專(zhuān)利名稱(chēng)：總狀共頭霉代謝物及其殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于開(kāi)發(fā)新型殺線(xiàn)蟲(chóng)生物農(nóng)藥的研究與應(yīng)用，特別涉及總狀共頭霉代謝物殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分的分離純化方法。
背景技術(shù)：
植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)是植物病害的重要病原物之一，由于其危害日趨嚴(yán)重，對(duì)農(nóng)作物生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，每年由于植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)危害造成全球農(nóng)作物方面的損失高達(dá)1000億美元(Sasser & Freckman，1987)，占整個(gè)病蟲(chóng)害引起損失的2/3，已成為全世界農(nóng)作物產(chǎn)量的一個(gè)不容忽視的限制性重要因素，引起了世界各國(guó)的高度重視。我國(guó)所處的地理位置適于線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖，世界性重要植物線(xiàn)蟲(chóng)病害在我國(guó)均有發(fā)生。尤其是隨著耕作制度的改革和復(fù)種指數(shù)的提高，大豆、蔬菜、小麥、水稻、花生、果樹(shù)等植物的線(xiàn)蟲(chóng)病害發(fā)生危害越來(lái)越嚴(yán)重，損失也日益嚴(yán)重。如大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)在我國(guó)的發(fā)生面積常年在2000萬(wàn)畝以上，造成產(chǎn)量損失15-20％，嚴(yán)重的達(dá)50-80％以上；蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)在保護(hù)地中造成的損失達(dá)20-30％，嚴(yán)重地可達(dá)70％，甚至絕產(chǎn)；花生根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病在山東發(fā)生有40多年歷史，對(duì)花生產(chǎn)量影響極大，嚴(yán)重的減產(chǎn)70-80％；目前被稱(chēng)為“松樹(shù)癌癥”的松材線(xiàn)蟲(chóng)病在我國(guó)的發(fā)生呈蔓延擴(kuò)散的趨勢(shì)，松材線(xiàn)蟲(chóng)肆虐，在距著名風(fēng)景區(qū)黃山70公里的地方已有松材線(xiàn)蟲(chóng)危害而引起我國(guó)政府的高度關(guān)注；特別是植物線(xiàn)蟲(chóng)與細(xì)菌、真菌、病毒等多種病原物共同作用造成對(duì)植物的復(fù)合侵染，其危害更嚴(yán)重、損失更大。植物線(xiàn)蟲(chóng)病害使我國(guó)各種作物年平均產(chǎn)量損失達(dá)10-15％。
目前化學(xué)農(nóng)藥仍然是控制植物線(xiàn)蟲(chóng)病重要的措施之一，但殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的品種甚少，全世界約30種，常用的不過(guò)10余種。有的殺線(xiàn)蟲(chóng)劑被發(fā)現(xiàn)有致畸、致癌、導(dǎo)致不育等劇毒作用，被撤消注冊(cè)商標(biāo)、禁止停用，有的在被重新審查。由于缺乏有效和安全的殺線(xiàn)蟲(chóng)劑，現(xiàn)有化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑多為劇毒農(nóng)藥，用量高，花費(fèi)大，且?guī)?lái)人畜中毒、污染地下水源及食品等嚴(yán)重問(wèn)題，而生物防治能避免上述問(wèn)題，因此線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治日益受到世界各國(guó)的普遍重視(Robin N.Heuttel，1996)，成為線(xiàn)蟲(chóng)病害防治研究的重點(diǎn)和熱門(mén)。
當(dāng)前線(xiàn)蟲(chóng)生防存在的主要問(wèn)題是1.目前，線(xiàn)蟲(chóng)生防中研究最多的生防因子有捕食線(xiàn)蟲(chóng)真菌、內(nèi)寄生真菌和寄生性細(xì)菌等活菌制劑，作為第一代線(xiàn)蟲(chóng)生防制劑的活菌劑存在著受環(huán)境因素影響大、穩(wěn)定性較差、貨架期短等問(wèn)題，使其應(yīng)用受到限制；2.國(guó)際上十分重視對(duì)微生物的次生代謝產(chǎn)物的研究，將其視為第二代線(xiàn)蟲(chóng)生防因子。由于它克服了第一代線(xiàn)蟲(chóng)生防制劑的活菌劑存在的問(wèn)題，所以是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱門(mén)領(lǐng)域。但是，目前已發(fā)現(xiàn)的殺線(xiàn)蟲(chóng)代謝物大多為脂溶性，水中溶解度較差，需加增效劑來(lái)助溶，給實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)困難。水溶性線(xiàn)蟲(chóng)生防代謝產(chǎn)物，使用方便，但已報(bào)道的水溶性制劑不多，而且分離上有一定的難度。
