專利名稱：一種提高單分子熒光成像清晰度的方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光光譜成像技術(shù)，特別是一種提高單分子熒光成像清晰度的方法及其裝置。
背景技術(shù)：
在上世紀(jì)九十年代單分子科學(xué)的形成與發(fā)展使得人們能夠在原子、分子尺度上觀察和操縱微觀物質(zhì)世界。在單分子水平進(jìn)行光學(xué)測量，可以揭露被大量分子系綜平均掩蓋的各個(gè)分子活動(dòng)特性?；趩畏肿痈咔逦鹊臒晒獬上裼糜诜肿犹结樅腿玖蠠晒鈽?biāo)記是研究分子擴(kuò)散、基因重組、蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)過程等問題的重要手段和技術(shù)。實(shí)現(xiàn)單分子熒光成像普遍采用光學(xué)共聚焦顯微實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行測量，然而由于單分子熒光的輻射起伏(取決于分子的三重態(tài)特性及分子周圍電子受體俘獲電子的能力)以及較低的信噪比使得單分子熒光成像較為模糊，造成丟失一些局部區(qū)域的熒光信息，滿足不了高清晰度熒光成像的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種提高單分子熒光成像清晰度和方法，該方法可以解決由于分子熒光輻射起伏以及信噪比較低而造成的單分子熒光成像模糊的問題。為解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種提高單分子熒光成像清晰度的方法，采用皮秒脈沖激光器產(chǎn)生激光，利用函數(shù)信號(hào)發(fā)生器輸出正弦波形的調(diào)制電壓信號(hào)控制聲光調(diào)制器對(duì)激光進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制，用調(diào)制后的激光掃描照射單分子樣品，使用單光子探測器接收單分子樣品發(fā)出的熒光光子，單光子探測器對(duì)入射熒光光子響應(yīng)，并通過光電轉(zhuǎn)化為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的邏輯電脈沖輸出信號(hào)，邏輯電脈沖信號(hào)輸入到鎖相放大器，同時(shí)將函數(shù)信號(hào)發(fā)生器的同步正弦波形調(diào)制電壓信號(hào)輸入鎖相放大器，對(duì)邏輯電脈沖輸出信號(hào)進(jìn)行解調(diào)，得到被測的熒光光譜信號(hào)并對(duì)熒光光譜信號(hào)進(jìn)行成像。通過調(diào)制和解調(diào)的過程，只容許包含熒光信號(hào)的調(diào)制諧波信號(hào)成分得到放大， 而抑制了其他頻率的背景信號(hào)，即通過壓縮噪聲帶寬有效降低量子噪聲，提高了光譜成像信號(hào)的信噪比。本發(fā)明還提供一種實(shí)現(xiàn)上述方法的裝置，所述的提高單分子熒光成像清晰度的方法的裝置，包括皮秒脈沖激光器聲光調(diào)制器、三維納米平移臺(tái)、單光子探測器、函數(shù)信號(hào)發(fā)生器、鎖相放大器和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)，函數(shù)信號(hào)發(fā)生器與聲光調(diào)制器連接， 皮秒脈沖激光器與聲光調(diào)制器相連接，皮秒脈沖激光器輸出的激光經(jīng)過聲光調(diào)制器進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制后由一個(gè)二向色鏡反射后通過顯微鏡物鏡聚焦于樣品分子上，分子受激發(fā)產(chǎn)生的熒光由顯微鏡物鏡收集，通過二向色鏡進(jìn)入單光子探測器轉(zhuǎn)化為邏輯電脈沖信號(hào)，單光子探測器和函數(shù)信號(hào)發(fā)生器一起連接鎖相放大器，對(duì)邏輯電脈沖信號(hào)進(jìn)行解調(diào)，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)分別與鎖相放大器、三維納米平移臺(tái)以及單分子探測器連接。本發(fā)明利用強(qiáng)度調(diào)制激發(fā)光場，實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子熒光光子進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制，利用鎖相放大器解調(diào)后的模擬信號(hào)消除了光子計(jì)數(shù)的量子漲落，提高了信噪比，實(shí)現(xiàn)高清晰度的單分子熒光成像。


