專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有殺線蟲(chóng)功能的側(cè)孢短芽孢桿菌及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲(chóng)功能的側(cè)孢短芽孢桿菌及制備方法和應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲(chóng)是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，僅根結(jié)線蟲(chóng)已知種類(lèi)達(dá)70多種，為害3000多種植物，每年造成的損失巨大。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，每年因線蟲(chóng)造成損失全球高達(dá)1000億美元。我國(guó)線蟲(chóng)主要危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋參等主要經(jīng)濟(jì)作物，成為發(fā)展這些作物的重要限制因子。據(jù)全國(guó)煙草病蟲(chóng)害防治信息中心不完全統(tǒng)計(jì)，2001年全國(guó)煙草根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病面積已達(dá)55萬(wàn)公頃，直接經(jīng)濟(jì)損失5億多元。僅云南省發(fā)病面積就達(dá)2.7萬(wàn)公傾，直接經(jīng)濟(jì)損失1.2億元，間接損失更為嚴(yán)重。黑龍江省僅大豆胞囊線蟲(chóng)每年造成的損失達(dá)8億元之多。松材線蟲(chóng)被稱(chēng)為無(wú)煙森林火災(zāi)，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺(tái)灣、香港等部份地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，有向全國(guó)漫延的趨勢(shì)。在山東、廣東、海南和云南等蔬菜主產(chǎn)區(qū)，蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)呈上升趨勢(shì)。如山東的黃瓜因大量施用化學(xué)殺線蟲(chóng)劑后造成食用者腹瀉、貴州省西洋參因嚴(yán)重發(fā)生根結(jié)線蟲(chóng)而只好停產(chǎn)。更嚴(yán)重的是由于根結(jié)線蟲(chóng)侵染后，造成作物傷口，致使作物根部病害嚴(yán)重發(fā)生。云南的三七根腐就是典型例子。化學(xué)殺線蟲(chóng)劑自上個(gè)世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在線蟲(chóng)防治中發(fā)揮了重要作用。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)許多化學(xué)殺線蟲(chóng)劑均有副作用，造成環(huán)境污染，危害人體健康。相繼有不少被禁用或即將禁用。特別是植物寄生線蟲(chóng)發(fā)生于作物根部，由于土壤環(huán)境的特殊性，必須大劑量施用才能保證其防效。而大劑量化學(xué)農(nóng)藥對(duì)地下水污染非常嚴(yán)重。因此，研究開(kāi)發(fā)高效低毒低殘留殺線蟲(chóng)劑已經(jīng)是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的重要課題。
側(cè)孢短芽孢桿菌是一類(lèi)好氧的，可形成芽孢的細(xì)菌。前期研究表明，側(cè)孢短芽孢桿菌可在其生活史中形成伴孢晶體而具有殺蟲(chóng)功能。而伴孢晶體的主要成份是殺蟲(chóng)晶體蛋白，殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)害蟲(chóng)具有良好毒殺功能。但在側(cè)孢短芽孢桿菌中，不產(chǎn)生伴孢晶體，通過(guò)酶、毒蛋白或其他毒肽而產(chǎn)生殺蟲(chóng)功能目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)對(duì)一株具有產(chǎn)生酶而分解線蟲(chóng)功能的側(cè)孢短芽孢桿菌研究，開(kāi)發(fā)生物殺線蟲(chóng)劑。
本發(fā)明篩選到的一株對(duì)植物寄生線蟲(chóng)具有很好殺蟲(chóng)功能的側(cè)孢短芽孢桿菌Brevibacillus laterosporus G4，G4菌株已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)；保藏日期2003年6月2日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CCTCC NOM203045。
本發(fā)明Brevibacillus laterosporus G4菌株形態(tài)特征為長(zhǎng)桿狀，個(gè)體較大，兩端鈍圓，多以凝集形式存在。在YPD平板培上菌落呈圓形、隆起、邊緣較整齊，表面無(wú)光澤、粗糙、類(lèi)似細(xì)小粉末狀，菌苔白色。在YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)36小時(shí)以上可見(jiàn)極少數(shù)的內(nèi)生孢子形成或釋放到胞外的芽孢，在NA或LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12-16小時(shí)，便可見(jiàn)大量脫落的芽孢，芽孢為橢圓形呈獨(dú)木舟狀體。G4菌株與其他具有殺蟲(chóng)功能的側(cè)孢短芽孢桿菌最大的差別是不形成伴孢晶體，其具有的殺線蟲(chóng)功能主要由蛋白、酶等成份構(gòu)成的。其殺線蟲(chóng)機(jī)制理也完全不同。G4首先形成粗蛋白分解線蟲(chóng)體壁，通過(guò)體壁侵入線蟲(chóng)體內(nèi)，最終將線蟲(chóng)全部分解。在整個(gè)殺線蟲(chóng)過(guò)程中，伴隨著產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶對(duì)線蟲(chóng)的作用，其毒力顯著高于同類(lèi)側(cè)孢短芽孢桿菌。