高效的分離純化技術(shù)歷來(lái)是開(kāi)發(fā)生物活性物質(zhì)的瓶頸。代謝產(chǎn)物中的活性組分的分離純化，是確定其含量、活性強(qiáng)度、生物學(xué)和理化性質(zhì)的前提，有助于今后對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)改造、調(diào)控，開(kāi)發(fā)一類(lèi)新型殺線(xiàn)蟲(chóng)活性物質(zhì)，可為開(kāi)發(fā)微生物活性菌株打下良好的基礎(chǔ)。因此，目前急需篩選高效廣譜殺線(xiàn)蟲(chóng)活性物質(zhì)產(chǎn)生菌以及其代謝產(chǎn)物中的殺蟲(chóng)活性組分(特別是水溶性組分)的分離純化方法，以便盡快開(kāi)發(fā)新型殺線(xiàn)蟲(chóng)生物制劑，這是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明克服了由于其水溶性好，分離困難的問(wèn)題；提供了總狀共頭霉代謝物殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組份的分離與純化的方法，獲得了殺線(xiàn)蟲(chóng)活性高、殺蟲(chóng)譜廣、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性的新型殺線(xiàn)蟲(chóng)生物制劑；首次證明該菌代謝物中殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組份含帶兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸和具有新型結(jié)構(gòu)的8配位鉀的乙二酸配合物，為今后利用該菌開(kāi)發(fā)新型殺線(xiàn)蟲(chóng)生物制劑及殺蟲(chóng)機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。此項(xiàng)研究對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治以及微生物農(nóng)藥的研制開(kāi)發(fā)具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)方案活性菌株總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum)的代謝產(chǎn)物中，殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分的基本組成為帶兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸、8配位鉀的乙二酸配合物、氨基化合物和其它有機(jī)酸；活性組分含量之和為100％；其中帶兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸、8配位鉀的乙二酸配合物和其它有機(jī)酸含量之和不小于80％，且其之間的含量比為(2.5-3.5)∶(1.8-2.5)∶(1.5-2.5)；其它有機(jī)酸包括酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸，其三者含量之和，占其它有機(jī)酸含量的90-95％。此外還含丙二酸等。
該代謝物的活性成分8配位鉀的乙二酸配合物，為一種新型結(jié)構(gòu)物，其分子式為K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2，結(jié)構(gòu)如圖1所示，兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸分子式為(H2C2O4)(H2O)2；該生防菌代謝物的特性溶解性為水溶性，并能以任意比溶于水；熱穩(wěn)定性121℃處理15-20min，基本不失活；生物活性1ml發(fā)酵原液作用于1500條松材線(xiàn)蟲(chóng)，線(xiàn)蟲(chóng)死亡率為100％；將發(fā)酵原液稀釋一倍后，取1ml作用于1500條松材線(xiàn)蟲(chóng)，線(xiàn)蟲(chóng)死亡率為70-95％；殺線(xiàn)蟲(chóng)譜；它可廣泛用于松材線(xiàn)蟲(chóng)、根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)、甘薯莖線(xiàn)蟲(chóng)重要植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)病害的生物防治。
殺線(xiàn)蟲(chóng)生防菌代謝物的制備方法，是以活性菌株總狀共頭霉(Syncephalastrumracemosum)為菌種，通過(guò)液體培養(yǎng)制備出活性代謝產(chǎn)物，然后進(jìn)行劑型加工制得；具體步驟如下●菌種的培養(yǎng)菌株斜面保存使用馬鈴薯蔗糖麥芽精培養(yǎng)基即PSM培養(yǎng)基；斜面菌種26℃靜置培養(yǎng)6-7天，然后放入4℃冰箱保存；●活性代謝物的制備將上述斜面菌種，進(jìn)行液體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)選擇PSM培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖PS培養(yǎng)基、普通蛋白胨蔗糖培養(yǎng)基、馬鈴薯甘油培養(yǎng)基中的一種；初始pH可調(diào)范圍3.5-8；再經(jīng)真空抽濾，獲得含活性代謝物的發(fā)酵原液；
