專利名稱：基因重組薩斯病毒(SARS Virus)外殼S蛋白及其制造工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因重組薩斯病毒(SARS Virus)外殼S蛋白及其制造工藝。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種基因重組薩斯病毒(SARS Virus)外殼S蛋白，其組成為圖2所列的的基因序列及圖3所列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
基因重組薩斯病毒外殼S蛋白的制造工藝如下a、利用原核細(xì)胞生產(chǎn)外殼S蛋白或它的片段；b、利用外殼S蛋白生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體，嵌合抗體或人源化抗體。
所述的原核細(xì)胞為大腸桿菌。
所述的利用原核細(xì)胞生產(chǎn)外殼S蛋白或它的片段包括以下步驟a、十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析分離的病毒外殼S蛋白各種組分，然后電轉(zhuǎn)移到膜上，利用病愈患者的血清孵育已用牛血清白蛋白封閉的膜，再根據(jù)常規(guī)Western Blot方法，主要顯色帶為分子量150 000的蛋白質(zhì)，在此基礎(chǔ)上，在SDS-PAGE上，切下150 000這一條帶，并測(cè)定15個(gè)N-端氨基酸序列，利用蛋白質(zhì)同源序列分析，為薩斯病毒外殼S蛋白；b、根據(jù)薩斯病毒外殼S蛋白的基因序列及氨基酸序列設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得表達(dá)薩斯病毒的外殼S蛋白的基因片斷，通過(guò)NdeI和XhoI雙酶切位點(diǎn)，克隆到原核表達(dá)載體pET-22b(+)中，構(gòu)建表達(dá)載體pET22-SP1與pET22b-SP2，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌成為工程菌；c、重組外殼S蛋白的純化誘導(dǎo)后的工程菌，經(jīng)超破菌后離心取上清，再經(jīng)過(guò)離子交換層析及除菌、濃縮和凍干方法。
所述的離子交換層析包括DEAE離子交換層析、SP離子交換層析和Q離子交換層析。
所述的利用外殼S蛋白生產(chǎn)多克隆、單克隆抗體，嵌合抗體或人源化抗體包括利用純化的重組外殼S蛋白免家兔疫三次，獲得特異性的兔抗重組外殼S蛋白，雙擴(kuò)結(jié)果顯示，稀釋度為1∶16，Western Blot方法證明該抗體能識(shí)別重組薩斯病毒外殼S蛋白和天然薩斯病毒外殼S蛋白，并純化該抗體。
所述的外殼S蛋白用于鑒定人薩斯病毒抗原物質(zhì)。
本發(fā)明的有益效果是1、根據(jù)抗原抗體能特意性識(shí)別這一原理，鑒定出薩斯病毒外殼S蛋白為一能刺激人體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的抗原，為進(jìn)一步研發(fā)疫苗和抗體治療由薩斯病毒的感染疾病打下了基礎(chǔ)。
2、根據(jù)薩斯病毒的外殼S蛋白基因片段，建立一系列的表達(dá)外殼S蛋白工程菌，表達(dá)產(chǎn)生重組的外殼S蛋白及其變異物，為研究外殼S蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究提供了工具。
3、蛋白及突變蛋白可作為藥物組合物的重要成分，用于相關(guān)病毒感染的治療。
4、外殼S蛋白及其抗體可作為預(yù)防及治療薩斯病毒的藥物。
外殼S蛋白及其抗體可作為尋找外殼S蛋白受體的重要工具，這可通過(guò)目前常規(guī)的受體鑒別方法來(lái)進(jìn)行。


圖1是Western Blot方法鑒定薩斯病毒刺激人體產(chǎn)生抗體的抗原物質(zhì)。
圖2是薩斯病毒(SARS)的外殼S蛋白(Spike protein)的基因序列。
圖3是薩斯病毒外殼S蛋白(Spike protein)的氨基酸序列。
圖4是pET22b-SP重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程。
圖5是PCR擴(kuò)增外殼S蛋白基因片斷譜圖。
圖6是外殼S蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE(12％)圖譜。
圖7是純化后重組外殼S蛋白SDS-PAGE(12％)電泳圖譜。
圖中，A基因標(biāo)記；B、CS蛋白基因；D誘導(dǎo)前菌體蛋白；E、F誘導(dǎo)后菌體蛋白；G、H純化后的S蛋白；I、J純化后的S蛋白片段。
純化方法包括誘導(dǎo)后的工程菌，經(jīng)超破菌后離心取上清，再經(jīng)過(guò)離子交換層析及常規(guī)除菌、濃縮和凍干方法。實(shí)施例2薩斯病毒外殼S蛋白多克隆抗體的制備選擇優(yōu)質(zhì)的大耳白兔子4-6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)、觀察無(wú)病一個(gè)星期。常規(guī)用卡介苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫兔子。一定量的抗原SDS-PAGE，用考馬斯亮藍(lán)染色(或250MmKCl染色)，將目的帶切下，用液氮在研缽中將膠磨碎，將膠與佐劑(1∶1)混合，繼續(xù)研磨成糊狀，免疫家兔。時(shí)間為基礎(chǔ)免疫一星期后，1-2mg抗原/只。制備的膠為1mg抗原/lg膠。
兩周(或三周)后加強(qiáng)免疫1～2mg抗原/只。
一周后加強(qiáng)免疫1～2mg抗原/只。可用雙擴(kuò)法檢測(cè)有無(wú)抗體產(chǎn)生。
