(jìn)行定量。將EcoR I酶切純化的線性化載體pPICZ A和PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化大腸桿菌ΤορΠΤ感受態(tài)細(xì)胞，涂含25μg/ml Zeocin的低鹽LB平板，37°C培養(yǎng)12-16h。挑 選若干不平板上長(zhǎng)出的菌落，用5'A0X1通用引物和LacZa-R引物進(jìn)行PCR鑒定，鑒定重組質(zhì) 粒中插入片段和方向。鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序測(cè)定確認(rèn)沒有突變后命名為pPICZ A- LacZa〇
[0034]用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0質(zhì)粒提取試劑盒提取 質(zhì)粒pPICZ A-LacZa。用Sac I限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pPICZ A-LacZa，使其線性化，酚/氯仿 抽提、乙醇沉淀回收線性化質(zhì)粒。取5-10yg線性化的pPICZ A-LacZa質(zhì)粒加到80yL畢赤酵母 Gaz 115 ω感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。將混有質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入〇 . 2mL的電轉(zhuǎn)杯并置于冰浴 上。通過電轉(zhuǎn)化儀將質(zhì)粒導(dǎo)入到畢赤酵母6&2115〇細(xì)胞中（150(^，25以？，200 0)。轉(zhuǎn)化后的 畢赤酵母細(xì)胞涂抹到含320yg/mL X-Gal和100μg/ml Zeocin抗生素的YH)平板上，于30°C恒 溫箱中倒置培養(yǎng)2-4d直至菌落出現(xiàn)。在含X-gal的YH)板上長(zhǎng)藍(lán)色菌落則表明Gaz 115 ω有功 能。
[0035]實(shí)施例2畢赤酵母啟動(dòng)子的篩選
[0036] l、pNP-LacZa 載體的構(gòu)建
[0037] 用Bgl II和EcoR I雙酶切質(zhì)粒pPICZA，去除pPICZA質(zhì)粒上的A0X1啟動(dòng)子序列。用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0膠回收試劑盒回收大分子 量質(zhì)粒DNA片段（即去除A0X1啟動(dòng)子序列質(zhì)粒片段），并對(duì)回收后的DNA片段進(jìn)行定量。設(shè)計(jì) 合成了兩條寡聚脫氧核苷酸單鏈Oligo 1和Oligo 2。將Oligo 1和Oligo 2進(jìn)行退火形成 Linker DNA序列。用于篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體在含有一段用于畢赤酵母基因組 DNA插入的Linker DNA序列，其序列為SEQ ID N0:5,所述的SEQ ID N0:5序列連接在所述的 SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的5'端。退火體系：1μ1 Oligo 1(100μΜ)、1μ1 Oligo 2(100 μΜ)、1μ1 10XT4DNA連接酶緩沖液和7μ1 ddH20。退火參數(shù)：95°C5min，然后溫度以1-5°C/ min的速度下降到室溫。將退火的Linker DNA序列與上述Bglll和EcoR I雙酶切回收純化的 去除了A0X1啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒片段進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ΤορΠΤ感受態(tài)細(xì)胞， 涂含25μg/ml Zeocin的低鹽LB平板，37°C培養(yǎng)12-16h。挑選若干個(gè)平板上長(zhǎng)出的菌落，進(jìn)行 測(cè)序確認(rèn)Linker DNA序列成功連接到去除A0X1啟動(dòng)子序列的pPICZA載體上，構(gòu)建的質(zhì)粒命 名為pNP。
[0038] 以含有LacZ基因的質(zhì)粒pAd/CMV/V5-GW/lacZ為模板，用實(shí)施例1中設(shè)計(jì)合成的PCR 引物L(fēng)acZa-Fl和LacZa-Rl擴(kuò)增LacZa片段。使用高保真Primer Star DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。 卩〇?反應(yīng)條件:95°(：初始變性51^11;94°(：變性158,58°(：退火158,72°(：延伸3〇8,30個(gè)循環(huán) ;最 后72°C延伸TmiruPCR反應(yīng)擴(kuò)增得到一個(gè)442bp的DNA片段。TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒回收該P(yáng)CR片段。
[0039] LacZa-FI：5'-CCGGAATTCACCATGATAGATCCCGTCG-3'(SEQ ID NO：12)；
[0040] LacZa-Rl:5 '-CGGAATTCTTAAACGCCATCAAAAATAATT-3 '（SEQ ID NO:13);
[0041 ] 用限制性內(nèi)切酶EcoR I分別酶切載體pNP和PCR擴(kuò)增片段，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0膠回收試劑盒分別進(jìn)行回收，并對(duì)回收后的 DNA片段進(jìn)行定量。將EcoR I酶切純化后的線性化載體pNP和PCR片段進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化大腸桿菌ΤορΠ /感受態(tài)細(xì)胞，涂含25μg/ml Zeocin的低鹽LB平板，37°C培養(yǎng)12-16h。設(shè)計(jì) 合成鑒定上游引物KS-F。挑選若干個(gè)平板上長(zhǎng)出的菌落，用KS-F引物和LacZa-Rl引物進(jìn)行 PCR鑒定，鑒定重組質(zhì)粒中插入片段和方向。鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序確認(rèn)沒有突變后 命名為pNP-LacZa。