本發(fā)明人在開(kāi)展殺線蟲(chóng)堿性胞外蛋白酶研究中，從構(gòu)建的基因工程菌中分離出一株側(cè)孢短芽孢桿菌G4，發(fā)現(xiàn)其對(duì)線蟲(chóng)具極高的殺蟲(chóng)活性。將菌株純化后進(jìn)行多批次殺線蟲(chóng)活性試驗(yàn)后，委托武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，確定為側(cè)孢短芽孢桿菌Brevibacillus laterosporus G4。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的擴(kuò)大培養(yǎng)G4菌株，提取殺線蟲(chóng)有效成分，進(jìn)行殺線蟲(chóng)藥效試驗(yàn)，確定其對(duì)線蟲(chóng)的作用。
G4培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)1、試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為1-3％酵母浸膏，0.5-2％蛋白胨；1-4％葡萄糖；1.8-2％瓊脂；pH6-7。將G4菌絲體接種到培養(yǎng)基上，28-32℃下培養(yǎng)1-4天，獲得試管種；2、液體擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配方為1-3％酵母粉；10-20％大豆餅粉；0.5-2％魚(yú)粉；1-4葡萄糖；pH6-7，余下為水。將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝100ml，于25-35℃下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間2-5天，轉(zhuǎn)速為200-300rpm。
3、提取殺線蟲(chóng)活性成份將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用50mM磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于10-20倍的50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時(shí)，即得殺線蟲(chóng)藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
G4殺線蟲(chóng)活性試驗(yàn)1、制備試驗(yàn)用藥劑按前述液體擴(kuò)大培養(yǎng)方法培養(yǎng)G4菌株，按前述提取殺線蟲(chóng)活性成份的方法制備試驗(yàn)用藥劑。
2、制備對(duì)照用藥劑對(duì)照1前述1制備試驗(yàn)用藥劑方法制備對(duì)照用藥劑，但培養(yǎng)基中不接入G4菌株。
對(duì)照2以清水作為對(duì)照。
對(duì)照3為了證明殺線蟲(chóng)有效成份是蛋白，將制備供試藥劑煮沸滅活后作為對(duì)照。
2、制備試驗(yàn)用線蟲(chóng)(1)制備Panagrellus redivivus線蟲(chóng)將P.redivivus線蟲(chóng)接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲(chóng)用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無(wú)菌水洗滌，瞬時(shí)離心，棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲(chóng)。用無(wú)菌水將線蟲(chóng)稀釋為含量為15條/μl的線蟲(chóng)懸浮液。
(2)制備松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g經(jīng)水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養(yǎng)4至7天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經(jīng)0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲(chóng)，28℃培養(yǎng)15至20天。用無(wú)菌水將線蟲(chóng)洗下，制成含量為15條/μl的線蟲(chóng)懸浮液。
3、試驗(yàn)方法(1)藥效試驗(yàn)方法取試驗(yàn)用藥劑200μl于1.5ml離心管中，加入活線蟲(chóng)150條，離心管平放，置于25℃下，Panagrellus redivivus線蟲(chóng)分別于12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)；松材線蟲(chóng)分別于24小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)檢查計(jì)算線蟲(chóng)的死亡率。并在光學(xué)顯微鏡下觀察，觀察線蟲(chóng)體壁變化情況鑒定死亡的方法為在處理離心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲(chóng)僵直，活蟲(chóng)則卷曲或扭動(dòng)。
分別用3種對(duì)照藥劑，每處理重復(fù)三次。
(2)G4分解線蟲(chóng)觀察試驗(yàn)將活線蟲(chóng)用試驗(yàn)用藥劑于25℃下分別處理12小時(shí)與24小時(shí)，將處理后的樣品用PBS緩沖液沖洗三次，用3％戊二醛與餓酸固定，用梯度甘油置換出水分，乙酸乙酯再次置換，真空冷凍干燥，鍍金膜，最后固定在載片上，用掃描電鏡觀察(SEM)。用對(duì)照藥劑同期處理觀察。

4、試驗(yàn)結(jié)果表1 G4對(duì)Panagrellus redivivus線蟲(chóng)殺蟲(chóng)效果

表2 G4對(duì)松材線蟲(chóng)殺蟲(chóng)效果

結(jié)果表明，從G4菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取的試驗(yàn)用藥劑對(duì)Panagrellus redivivus線蟲(chóng)和松材線蟲(chóng)均具較好的殺蟲(chóng)效果，線蟲(chóng)的平均死亡率在95％以上。從處理線蟲(chóng)的變化來(lái)看，經(jīng)歷了從部份體壁溶解(圖3)到蟲(chóng)體全部溶解的過(guò)程(圖1)，說(shuō)明活性成份主為要分解線蟲(chóng)的酶類(lèi)。而將同批提取的試驗(yàn)用藥劑經(jīng)過(guò)煮沸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性后，其殺線蟲(chóng)活性非常小，且線蟲(chóng)體壁不出現(xiàn)溶解現(xiàn)象，這也證明了G4對(duì)線蟲(chóng)的活性成份主要為酶類(lèi)。
