重組木瓜花葉病毒外殼蛋白及其在流感疫苗中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】含有一種或多種抗原肽的重組木瓜花葉病毒(PapMV)外殼蛋白，其制備病毒樣顆粒(VLPs)的用途及VLP在流感疫苗中的用途，所述抗原肽源自流感病毒抗原，如M2e抗原，其在外殼蛋白N-末端13個(gè)氨基酸的推測(cè)隨機(jī)卷曲內(nèi)的位置融合。
【專利說(shuō)明】重組木瓜花葉病毒外殼蛋白及其在流感疫苗中的應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫原性制劑的領(lǐng)域，并且特別地涉及含有重組木瓜花葉病毒外殼蛋 白的制劑，用于誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] W下專利和專利申請(qǐng)描述了木瓜花葉病毒（PapMV)病毒樣顆粒（VL巧作為免疫增 強(qiáng)劑和佐劑的能力。
[0004] 美國(guó)專利No. 7, 641，896、加拿大專利申請(qǐng)No. 2, 434, 000和國(guó)際專利申請(qǐng)No. PCT/ CA03/00985(W02004/004761)描述了 PapMV或來(lái)源于PapMV外殼蛋白的VLP用于在動(dòng)物中 加強(qiáng)免疫反應(yīng)的用途。還描述了 PapMV與免疫原的融合。
[0005] 國(guó)際專利申請(qǐng) No. PCT/CA2007/002069 (W02008/058396)描述 了基于 PapMV 和 PapMV VLP的流感疫苗。所述疫苗包含與一種或更多種流感抗原聯(lián)合或融合的PapMV或 化pMV化P。
[0006] 國(guó)際專利申請(qǐng) No. PCT/CA2007/001904 (W02008/058369)描述了基于 PapMV 的免疫 原性親和-綴合抗原系統(tǒng)。該申請(qǐng)描述了 PapMV外殼蛋白與能夠結(jié)合目標(biāo)抗原的多種親和 膚的融合體，其中，所述親和膚通過(guò)化學(xué)方法或基因融合方法與外殼蛋白連接。
[0007] 國(guó)際專利申請(qǐng) No. PCT/CA2008/000154(W02008/089569)描述 了基于 PapMV 的對(duì)抗 傷寒沙口氏菌化ty地i)和其他腸道菌病原體的疫苗。描述了 PapMV外殼蛋白與一種或多 種腸桿菌抗原的融合體。
[0008] 國(guó)際專利申請(qǐng) No. PCT/CA2009/00636(W02010/012069)描述了基于 PapMV 的多價(jià) 疫苗，包括PapMV或VLP與市售流感疫苗的組合。
[0009] 其它出版物已描述了 PapMV VLP引起體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力值enis 等，2007, Virology, 363:59 - 68 ;Denis 等，2008, Vaccine, 26:3395-3403 ;Leclerc 等，2007, J Virol.，81:1319-26, W及 Lacasse 等，2008, J. Virol.，2008 ;82:785-94)。
[0010] 已描述了 PapMV外殼蛋白的N-端突變體及其在PapMV-宿主互作中的作 用(Ikegami, "Papaya Mosaic Potexvirus as an Expression Vector for Foreign P巧tides, "M. Sc. Thesis, 1995,加拿大國(guó)家圖書館，渥太華）。突變包括野生型序列的3 位的賴氨酸替換為精氨酸保守替換，3位下游的18位氨基酸的缺失，W及作為N-端增加 和野生型N-端序列替換的11位氨基酸的框內(nèi)（in-化ame)插入。所有H個(gè)突變可W在 C. globosa上產(chǎn)生局部病變，并能影響系統(tǒng)性宿主木瓜（C. papaya)，表明所述突變可組裝 并可系統(tǒng)性地移動(dòng)。
[0011] 已經(jīng)研究了 HA11膚與PapMV外殼蛋白的幾個(gè)推測(cè)的表面暴露位點(diǎn)的融合巧ioux 等，2012,化oS 0肥，7 (2)，631925)。該膚在外殼蛋白的12和187位的融合導(dǎo)致融合蛋白能 夠自我組裝成VLP。含有所述膚與外殼蛋白的12位的融合的VLP是穩(wěn)定的，且能誘導(dǎo)針對(duì) HA11膚的免疫反應(yīng)。