液體培養(yǎng)從下述兩種方法中任選一種1).搖瓶培養(yǎng)用無(wú)菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，以每75-125毫升液體培養(yǎng)基中加入104-107孢子，轉(zhuǎn)速120-220rpm，培養(yǎng)4-6天；2).發(fā)酵罐發(fā)酵首先進(jìn)行一級(jí)種子的制備，即用無(wú)菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，以每100毫升液體培養(yǎng)基中加入106孢子，26℃，pH4-6，靜置或者170rpm振蕩培養(yǎng)21-30小時(shí)；然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種3-5％的一級(jí)種子，26℃，通氣攪拌，發(fā)酵36-68h，發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)間也可以是45-60h。通氣量為1∶0.5-1∶0.75，轉(zhuǎn)速為300-350rpm；●劑型加工將上述獲得含活性代謝物的發(fā)酵原液，按照下述一種方法進(jìn)行處理A.發(fā)酵原液可直接作為殺線(xiàn)蟲(chóng)生防制劑使用；B.濃縮液發(fā)酵原液經(jīng)過(guò)薄膜蒸發(fā)，制備成濃縮水劑；C.粗制粉劑發(fā)酵原液經(jīng)真空冷凍干燥制得。
需要說(shuō)明的是，液體培養(yǎng)基選用馬鈴薯蔗糖麥芽精培養(yǎng)基(PSM培養(yǎng)基)即300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖，麥芽精2g/L；或馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PS培養(yǎng)基)即200-300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖；初始pH為4-6。
搖瓶培養(yǎng)也可以用無(wú)菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，以每100毫升液體培養(yǎng)基中加入104-6孢子，轉(zhuǎn)速120-170rpm，培養(yǎng)4-6天；并采用下述三種方法中的任意一種培養(yǎng)方式A.26℃靜置培養(yǎng)6-7天；B.溫度為26℃，用120-220rpm搖床培養(yǎng)4-6天(以104-106孢子數(shù)接種于20020的PS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的初始pH為4-6，26℃，搖床轉(zhuǎn)速170rpm培養(yǎng)4d為宜)；C.從28-18℃，170rpm搖床變溫培養(yǎng)4-7天。
該代謝物具有殺線(xiàn)蟲(chóng)的廣譜性，可用于松材線(xiàn)蟲(chóng)、根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)、甘薯莖線(xiàn)蟲(chóng)、重要植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)病害的生物防治。另外，該活性菌株的代謝物不僅對(duì)松樹(shù)、甘薯、番茄、大豆等重要植物的寄生線(xiàn)蟲(chóng)表現(xiàn)了其殺線(xiàn)蟲(chóng)的廣譜性，此外還可用于黃瓜、芹菜等蔬菜寄生線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治。
熱穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)將獲得的活性菌株發(fā)酵液，放在高壓滅菌鍋中，在121℃、1.5大氣壓下，滅菌20min，然后測(cè)定其生物活性，與未滅菌發(fā)酵液生物活性相比，僅降低2％左右，證明該活性代謝物具有熱穩(wěn)定性。
發(fā)酵濾液生物活性檢測(cè)方法用松材線(xiàn)蟲(chóng)作為供試線(xiàn)蟲(chóng)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中依次加入0.2ml發(fā)酵液的1/2濃度濾液和0.02ml線(xiàn)蟲(chóng)懸液(含線(xiàn)蟲(chóng)300條)，26℃培養(yǎng)一定時(shí)間用解剖鏡觀(guān)察統(tǒng)計(jì)線(xiàn)蟲(chóng)死亡率，發(fā)酵液活性以殺線(xiàn)率％表示，殺線(xiàn)率％＝{1-游動(dòng)線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)/線(xiàn)蟲(chóng)總數(shù)}*100％-空白對(duì)照死亡率。
總狀共頭霉代謝產(chǎn)物殺線(xiàn)蟲(chóng)活性物質(zhì)的分離純化本發(fā)明采用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)、重結(jié)晶、弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離方法，經(jīng)過(guò)紫外、紅外光譜及X射線(xiàn)單晶衍射和高效液相色譜進(jìn)行分析鑒定，確定了殺蟲(chóng)活性組分中含有機(jī)酸，其中主要為乙二酸，還有蘋(píng)果酸、酒石酸、乳酸；經(jīng)重結(jié)晶技術(shù)得到單晶化合物完成了結(jié)構(gòu)鑒定。分別為含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸及8配位鉀的乙二酸配合物。