圖1為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述方法的裝置結(jié)構(gòu)示意圖2 (a)為分子熒光的光子計(jì)數(shù)光譜；(b)為解調(diào)后的分子熒光光譜。圖3 (a)為單分子熒光的光子計(jì)數(shù)成像；(b)為解調(diào)后的單分子熒光成像。圖4 (a)為一個(gè)單分子的熒光光子計(jì)數(shù)成像的三維立體圖像；(b)為解調(diào)后的單分子熒光成像的三維立體圖像。圖5為掃描程序和熒光光子計(jì)數(shù)原理圖。圖中1-皮秒脈沖激光器，2-聲光調(diào)制器，3-三維納米平移臺(tái)，4-單光子探測器， 5-函數(shù)信號(hào)發(fā)生器，6-鎖相放大器，7-計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)。
具體實(shí)施例方式以下以SR染料分子樣品為例，結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明所述的方法和裝置進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述。樣品制備首先要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求薄膜的厚度來配制聚合物PMMA的濃度。將清洗干凈的蓋玻片放在勻膠機(jī)的托盤上，打開勻膠機(jī)電源開啟真空泵將玻片吸附在托盤上，將配制好的包含有PMMA和SR染料的甲苯溶液滴到蓋玻片上，開啟勻膠機(jī)的啟動(dòng)按鈕勻膠機(jī)將以事先設(shè)定好的轉(zhuǎn)數(shù)旋轉(zhuǎn)，根據(jù)要求樣品薄膜的厚度通常設(shè)定轉(zhuǎn)速為800-3000轉(zhuǎn)/分鐘， 根據(jù)樣品濃度的不同還需要調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)時(shí)間(如分鐘)。將旋涂有聚合物的樣品玻片標(biāo)號(hào)之后，放入到真空烘干箱中抽好真空后升溫到PMMA玻璃點(diǎn)溫度之上(大約為315 K)，進(jìn)行淬火處理以消除殘留的溶劑、氧氣及舒緩旋涂技術(shù)對(duì)聚合物薄膜造成的影響，3小時(shí)之后關(guān)閉真空烘干箱電源讓其自然冷卻到室溫溫度。淬火處理后的樣品具有更好的光穩(wěn)定性和更長的光漂白時(shí)間。本發(fā)明所述的提高單分子熒光成像清晰度的方法的裝置，如圖1所示，包括皮秒脈沖激光器1、聲光調(diào)制器2、三維納米平移臺(tái)3、單光子探測器4、函數(shù)信號(hào)發(fā)生器5、 鎖相放大器6和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7。本發(fā)明可通過多種公知的儀器實(shí)現(xiàn)，具體實(shí)施方式
中采用的儀器是皮秒脈沖激光器(picoQuant，PDL808型)，聲光調(diào)制器 (Crystal ^Technology，3080-122 型)，三維納米平移臺(tái)(Tritor 200/20 SG)，單光子探測器 (SPCM-15)，函數(shù)信號(hào)發(fā)生器(Agilent，33250A型)，鎖相放大器(SRS SR844)，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)(Ni 6251數(shù)據(jù)采集卡、LabVIEW程序)。函數(shù)信號(hào)發(fā)生器5與聲光調(diào)制器2連接，皮秒脈沖激光器1與聲光調(diào)制器2相連接，皮秒脈沖激光器1輸出的激光經(jīng)過聲光調(diào)制器2進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制后由一個(gè)二向色鏡反射后通過顯微鏡物鏡聚焦于樣品分子上，分子受激發(fā)產(chǎn)生的熒光由顯微鏡物鏡收集后通過二向色鏡進(jìn)入單光子探測器4轉(zhuǎn)化為邏輯電脈沖信號(hào)，單光子探測器4和函數(shù)信號(hào)發(fā)生器5 一起連接鎖相放大器6，對(duì)邏輯電脈沖信號(hào)進(jìn)行解調(diào)，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7分別與鎖相放大器6、三維納米平移臺(tái)3以及單分子探測器4連接。