[0012] 提供該背景信息的目的是，為了告知本 申請(qǐng)人:認(rèn)為的可與本發(fā)明相關(guān)的信息。既 未必旨在承認(rèn)也不應(yīng)解釋為，任何W上信息構(gòu)成針對(duì)本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[001引發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明的目的在于提供重組木瓜花葉病毒外殼蛋白及其在誘導(dǎo)對(duì)象針對(duì)流 感病毒的免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種含有膚抗原的融合蛋 白，所述膚抗原源自流感M2e膚，其融合至木瓜花葉病毒（PapMV)外殼蛋白的SEQ ID NO: 1的6-12位中任一氨基酸所對(duì)應(yīng)的氨基酸之后，其中，所述融合蛋白可自我組裝成 病毒樣顆粒（VLP)，并且，其中膚抗原長(zhǎng)度為20個(gè)或更少的氨基酸，且含有一般序列： V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID N0:96]，其中 XI 為 E 或 D ;X2 為 P 或 L ;X3 為 T 或 I ;X4 為 R 或K，且X5為N、S或K。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供含有所述融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供含有所述VLP W及藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種誘導(dǎo)對(duì)象針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)的方法，其 包括向?qū)ο蠼o予有效量的VLP。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種降低對(duì)象發(fā)生流感的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括向?qū)?象給予有效量的VLP。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種給對(duì)象免疫W對(duì)抗流感病毒感染的方法，其包 括向?qū)ο蠼o予有效量的VLP。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有上述融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)，用于在 有需要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有所述融合蛋白的病毒樣顆粒（VL巧在有需 要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)的用途。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有所述融合蛋白的病毒樣顆粒（VL巧在制備 誘導(dǎo)對(duì)象針對(duì)流感病毒免疫反應(yīng)的藥物中的用途。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有所述融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)，用于降 低對(duì)象發(fā)生流感的風(fēng)險(xiǎn)。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有所述融合蛋白的病毒樣顆粒（VL巧在降低 對(duì)象發(fā)生流感的風(fēng)險(xiǎn)中的用途。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有所述融合蛋白的病毒樣顆粒（VL巧在制備 降低對(duì)象發(fā)生流感風(fēng)險(xiǎn)的藥物中的用途。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有所述融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)，用于給 對(duì)象免疫W對(duì)抗流感病毒的感染。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有所述融合蛋白的病毒樣顆粒（VL巧在給對(duì) 象免疫W對(duì)抗流感病毒的感染中的用途。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有所述融合蛋白的病毒樣顆粒（VL巧在制備 給對(duì)象免疫W對(duì)抗流感病毒感染的藥物中的用途。