總狀共頭霉代謝產(chǎn)物殺線(xiàn)蟲(chóng)活性物質(zhì)的分離純化工藝 分離純化的具體方法(1)殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分單晶的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)酵濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮10-20倍后，有晶體物質(zhì)析出，將析出的晶體在60-80℃下溶解后，冰箱冷藏室中或室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到一個(gè)單晶；室溫下進(jìn)行重結(jié)晶得到另一個(gè)單晶；經(jīng)熔點(diǎn)、紫外、紅外光譜測(cè)定以及X射線(xiàn)晶體衍射進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，證明前者為含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸，其分子式為(H2C2O4)(H2O)2，后者為8配位鉀的乙二酸配合物，其分子式為K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1；二者均有殺線(xiàn)蟲(chóng)活性，兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶最低有效劑量即MED為2mg/ml，殺蟲(chóng)活性為83％，單晶8配位鉀的乙二酸配合物的最低有效劑量MED為4mg/ml，殺蟲(chóng)活性為76％。
(2)濾液中有機(jī)酸的分離和鑒定離子交換柱層析將發(fā)酵濾液用弱堿性陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行初步分離，上樣量10-15ml，用水或添加0.15mol/L的氯化鈉溶液平衡柱，再依次用水和稀氨水進(jìn)行洗脫，流速0.5ml/min-1.5ml/min，分部收集到不同含量的有機(jī)酸樣品，再經(jīng)高效液相分析，酸性物質(zhì)包括大量的乙二酸，和酒石酸，蘋(píng)果酸，乳酸。
有益效果本發(fā)明本發(fā)明克服了由于其水溶性好，分離困難的問(wèn)題；對(duì)一株總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum)產(chǎn)生的水溶性殺線(xiàn)蟲(chóng)代謝物的主要活性組分，進(jìn)行分離純化。解決了總狀共頭霉代謝物殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組份的分離與純化方法的問(wèn)題，獲得了一種殺線(xiàn)蟲(chóng)活性高、殺蟲(chóng)譜廣、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性的新型殺線(xiàn)蟲(chóng)生物制劑，首次證明該菌代謝物中殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組份含帶兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸和具有新型結(jié)構(gòu)的8配位鉀的乙二酸配合物。本發(fā)明對(duì)總狀共頭霉代謝物的殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分進(jìn)行分離純化，確定其含量、活性強(qiáng)度、生物學(xué)和理化性質(zhì)，有助于今后對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)改造、調(diào)控、利用該菌進(jìn)行殺蟲(chóng)機(jī)理研究以及開(kāi)發(fā)新型殺線(xiàn)蟲(chóng)生物制劑奠定了基礎(chǔ)。對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治以及微生物農(nóng)藥的研制開(kāi)發(fā)，有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。


圖18配位鉀的乙二酸配合物的結(jié)構(gòu)圖圖28配位鉀的乙二酸配合物的紅外譜圖；圖3 發(fā)酵原液的高效液相色譜4 乙二酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜5 蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜6 發(fā)酵原液經(jīng)離子交換柱分離后并改變高效液相分析條件得到的色譜7 與圖6相同分析條件下，酒石酸的高效液相色譜圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1總狀共頭霉液態(tài)通氣攪拌發(fā)酵生產(chǎn)抗線(xiàn)蟲(chóng)活性物質(zhì)的方法，包括以下步驟發(fā)酵原液的制備 以一株總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum)為菌種，經(jīng)過(guò)活化后，用無(wú)菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，接種于100ml PS液體培養(yǎng)基(馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基)中，26℃，170rpm搖床培養(yǎng)4天；再經(jīng)真空抽濾，獲得具一定殺線(xiàn)蟲(chóng)活性的濾液，即發(fā)酵原液。
殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶的分離純化發(fā)酵濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮10倍后，有晶體析出，將析出的固體在60℃下溶解，室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶；經(jīng)X-T4型熔點(diǎn)測(cè)定儀進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定，結(jié)果為188-190℃。
8配位鉀的乙二酸配合物的分離純化發(fā)酵濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮20倍數(shù)后，有晶體析出，將析出的晶體先在60℃下進(jìn)行溶解，然后吸去母液，再將余下未能溶解的晶體在80℃下溶解，室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到單晶B；經(jīng)X-T4型熔點(diǎn)測(cè)定儀進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定，結(jié)果為194-196℃。
含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶的結(jié)構(gòu)表征紫外光譜測(cè)定在上海第三分析儀器廠(chǎng)756MC UV-VIS SPECTROPHOTOMETER上進(jìn)行，結(jié)果紫外吸收峰在213.5nm附近；紅外光譜(KBr壓片)測(cè)定在美國(guó)Nicolet公司產(chǎn)170SX-FT紅外光譜儀上進(jìn)行，結(jié)果紅外光譜VKBr(cm-1)的吸收峰為3431，1683，1259；X射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)衍射儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，即在在顯微鏡下選取合適大小的單晶在室溫下進(jìn)行X-射線(xiàn)實(shí)驗(yàn)。在Bruker Smart 1000CCD衍射儀上，用經(jīng)石墨單色器單色化的Mo-Kα射線(xiàn)(λ＝0.71073).以ωω/φ或ω/2θ方式收集衍射數(shù)據(jù)。晶體結(jié)構(gòu)由TREF法或PATT法結(jié)合差值Fourier合成解出。證明此晶體為含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸，分子式為(H2C2O4)(H2O)2。
單晶8配位鉀的乙二酸配合物的結(jié)構(gòu)表征方法同含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶，結(jié)果為紫外吸收峰在210.5nm附近、紅外光譜VKBr(cm-1)的吸收峰為3424，1685，1259，1122，721詳見(jiàn)圖2；X射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)衍射儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，證明此晶體為8配位鉀的乙二酸配合物。分子式為K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。在圖1中，藍(lán)色表示鉀原子，紅色表示氧原子，黑色表示碳原子。
含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶殺線(xiàn)蟲(chóng)活性測(cè)定結(jié)果其最低有效劑量即MED為2mg/ml，殺蟲(chóng)活性為83％。
單晶8配位鉀的乙二酸配合物的殺線(xiàn)蟲(chóng)活性測(cè)定結(jié)果其最低有效劑量即MED為4mg/ml，殺蟲(chóng)活性為76％。
在混合晶體中含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸和8配位鉀的乙二酸配合物的含量比為2.5∶2(2)殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分單晶(A)和單晶(B)的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶的分離純化發(fā)酵濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮10倍后，有晶體析出，將析出的晶體在60℃下溶解，室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶；經(jīng)X-T4型熔點(diǎn)測(cè)定儀進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定，結(jié)果為188-190℃。
單晶8配位鉀的乙二酸配合物的分離純化發(fā)酵濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮20倍數(shù)后，有晶體析出，將析出的晶體在80℃下溶解，室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到單晶8配位鉀的乙二酸配合物；經(jīng)X-T4型熔點(diǎn)測(cè)定儀進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定，結(jié)果為194-196℃。