一周后進(jìn)行第三次加強(qiáng)免疫1～2mg抗原/只。
1～2周后，取家兔耳緣靜脈血，用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)抗外殼S蛋白抗體。用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。血清中目的抗體為陽(yáng)性后，大量抽取兔血，收集的血液37℃放置1～2小時(shí)，4℃過(guò)夜，再無(wú)菌的條件下，離心收集血清，分裝(0.2ml)，儲(chǔ)存于-70℃。實(shí)施例3 薩斯病毒組成蛋白作為刺激人體產(chǎn)生抗體的抗原物質(zhì)鑒定方法利用基因工程方法生產(chǎn)的或天然的薩斯病毒外殼蛋白包括外殼S蛋白、或M蛋白、N蛋白及其他蛋白先做十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析分離的病毒外殼S蛋白各種組分，然后轉(zhuǎn)移到膜上，利用病愈患者的血清孵育已用牛血清白蛋白封閉的膜，再根據(jù)常規(guī)WesternBlot方法，如圖1所示，找出陽(yáng)性顯色帶，該蛋白即為能刺激人體產(chǎn)生抗體的抗原。本實(shí)施例還包括利用常規(guī)的免疫共沉淀方法鑒定抗原的方法。
權(quán)利要求
1.一種基因重組薩斯病毒(SARS Virus)外殼S蛋白，其特征在于其組成為圖2所列的的基因序列及圖3所列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組薩斯病毒外殼S蛋白的制造工藝，其特征在于制造工藝包括a、利用原核細(xì)胞生產(chǎn)外殼S蛋白或它的片段；b、利用外殼S蛋白生產(chǎn)多克隆、單克隆抗體，嵌合抗體或人源化抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因重組薩斯病毒外殼S蛋白的制造工藝，其特征在于所述的原核細(xì)胞為大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因重組薩斯病毒外殼S蛋白的制造工藝，其特征在于所述的利用原核細(xì)胞生產(chǎn)外殼S蛋白或它的片段包括以下步驟a、十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析分離的病毒外殼S蛋白各種組分，然后電轉(zhuǎn)移到膜上，利用病愈患者的血清孵育已用牛血清白蛋白封閉的膜，再根據(jù)常規(guī)Western Blot方法，主要顯色帶為分子量150 000的蛋白質(zhì)，在此基礎(chǔ)上，在SDS-PAGE上，切下150 000這一條帶，并測(cè)定15個(gè)N-端氨基酸序列，利用蛋白質(zhì)同源序列分析，為薩斯病毒外殼S蛋白；b、根據(jù)薩斯病毒外殼S蛋白的基因序列及氨基酸序列設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得表達(dá)薩斯病毒的外殼S蛋白的基因片斷，通過(guò)NdeI和XhoI雙酶切位點(diǎn)，克隆到原核表達(dá)載體pET-22b(+)中，構(gòu)建表達(dá)載體pET22-SP1與pET22b-SP2，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌成為工程菌；c、重組外殼S蛋白的純化誘導(dǎo)后的工程菌，經(jīng)超破菌后離心取上清，再經(jīng)過(guò)離子交換層析及除菌、濃縮和凍干方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因重組薩斯病毒外殼S蛋白的制造工藝，其特征在于所述的離子交換層析包括DEAE離子交換層析、SP離子交換層析和Q離子交換層析。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的基因重組薩斯病毒外殼S蛋白的制造工藝，其特征在于所述的利用外殼S蛋白生產(chǎn)多克隆、單克隆抗體，嵌合抗體或人源化抗體包括利用純化的重組外殼S蛋白免家兔疫三次，獲得特異性的兔抗重組外殼S蛋白，雙擴(kuò)結(jié)果顯示，稀釋度為1∶16，WesternBlot方法證明該抗體能識(shí)別重組薩斯病毒外殼S蛋白和天然薩斯病毒外殼S蛋白，并純化該抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組薩斯病毒外殼S蛋白，其特征在于所述的外殼S蛋白用于鑒定人薩斯病毒抗原物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用基因工程生產(chǎn)一種病毒外殼蛋白，即薩斯病毒(SARS Virus)外殼S蛋白(Spike Membrane Protein，簡(jiǎn)稱Spike Protein，S或E2)的新工藝。鑒定出刺激人體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要抗原外殼S蛋白，依照外殼S蛋白的基因序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)兩種外殼S蛋白的多肽，分子量分別約為90000與22000。通過(guò)一系列層析方法，純化獲得了上述兩種蛋白，并利用重組兩種外殼S蛋白的多肽免疫家兔，獲得特異性抗體。本發(fā)明為臨床上預(yù)防、診斷和治療薩斯病毒的感染提供了工具。
文檔編號(hào)C12N15/40GK1465589SQ0313008
公開(kāi)日2004年1月7日 申請(qǐng)日期2003年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月17日
發(fā)明者韓忠朝, 徐斌, 劉擁軍 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所