本發(fā)明G4菌株是一類(lèi)明顯區(qū)別于其他產(chǎn)生伴孢晶體的側(cè)孢短芽孢桿菌，其主要作用成份是酶，對(duì)線蟲(chóng)特別是松材線蟲(chóng)的毒力顯著高于目前其他所發(fā)現(xiàn)的同類(lèi)微生物。同時(shí)G4菌株在本發(fā)明培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)極快，具備了很好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。


圖1顯示處理線蟲(chóng)分解情況。
圖2顯示蟲(chóng)體保持完好的對(duì)照線蟲(chóng)。
圖3顯示處理線蟲(chóng)頭部分解情況。
圖4顯示頭部保持完好的對(duì)照線蟲(chóng)。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例一將Brevibacillus laterosporus G4菌體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為2％酵母浸膏，1.5％蛋白胨；2％葡萄糖；1.8％瓊脂；pH7。將G4菌絲體接種到培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2天，獲得試管種。
將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中(每瓶裝100ml)，液體培養(yǎng)基配方為2％酵母粉；15％大豆餅粉；1％魚(yú)粉；3％葡萄糖；pH7，余下為水。于30℃下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間3天，轉(zhuǎn)速為220rpm。
將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用50mM磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于10-20倍的50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時(shí)，即得殺線蟲(chóng)藥液。
實(shí)施例二基本同實(shí)施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為3％酵母粉；10％大豆餅粉；2％魚(yú)粉；1％葡萄糖。
實(shí)施例三基本同實(shí)施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為1％酵母粉；20％大豆餅粉；0.5％魚(yú)粉；4％葡萄糖。
權(quán)利要求
1.一種具有殺線蟲(chóng)功能的側(cè)孢短芽孢桿菌，其特征在于該側(cè)孢短芽孢桿菌為Brevibacillus laterosporus G4，G4菌株已于2003年6月2日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NOM203045。
2.一種具有殺線蟲(chóng)功能的側(cè)孢短芽孢桿菌的制備方法，由常規(guī)液體發(fā)酵方法擴(kuò)大培養(yǎng)，其特征在于2.1液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方1-3％酵母粉；10-20％大豆餅粉；0.5-2％魚(yú)粉；1-4葡萄糖；pH7，余下為水；2.2從液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取殺線蟲(chóng)有效成分的方法是將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清，用50mM磷酸緩沖液重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋于10-20倍的50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時(shí)。
3.權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的側(cè)孢短芽孢桿菌，其特征在于該桿菌對(duì)Panagrellus redivivus線蟲(chóng)和松材線蟲(chóng)具有毒殺作用，可以應(yīng)用于植物寄生線蟲(chóng)生防。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲(chóng)功能的側(cè)孢短芽孢桿菌及其制備方法和應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株為Brevibacillus laterosporus G4，采用常規(guī)方法制備，其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為1－3％酵母粉；10－20％大豆餅粉；0.5－2％魚(yú)粉；1－4葡萄糖；pH7，余下為水。從液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取殺線蟲(chóng)有效成分的方法是，將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清，用50mM磷酸緩沖液重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋于10－20倍的50mM磷酸緩沖液中透析3－4次，每次3小時(shí)。本發(fā)明菌株通過(guò)液體發(fā)酵后，從代謝產(chǎn)物中提取殺線蟲(chóng)有效成分，制備為生物殺線劑。本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)松材線蟲(chóng)具有毒力高的優(yōu)點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1490398SQ0313560
公開(kāi)日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2003年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者張克勤, 田寶玉, 周薇 申請(qǐng)人:云南大學(xué)