含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶的結(jié)構(gòu)表征紫外光譜測(cè)定在上海第三分析儀器廠(chǎng)756MC UV-VIS SPECTROPHOTOMETER上進(jìn)行，結(jié)果紫外吸收峰在213.5nm附近；紅外光譜(KBr壓片)在美國(guó)Nicolet公司產(chǎn)170SX-FT紅外光譜儀上進(jìn)行，結(jié)果紅外光譜VKBr(cm-1)的吸收峰為3431，1683，1259；X射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)衍射儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，即在顯微鏡下選取合適大小的單晶，室溫下在Bruker Smart 1000CCD衍射儀上，用經(jīng)石墨單色器單色化的Mo-Kα射線(xiàn)(λ＝0.71073).以ωω/φ或ω/2θ方式收集衍射數(shù)據(jù)。晶體結(jié)構(gòu)由TREF法或PATT法結(jié)合差值Fourier合成解出，證明此單晶為含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸，分子式為(H2C2O4)(H2O)2。
單晶8配位鉀的乙二酸配合物的結(jié)構(gòu)表征方法同兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸，結(jié)果為紫外吸收峰在210.5nm附近、紅外光譜VKBr(cm-1)的吸收峰為3424，1685，1259，1122，721詳見(jiàn)圖2；X射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)衍射儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，證明此結(jié)晶為8配位鉀的乙二酸配合物分子式K(H2C2O4)(HG2O4)(H2O)2，結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸的殺線(xiàn)蟲(chóng)活性測(cè)定結(jié)果其最低有效劑量MED為2mg/ml，殺蟲(chóng)活性為83％。
8配位鉀的乙二酸配合物的殺線(xiàn)蟲(chóng)活性測(cè)定結(jié)果其最低有效劑量MED為4mg/ml，殺蟲(chóng)活性為76％。
在混合晶體中含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶和單晶8配位鉀的乙二酸配合物的含量比為2.5∶2。
(2)濾液中有機(jī)酸的分離和鑒定弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離發(fā)酵濾液中的有機(jī)酸組分預(yù)處理的D301弱堿性陰離子交換樹(shù)脂裝柱，以去離子水平衡；上樣發(fā)酵濾液15ml，先用水洗3倍柱體積，在用稀氨水洗脫，流速1ml/min分部收集，得到不同含量的有機(jī)酸組分。
高效液相C18反相柱層析分析鑒定經(jīng)過(guò)離子交換柱分離收集到的有機(jī)酸組分，分別用草酸、蘋(píng)果酸、乳酸、酒石酸、丁二酸、丙二酸等十幾種標(biāo)準(zhǔn)樣品酸，采用外標(biāo)法，流速0.5ml/min，柱壓為200kg/cm2，流動(dòng)相為2.5％的磷酸二氫銨，鑒定出有機(jī)酸組分包括大量的兩水乙二酸和其他有機(jī)酸C，含量比2.5∶1.5，其他有機(jī)酸主要含有酒石酸，蘋(píng)果酸，乳酸，三者含量之和占其他有機(jī)酸含量的90-95％。(高效液相圖譜見(jiàn)圖3--圖7)其中圖3為發(fā)酵原液的高效液相色譜圖；圖4為乙二酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜圖；圖5為蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜圖；圖6為發(fā)酵原液經(jīng)離子交換柱分離后并改變高效液相分析條件得到的色譜圖；圖7是與圖6相同分析條件下，酒石酸的高效液相色譜圖。
該代謝物中活性組分含量之和為100％，且含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶、8配位鉀的乙二酸配合物及其他有機(jī)酸含量之和為80％。
實(shí)施例2活性物質(zhì)的制備采用發(fā)酵罐發(fā)酵首先進(jìn)行一級(jí)種子的制備，即用無(wú)菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，以每100毫升液體培養(yǎng)基中加入106孢子，26℃，pH6，靜置培養(yǎng)21小時(shí)；然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種4％的一級(jí)種子，26℃，通氣攪拌，發(fā)酵68h；通氣量為1∶0.5-1∶0.75，轉(zhuǎn)速為300-350rpm；發(fā)酵原液的殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組份分離純化中發(fā)酵濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮20倍后，放入冰箱冷藏室中進(jìn)行含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶的重結(jié)晶；在混合晶體中含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶與8配位鉀的乙二酸配合物單晶的含量比為3.5∶2.5，其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例3發(fā)酵濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮15倍后，離心分離析出的晶體和上清，將上清液置于冰箱冷藏室中，待有晶體析出后，經(jīng)重結(jié)晶可得含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶；離心分離析出的晶體經(jīng)50℃烘干，80℃溶解過(guò)濾去雜質(zhì)，再將溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)覝叵蚂o置，得到單晶8配位鉀的乙二酸配合物，其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例4弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離發(fā)酵濾液中的有機(jī)酸組分的步驟中，發(fā)酵濾液的上樣量10ml，分部收集得到不同含量的有機(jī)酸組分，其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例5弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離發(fā)酵濾液中的有機(jī)酸組分的步驟中，流速0.5ml/min，分部收集得到不同含量的有機(jī)酸組分，其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例6弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離發(fā)酵濾液中的有機(jī)酸組分的步驟中，流速1.5ml/min，分部收集得到不同含量的有機(jī)酸組分，其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例7弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離發(fā)酵濾液中有機(jī)酸組分的效果，也可增加上樣緩沖液的離子強(qiáng)度，先用一定濃度0.15mol/L的氯化鈉平衡離子交換柱，上樣、洗脫、收集同實(shí)施例1。
實(shí)施例8高效液相C18反相柱層析分析鑒定子交換柱分離收集到的有機(jī)酸組分同實(shí)施例1，需要說(shuō)明的是，采用內(nèi)標(biāo)法，鑒定出有機(jī)酸組分包括大量的乙二酸和其他有機(jī)酸含量比3.5∶2.5，其他有機(jī)酸主要含有酒石酸，蘋(píng)果酸，乳酸。
權(quán)利要求
1.總狀共頭霉代謝物，其特征在于，在該代謝物中殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分的基本組成為帶兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸、8配位鉀的乙二酸配合物、含氨基化合物和其它有機(jī)酸；活性組分含量之和為100％；其中帶兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸、8配位鉀的乙二酸配合物和其它有機(jī)酸含量之和不小于80％，且其之間的含量比為(2.5-3.5)∶(1.8-2.5)∶(1.5-2.5)；該代謝物的活性成分8配位鉀的乙二酸配合物，為一種新型結(jié)構(gòu)物，其分子式為K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2，其結(jié)構(gòu)如圖1所示；帶兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸分子式為(H2C2O4)(H2O)2；該生防菌代謝物的特性溶解性為水溶性，并能以任意比溶于水；熱穩(wěn)定性121℃處理15-20min，活性不低于原活性的95％；生物活性1ml發(fā)酵原液作用于1500條松材線(xiàn)蟲(chóng)，線(xiàn)蟲(chóng)死亡率為100％；將發(fā)酵原液稀釋一倍后，取1ml作用于1500條松材線(xiàn)蟲(chóng)，線(xiàn)蟲(chóng)死亡率為70-95％；殺線(xiàn)蟲(chóng)譜；它可廣泛用于松材線(xiàn)蟲(chóng)、根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)、甘薯莖線(xiàn)蟲(chóng)重要植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)病害的生物防治。
2.按照權(quán)利要求1所述的總狀共頭霉代謝物，其特征是，其它有機(jī)酸包括酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸，其三者含量之和，占其它有機(jī)酸含量的90-95％。