采用皮秒脈沖激光器產(chǎn)生激光，利用函數(shù)信號(hào)發(fā)生器輸出正弦波形的調(diào)制電壓信號(hào)控制聲光調(diào)制器對(duì)激光進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制，用調(diào)制后的激光掃描照射單分子樣品，使用單光子探測器接收單分子樣品發(fā)出的熒光光子，單光子探測器對(duì)入射熒光光子響應(yīng)，并通過光電轉(zhuǎn)化為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的邏輯電脈沖輸出信號(hào)，邏輯電脈沖信號(hào)輸入到鎖相放大器，同時(shí)將函數(shù)信號(hào)發(fā)生器的同步正弦波形調(diào)制電壓信號(hào)輸入鎖相放大器，對(duì)邏輯電脈沖輸出信號(hào)進(jìn)行解調(diào)，得到被測的熒光光譜信號(hào)并對(duì)熒光光譜信號(hào)進(jìn)行成像。分子樣品置于三維納米平移臺(tái)3上，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7與三維納米平移臺(tái)3相連，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7輸出電壓信號(hào)控制三維納米平移臺(tái)3 的掃描。單光子探測器4與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7連接，通過數(shù)據(jù)采集卡的計(jì)數(shù)端子對(duì)分子熒光進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(圖2 (a)所示)和通過LabVIEW程序進(jìn)行分子熒光的光子計(jì)數(shù)成像(圖3 (a)所示)。單光子探測器4和函數(shù)信號(hào)發(fā)生器5 —起連接到鎖相放大器 6對(duì)單分子熒光光子信號(hào)進(jìn)行解調(diào)解調(diào)，將解調(diào)信號(hào)輸入到OT數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行模擬采集和成像，鎖相放大器6與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7相連，記錄解調(diào)后的熒光光譜(圖 2 (b)所示)和通過LabVIEW程序進(jìn)行成像(圖3 (b)所示)。掃描程序和熒光光子計(jì)數(shù)原理如圖5所示(基于NI6251板卡)。函數(shù)信號(hào)發(fā)生器5 (Agilent，33250A)輸出的正弦波調(diào)制信號(hào)(30kHz，4. OVpp)加載到聲光調(diào)制器2的驅(qū)動(dòng)模塊上，對(duì)皮秒脈沖激光器(40MHz)輸出的激光進(jìn)行強(qiáng)度正弦波調(diào)制，被調(diào)制后的激光經(jīng)顯微鏡物鏡聚焦后照射分子樣品，顯微鏡物鏡(100 X，油浸)收集分子發(fā)出的熒光，單光子探測器收集入射熒光單光子信號(hào)(大約10kHz)，并輸入鎖相放大器 6 (積分時(shí)間為30ms)對(duì)信號(hào)進(jìn)行解調(diào)，計(jì)算機(jī)記錄解調(diào)后的分子熒光信號(hào)。采用頻率為30kHz正弦調(diào)制電壓作為激光調(diào)制信號(hào)，對(duì)激光進(jìn)行調(diào)制。圖2 (a) 和(b)分別為單分子熒光的光子計(jì)數(shù)光譜和調(diào)制解調(diào)后的分子熒光光譜，從圖2 (a)中可
以看到單分子熒光的平均光子計(jì)數(shù)#大約為9K，光子計(jì)數(shù)起伏M/大約為3K，對(duì)應(yīng)熒光
信號(hào)起伏=1/3 ；從圖2 (b)中可以看到單分子熒光解調(diào)后的平均信號(hào)V大約為
3.6mV，起伏^1T大約為0.3mV，那么熒光信號(hào)起伏ΛΙ7/Ρ =1/15，即分子熒光強(qiáng)度起伏由光子計(jì)數(shù)光譜的1/3減小為解調(diào)處理后的1/15。顯微鏡物鏡的空間分辨率約為0. 3 μ m，在圖3中選擇的掃描步長為100 nm,掃描的像素為100 X 100，在x-y平面的掃描面積為10 μπι X 10 μ m。圖3 (a)和(b)分別為單分子熒光的光子計(jì)數(shù)成像和解調(diào)后的單分子熒光成像，成像位置為相同樣品的同一區(qū)域，光子計(jì)數(shù)成像的性噪比SNR大約為8，解調(diào)后的單分子熒光成像的性噪比SNR大約為 40，信噪比改善了 5倍。在圖4中選擇的掃描步長為25 nm，掃描像素為40 X 40，在χ-y平面的掃描面積為1 μπι X 1 μπι。圖4 (a)和(b)分別為同一個(gè)單分子的熒光光子計(jì)數(shù)成像的三維立體圖像和解調(diào)后的熒光成像的三維立體圖像，從圖4 (a)中可以看到光子計(jì)數(shù)的起伏較大，而采用本技術(shù)通過解調(diào)處理后的熒光成像更為平滑。