[0042] KS-F：5'-CCTCGAGGTCGACGGTATCG-3'(SEQ ID NO：14)；
[0043] 2、畢赤酵母啟動(dòng)子的篩選
[0044] 提取畢赤酵母GS115基因組DNA。用限制性內(nèi)切酶Bgl II分別酶切質(zhì)粒pNP-LacZa 和畢赤酵母GS115基因組DNA，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，并對(duì)回收后的DNA片段進(jìn)行定量。將酶切后的基因組 DNA和線性化的質(zhì)粒pNP-LacZa進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ΤορΠΤ感受態(tài)細(xì)胞，涂含 25μg/ml Zeocin的低鹽LB平板，37°C培養(yǎng)12-16h。用lml的低鹽LB液體培養(yǎng)基將平板上長(zhǎng)出 的菌落收集。收集到的菌落在含25μg/ml Zeocin的100ml低鹽LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12-16h。用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0質(zhì)粒提取試劑盒提取培養(yǎng) 后菌體的質(zhì)粒。這些重組質(zhì)粒含有不同畢赤酵母GS115基因組DNA片段的混合物。用限制性 內(nèi)切酶Pst I或SnaBI酶切線性化質(zhì)粒，酸/氯仿抽提、乙醇沉淀回收線性化質(zhì)粒。取5-10yg 線性化的質(zhì)粒加到80yL畢赤酵母Gazll5co感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。將混有質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞 轉(zhuǎn)入0.2mL的電轉(zhuǎn)杯并置于冰浴上。通過電轉(zhuǎn)化儀將質(zhì)粒導(dǎo)入到畢赤酵母Gazl 15 ω細(xì)胞中 (1500V，25yF，200 Q )。轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母細(xì)胞涂抹到含320yg/mL X-Gal和100μΙ/ml Zeocin抗生素的YH)平板上，于30°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)2-4d直至菌落出現(xiàn)。
[0045]若在含X-gal的YH)板上長(zhǎng)藍(lán)色菌落，則表明轉(zhuǎn)化到該菌落的pNP-LacZa質(zhì)粒上連 接上了含有啟動(dòng)子活性的基因組DNA片段。用引物KS-F對(duì)該菌落基因組進(jìn)行測(cè)序，確定具有 啟動(dòng)子活性基因組DNA片段序列。
[0046]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng) 域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)，其特征在于，包括畢赤酵母菌株和質(zhì)粒載體，所述 的畢赤酵母菌株能表達(dá)β半乳糖苷酶C-末端ω肽，所述的β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列為 SEQ ID N0：1； 所述的質(zhì)粒載體含有編碼β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列，所述β半乳糖苷酶N-末端α肽序列為SEQ ID NO:3; 所述質(zhì)粒載體含有一段用于畢赤酵母基因組DNA插入的Linker DNA序列，其序列為SEQ ID NO:5,所述Linker DNA序列連接在編碼β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列的5'端。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)，其特征在于，編碼所述β半乳糖 苷酶C-末端ω肽的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)，其特征在于，編碼所述β半乳糖 苷酶Ν-末端α肽的核苷酸序列為SEQ ID NO:4。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的系統(tǒng)篩選畢赤酵母啟動(dòng)子的方法，其 特征在于，將待篩選畢赤酵母基因組DNA和所述質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切后連接，所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，提取培養(yǎng)后所得菌體的質(zhì)粒，將所述質(zhì)粒導(dǎo)入所述畢赤 酵母菌株，培養(yǎng)畢赤酵母菌株至菌落出現(xiàn)，若出現(xiàn)藍(lán)色菌落，則待篩選畢赤酵母基因組DNA 含有啟動(dòng)子活性的DNA片段。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK106086060SQ201610414802
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日 公開號(hào)201610414802.6, CN 106086060 A, CN 106086060A, CN 201610414802, CN-A-106086060, CN106086060 A, CN106086060A, CN201610414802, CN201610414802.6
【發(fā)明人】黃義德, 林堯
【申請(qǐng)人】福建師范大學(xué)