一種異尖線蟲蟲體過敏原pcr檢測技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種異尖線蟲蟲體過敏原PCR檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 異尖科線蟲是魚類寄生線蟲中最大的科，成蟲寄生在海洋哺乳動物的體內(nèi)，幼蟲 寄生在魚類或軟體動物中，人食入含有活的某些異尖科線蟲幼蟲的食物，可引起異尖線蟲 病。
[0003] 隨著吃海鮮、海產(chǎn)加工品等飲食時尚的興起和漁業(yè)、旅游業(yè)的發(fā)展，異尖線蟲作為 海產(chǎn)食品中的一種重要的食源性寄生蟲病，對人們生命健康存在在著巨大威脅。不僅活的 異尖線蟲蟲體可以引起異尖線蟲病導致急腹癥和過敏癥，引發(fā)蕁麻瘆過敏性反應，嚴重的 可引起死亡案例。由于異尖線蟲蟲體中含有許多耐熱性、耐胃蛋白酶活性的過敏原，經(jīng)高溫 和胃液處理的死亡蟲體也可以引起過敏反應。Shimakura用凝膠過濾，快速液相色譜和反 相高效液相色譜法異尖線蟲幼蟲中提純純化出1種分子量為21kDa的熱穩(wěn)定性過敏原，7/8 的病人對其有過敏反應。Moneo在異尖線蟲幼蟲E/S蛋白質(zhì)中提取出了一種分子量為9kDa 的熱穩(wěn)定性過敏原，將其加熱后，一些病人仍然對其有反應。因此即使食用了經(jīng)過高溫處理 的含有蟲體成分的魚或罐裝產(chǎn)品也會出現(xiàn)過敏性癥狀。
[0004] 2006年Armentia等報道了一起人由于食用雞肉造成的異尖線蟲過敏癥的病例， 由于現(xiàn)在的食品加工業(yè)用到的魚粉是在高溫下制作的，說明此病例是由于耐熱性的過敏原 引起的。
[0005] 異尖線蟲在海產(chǎn)魚類和頭足類等中普遍存在，寄生于內(nèi)臟和肌肉之中。由于異尖 線蟲蟲體顏色較魚肉相近，在魚類和頭足類肉制品加工中極有可能混入魚肉原料，經(jīng)過高 溫煎炸加工制成各種各樣產(chǎn)品，如魚糜、魚罐頭、魚丸、魚肉排、魚肉腸、腌制魚、煙熏魚等產(chǎn) 品。但因為這些產(chǎn)品中含有異尖線蟲蟲體過敏原，所以食用這些產(chǎn)品極大可能導致過敏癥 發(fā)生。
[0006] 我國東接渤海、黃海、東海、南海四大海域，海洋漁產(chǎn)豐富，海岸線上人群密集，且 居民素有食用海洋食品品的習慣，海產(chǎn)品及其加工品消費量巨大，其健康安全與否危及千 家萬戶，由于其異尖線蟲蟲體成分所引起的過敏性癥狀和其他癥狀非常相似，單憑臨床診 斷較為困難，而且也極易引起誤診和漏診。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于為了解決現(xiàn)有由于異尖線蟲蟲體成分所引起的過敏性癥狀難 以確診的缺陷而提供一種高質(zhì)量的異尖線蟲蟲體成分檢測方法可以降低異尖線蟲傳給人 類的風險一種異尖線蟲蟲體過敏原PCR檢測技術(shù)。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種異尖線蟲蟲體過敏原PCR檢測技術(shù)，包括如下步驟： a)對異尖線蟲DNA提取； b) 引物設計： 上游引物 ANISAKIS COI F:5' 一GGKCYATTAAYTYTATRACWACTAC-3'（SEQ ID N0.1) 下游引物 ANISAKIS COI R5' 一AAAGAWGTATTMARRTTACGRTCVG-3'（SEQ ID N0.2) 退火溫度為54. 5°C，預期擴增片段大小為178bp ; c) 對步驟b)的引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠上電泳，觀察結(jié)果； d) 分別進行特異性試驗、敏感性試驗進行驗證。
[0009] 作為優(yōu)選，步驟a)中DNA提取是將甘油中保存的異尖線蟲用蒸餾水洗凈后，應用 Wizard'1* Magnetic DNA Purification System for Food 試劑盒進行 DNA 的提取。