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有上述VLP W及使用說(shuō)明書的藥物試劑盒。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有一或多種膚抗原的融合蛋白，所述一或多 種膚抗原融合至木瓜花葉病毒（PapMV)外殼蛋白的在SEQ ID NO: 1中6-12位、185-192位 W及197-214位中任一氨基酸所對(duì)應(yīng)的氨基酸之后，其中所述融合蛋白能夠自我組裝成病 毒樣顆粒（VLP)，且其中膚抗原長(zhǎng)度為20個(gè)或更少的氨基酸，并且其中VLP在至少25C的 溫度下是穩(wěn)定的。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種能夠加強(qiáng)對(duì)象針對(duì)膚抗原的免疫反應(yīng)的融合膚 抗原的病毒樣顆粒（VL巧鑒定方法，其包括如下步驟；提供含有與膚抗原融合的木瓜花葉 病毒（PapMV)外殼蛋白的VLP，并確定VLP在至少25C溫度下的穩(wěn)定性，其中，在至少25C 溫度下的穩(wěn)定性是VLP能加強(qiáng)針對(duì)膚抗原的免疫反應(yīng)的指示。
[0032] 附圖簡(jiǎn)述
[0033] 本發(fā)明的該些和其它特征將從參照附圖的W下詳述中變得更明顯。
[0034] 圖1示出了（A)野生型PapMV外殼蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO ;1);炬）野生型 PapMV外殼蛋白的核巧酸序列（SEQ ID N0;2);似修飾的PapMV外殼蛋白CPAN5的氨基 酸序列（SEQ ID N0;4);和做修飾的PapMV外殼蛋白PapMV CPsm的氨基酸序列（SEQ ID NO ：5) 〇
[00巧]圖2示出了實(shí)施例部分所描述的重組PapMV外殼蛋白的核酸和氨基酸序列，相應(yīng) 抗原膚的插入序列用黑體和下劃線標(biāo)出：(A) PapMV NP-8的核酸和氨基酸序列[分別為SEQ ID NO: 72和73];炬)PapMV NP-183的核酸和氨基酸序列[分別為SEQ ID NO: 74和75]; (〇口39]\^^-(：的核酸和氨基酸序列[分別為569 10^:76和77];值)？39]\^1〇〇96-8的 核酸和氨基酸序列[分別為569 10^:78和79];巧)？391￥1〇〇96-183的核酸和氨基酸 序列[分別為SEQ ID N0:80和81] ; (F)PapMV Loop6-C的核酸和氨基酸序列[分別為SEQ ID NO:82和83];似PapMV 3NP-C的核酸和氨基酸序列[分別為SEQ ID NO:84和85];化） PapMV NP-8/183的核酸和氨基酸序列[分別為SEQ ID N0:86和87] ;(I)PapMV NP-8/C的 核酸和氨基酸序列[分別為SEQ ID NO:88和89] ;(J)PapMV NP-183/C的核酸和氨基酸序 列[分別為SEQ ID NO:90和91];化)PapMV 3NP-8的核酸和氨基酸序列[分別為SEQ ID N0:92 和 93]，W及（L)PapMV 3NP-8/183/C(PapMV H個(gè) NP)[分別為 SEQ ID N0:6 和 94]。 [003引圖3示出了實(shí)施例1所述的PapMV外殼蛋白-M2e膚融合體的氨基酸序列：(A) #1 構(gòu)建體[SEQ ID NO: 23];炬)#2 構(gòu)建體[SEQ ID NO: 24];似 #3 構(gòu)建體[SEQ ID NO: 2引； 值)#4 構(gòu)建體[SEQ ID NO:26];似#5 構(gòu)建體[SEQ ID NO:27] W及（巧#6 構(gòu)建體[SEQ ID N0:2引。插入的M2e膚序列用黑體表示。
[0037] 圖4示出了 PapMV外殼蛋白（CP)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（參考Lecours 等，2006，陽(yáng)口，47:273-80)，化〇11又等（2012，化〇5 0肥，7(2)，631925)表明了齡11膚序列插 入到PapMV CP氨基酸序列（SEQ ID NO:4)中的位置。
[003引圖5示出了實(shí)施例1中所述的構(gòu)建體中，與PapMV外殼蛋白融合的M2e膚的位置 和序列（插入序列用黑體和下劃線表示）。
[0039] 圖6示出了通過(guò)將Sypro-化ange結(jié)合到疏水性殘基，觀察到的實(shí)施例1中 PapMV-M2e構(gòu)建體的變性。
[0040] 圖7示出了圖5中的熱穩(wěn)定性構(gòu)建體炸1、2、3、4、5、6、9和10)的透射電子顯微圖。