3.按照權(quán)利要求1所述的總狀共頭霉代謝物及其殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分的分離純化方法，其特征是將總狀共頭霉代謝產(chǎn)物的發(fā)酵原液，采用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)、重結(jié)晶、弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離方法，經(jīng)過(guò)紫外、紅外光譜及X射線(xiàn)單晶衍射和高效液相色譜進(jìn)行分析鑒定，確定了殺蟲(chóng)活性組分中含有有機(jī)酸，其中主要為乙二酸，還有蘋(píng)果酸、酒石酸、乳酸；經(jīng)濃縮重結(jié)晶技術(shù)得到含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸及8配位鉀的乙二酸配合物；總狀共頭霉代謝產(chǎn)物殺線(xiàn)蟲(chóng)活性物質(zhì)的分離純化工藝發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾得到發(fā)酵濾液，此后，將部分濾液即發(fā)酵原液通過(guò)離子交換柱進(jìn)行層析分離，然后再通過(guò)高效液相色譜對(duì)分離組分進(jìn)行檢測(cè)鑒定；另一方面將剩余濾液即發(fā)酵原液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)，獲得濃縮液，再將濃縮液中析出晶體與母液分離，其中的晶體經(jīng)重結(jié)晶獲得單晶，通過(guò)紫外、紅外光譜及X射線(xiàn)單晶衍射進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析；其母液則經(jīng)凝膠層析進(jìn)行分離純化。分離純化的具體方法(1)殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分單晶的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)酵濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮10-20倍后，有晶體物質(zhì)析出，將析出的晶體在60-80℃下溶解后，冰箱冷藏室中或室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到一個(gè)單晶；室溫下進(jìn)行重結(jié)晶得到另一個(gè)單晶；經(jīng)熔點(diǎn)、紫外、紅外光譜測(cè)定以及X射線(xiàn)晶體衍射進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，證明前者為含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸，其分子式為(H2C2O4)(H2O)2，后者為8配位鉀的乙二酸配合物，其分子式為K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1；二者均有殺線(xiàn)蟲(chóng)活性，兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶最低有效劑量即MED為2mg/ml，殺蟲(chóng)活性為83％，單晶8配位鉀的乙二酸配合物的最低有效劑量MED為4mg/ml，殺蟲(chóng)活性為76％。(2)濾液中有機(jī)酸的分離和鑒定離子交換柱層析將發(fā)酵濾液用弱堿性陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行初步分離，上樣量10-15ml，用水或添加0.15mol/L的氯化鈉溶液平衡柱，再依次用水和稀氨水進(jìn)行洗脫，流速0.5ml/min-1.5ml/min，分部收集到不同含量的有機(jī)酸樣品，再經(jīng)高效液相分析，酸性物質(zhì)包括大量的乙二酸，和酒石酸，蘋(píng)果酸，乳酸。
全文摘要
總狀共頭霉代謝物及其殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組分的分離純化方法，屬于開(kāi)發(fā)新型殺線(xiàn)蟲(chóng)生物制劑，特別涉及水溶性殺線(xiàn)蟲(chóng)生防代謝物及活性組分的分離純化方法。本發(fā)明克服了水溶性總狀共頭霉代謝物分離困難的問(wèn)題；提供了其殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組份的分離與純化方法，其具體方法是將發(fā)酵原液，采用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)、重結(jié)晶、弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離方法，經(jīng)過(guò)紫外、紅外光譜及X射線(xiàn)單晶衍射和高效液相色譜進(jìn)行分析鑒定。獲得了殺線(xiàn)蟲(chóng)活性高、殺蟲(chóng)譜廣、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性的新型殺線(xiàn)蟲(chóng)生物制劑；首次證明該菌代謝物中殺線(xiàn)蟲(chóng)活性組份含帶兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸和具有新型結(jié)構(gòu)的8配位鉀的乙二酸配合物，此項(xiàng)研究對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P7/44GK1514004SQ03130528
公開(kāi)日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月31日
發(fā)明者孫建華, 杜連祥, 杜淼, 王海寬, 王瑾玲, 趙小軍, 張穎, 路福平, 李喆 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)