權(quán)利要求
1.一種提高單分子熒光成像清晰度的方法，其特征在于采用皮秒脈沖激光器產(chǎn)生激光，利用函數(shù)信號(hào)發(fā)生器輸出正弦波形的調(diào)制電壓信號(hào)控制聲光調(diào)制器對(duì)激光進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制，用調(diào)制后的激光掃描照射單分子樣品，使用單光子探測器接收單分子樣品發(fā)出的熒光光子，單光子探測器對(duì)入射熒光光子響應(yīng)，并通過光電轉(zhuǎn)化為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的邏輯電脈沖輸出信號(hào)，邏輯電脈沖信號(hào)輸入到鎖相放大器，同時(shí)將函數(shù)信號(hào)發(fā)生器的同步正弦波形調(diào)制電壓信號(hào)輸入鎖相放大器，對(duì)邏輯電脈沖輸出信號(hào)進(jìn)行解調(diào)，得到被測的熒光光譜信號(hào)并對(duì)熒光光譜信號(hào)進(jìn)行成像。
2.實(shí)現(xiàn)如權(quán)利要求1所述的提高單分子熒光成像清晰度的方法的裝置，包括皮秒脈沖激光器(1)、聲光調(diào)制器(2)、三維納米平移臺(tái)(3)、單光子探測器(4)、函數(shù)信號(hào)發(fā)生器(5)、 鎖相放大器(6)和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)(7)，其特征在于函數(shù)信號(hào)發(fā)生器(5) 與聲光調(diào)制器(2)連接，皮秒脈沖激光器(1)與聲光調(diào)制器(2)相連接，皮秒脈沖激光器(1) 輸出的激光經(jīng)過聲光調(diào)制器(2 )進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制后由一個(gè)二向色鏡反射后通過顯微鏡物鏡聚焦于樣品分子上，分子受激發(fā)產(chǎn)生的熒光由顯微鏡物鏡收集后通過二向色鏡進(jìn)入單光子探測器(4)轉(zhuǎn)化為邏輯電脈沖信號(hào)，單光子探測器(4)和函數(shù)信號(hào)發(fā)生器(5) —起連接鎖相放大器(6)，對(duì)邏輯電脈沖信號(hào)進(jìn)行解調(diào)，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)(7)分別與鎖相放大器(6)、三維納米平移臺(tái)(3)以及單分子探測器(4)連接。
全文摘要
本發(fā)明涉及熒光光譜成像技術(shù)，為了解決由于分子熒光輻射起伏以及信噪比較低而造成的單分子熒光成像模糊的問題，本發(fā)明提供一種提高單分子熒光成像清晰度的方法及其裝置。用聲光調(diào)制器進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制后的激光掃描照射單分子樣品，使用單光子探測器接收單分子樣品發(fā)出的熒光光子并轉(zhuǎn)化為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的邏輯電脈沖輸出信號(hào)，邏輯電脈沖信號(hào)輸入到鎖相放大器，同時(shí)將同步正弦波形調(diào)制電壓信號(hào)輸入鎖相放大器，對(duì)邏輯電脈沖輸出信號(hào)進(jìn)行解調(diào)，得到被測的熒光光譜信號(hào)并對(duì)熒光光譜信號(hào)進(jìn)行成像。本發(fā)明利用強(qiáng)度調(diào)制激發(fā)光場，實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子熒光光子進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制，利用鎖相放大器解調(diào)后的模擬信號(hào)消除了光子計(jì)數(shù)的量子漲落，提高了信噪比，實(shí)現(xiàn)高清晰度的單分子熒光成像。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102507521SQ20111034528
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者張國峰, 肖連團(tuán), 賈鎖堂, 陳瑞云, 高巖 申請(qǐng)人:山西大學(xué)