[0010] 作為優(yōu)選，步驟C)中PCR反應體系各試劑加入量為：10XPCR buffer 2 μ L、 dNTPL 6 μ L、上游引物 0· 4 μ L、下游引物 0· 4 μ L、DNA 模板 I μ L、ddH20 14 μ L、Taq 酶 0· 1 μ L，總體積 20 μ L。
[0011] 作為優(yōu)選，擴增程序：94°C 5min - 94°C 30sec，54°C 30sec，72°C lmin，30 個循環(huán) -72°C lOmin。應用設計的引物對異尖線蟲DNA進行PCR反應。
[0012] 作為優(yōu)選，特異性試驗為以簡單異尖線蟲代表異尖科線蟲，提取DNA，分別用顎口 線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲和魚肉DNA作對照，按步驟b)與c)的PCR檢測方法進行擴增，瓊脂糖 凝膠電泳分析結(jié)果。
[0013] 作為優(yōu)選，敏感性試驗是以3. 6ng/ μ L的簡單異尖線蟲DNA為模板，連續(xù)十倍濃度 梯度稀釋，稀釋次數(shù)為8次，將不同濃度的DNA進行PCR擴增，電泳分析結(jié)果。
[0014] 作為優(yōu)選，魚肉取自帶魚、馬鮫魚、鯖魚、秋刀魚、竹莢魚、黃鲇魚、黑線鱈魚、黑鯛 魚與黑盲鰻。
[0015] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明建立了的PCR檢測體系，通過該方法的建立來彌補形態(tài)學及免疫學檢測的缺 陷，提高檢測方法的特異性及敏感性，可以用于檢測含有過敏原蟲體的魚或魚加工產(chǎn)品檢 測，并為其生活史、傳播方式及危害程度的研宄提供有效的技術(shù)支撐。
【附圖說明】
[0016] 圖1是本發(fā)明特異性試驗的電泳圖。圖中，M :IOObp DNA Marker ;1:簡單異尖線 蟲；2 :顎口線蟲；3 :捻轉(zhuǎn)血矛線蟲；4-11 :帶魚、馬鮫魚、鯖魚、秋刀魚、竹莢魚、黃鲇魚、黑 線鱈魚、黑鯛魚、黑盲鰻。
[0017] 圖2是本發(fā)明敏感性試驗的電泳圖。
[0018] 圖中，M :100bp DNA Marker ;1 :360pg/yL 簡單異尖線蟲 DNA ;2 :36pg/yL 線 蟲 DNA ;3 :3. 6pg/ μ L 線蟲 DNA ;4 :0· 36pg/ μ L 線蟲 DNA ;5 :0· 036pg/ μ L 線蟲 DNA ;6 : 0· 0036pg/ μ L 線蟲 DNA ;7 :0· 00036pg/ μ L 線蟲 DNA ;8 :0· 000036pg/ μ L。
【具體實施方式】
[0019] 下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。應當理解，本發(fā) 明的實施例并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將 落入本發(fā)明保護范圍。
[0020] 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0021] 魚體與線蟲來源：黑線鱈魚、帶魚、鯖魚、安康魚樣品和A. typica(典型異尖線 蟲）、Pseudoterranova decipiens (偽地新線蟲）、A. physeteris (抹香鯨異尖線蟲）、 A. simplex (簡單異尖線蟲）、R. trichiuri (針蛔線蟲）、C. muraenesoxi (灰海饅對盲囊線 蟲）、顎口線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲等蟲體由舟山出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務中心動植物實 驗室保存。
[0022] Wizard1* Magnetic DNA Purification System for Food 試劑盒、10 XPCR Buffer、dNTP、Taq酶和限制性內(nèi)切酶BamH I，Hindm試劑，T4DNA連接酶購自Takara公 司；DNA片斷回收試劑盒為東盛公司產(chǎn)品；pMD18-T載體購自上海生工生物技術(shù)公司。
[0023] 實施例 一種異尖線蟲蟲體過敏原PCR檢測技術(shù)，包括如下步驟： a) 對