[0041] 圖8示出了實(shí)施例1中含有PapMV-M2e構(gòu)建體的VLP的免疫原性評(píng)價(jià)結(jié)果。BALB/ C小鼠，每組5只，用VLP免疫兩次（第1天和第14天）。每次免疫的14天后收獲血樣，通 過(guò)化ISA測(cè)定體液免疫反應(yīng)。A)在第14天和第28天的抗-M2e IgG總滴度，B)在第14天 和第 28 天的抗-M2e IgG2a 總滴度。***p<0. 001，**p<0. 01，*p<0. 1。
[004引圖9示出了（A)融合傷寒沙口氏菌化*7地^環(huán)6膚位點(diǎn)處的PapMV CP氨基 酸序列；炬）重組PapMV CP融合蛋白的SDS-PAGE分析；蛋白PapMV-loop-6-8誘導(dǎo)之前 (泳道1)和表達(dá)之后（泳道2)的細(xì)菌裂解產(chǎn)物；泳道3 ;純化的PapMV-loop-6-8 ;蛋白 PapMV-loop-6-183誘導(dǎo)之前（泳道4)和表達(dá)之后（泳道5)的細(xì)菌裂解產(chǎn)物；泳道6: 純化的PapMV-loop-6-183 ;蛋白PapMV-loop-6-C誘導(dǎo)之前（泳道7)和表達(dá)之后（泳 道8)的細(xì)菌裂解產(chǎn)物；W及泳道9 ;純化的PapMV-loop-6-C ; (C)含有PapMV loop-6-8、 PapMV-loop-6-183 和 PapMV-loop-6-C 的 VLP 的電子顯微圖，W 及值）含有 PapMV loop-6-8、PapMV-loop-6-183 和 PapMV-loop-6-C 的 VLP 的動(dòng)態(tài)光散射值LS)圖。
[004引 圖10示出了通過(guò)ELISA測(cè)定的，用于說(shuō)明針對(duì)PapMV SM(或WT)、PapMV loop-6-8 (loop6_8)、PapMV-loop-6-183(loop6-183)和 PapMV-loop-6-C(loop6-C)的體液 免疫反應(yīng)的數(shù)據(jù)；總的IgG(A);指向PapMV平臺(tái)的IgG2a炬）；總的IgG(C)和指向環(huán)6膚的 IgG2a值）。
[0044] 圖11示出了（A)融合NP膚位點(diǎn)的PapMV CP氨基酸序列；炬)SDS-PAGE顯示了融 合至NP CTL表位的PapMV蛋白和VLP的表達(dá)；（C)含有PapMV NP-8、PapMV NP-183和PapMV NP-C 的 VLP 的電子顯微圖，W及值)PapMV NP-8、PapMV NP-183 和 PapMV NP-C VLP W及盤 (disc)的動(dòng)態(tài)光散射值LS)。
[004引圖12示出了 ELISPOT分析結(jié)果，展示了用含有融合至流感NPw_i日日膚的PapMV CP 的PapMV VLP和盤免疫小鼠后的IFN-y的分泌，（A)含有PapMV NP-12、PapMV NP-187、 PapMV NP-C 或 PapMV CP 的 VLP (與所有組比較，***p《0. 001);炬）含有 PapMV NP-12 或 PapMV CP的VLP和盤（與所有組比較，***p《0. 001)，W及（C)含有與戊二酵佑lut)交 聯(lián)或不交聯(lián)的 PapMV NP-12、PapMV NP-C 或 PapMV CP 的 VLP(*p《0. 05 and**p《0. 01)。 [004引 圖13示出了（A) NPw_i日日膚融合位置處的PapMV CP氨基酸序列；炬)SDS-PAGE顯 示了攜帶多拷貝的NPw_i55膚的PapMV蛋白和VLP的表達(dá)，W及似PapMV VLPs 3NP-C、 NP-8/183、NP-8/C、NP-8/C 和H個(gè) NP 的動(dòng)態(tài)光散射值LS)。
[0047] 圖14描述了 PapMV CP與用PapMV VLP免疫過(guò)的小鼠血清雜交產(chǎn)生的27個(gè)重疊 膚的微陣列分析結(jié)果：在膚1的相對(duì)英光強(qiáng)度的位置標(biāo)出臨界值，因?yàn)槠涫且阎槐砻姹?露的。
[0048] 圖15示出了經(jīng)化學(xué)修飾的PapMV VLP的電子顯微圖和動(dòng)態(tài)光散射分析結(jié)果，表明 用DEPC或邸C處理VLP不會(huì)保持破壞它們的四級(jí)結(jié)構(gòu)，如電子顯微（A)和動(dòng)態(tài)光散射所示 炬)。
[0049] 圖16示出了野生型PapMV外殼蛋白的氨基酸序列[SEQ ID N0:1]，其中C-末端和 N-末端涉及預(yù)測(cè)的隨機(jī)卷曲的氨基酸殘基用黑體和下劃線標(biāo)出。
[0050] 圖17示出了含有與多拷貝流感NPi47_i55膚融合的PapMV CP的PapMV VLP和盤的 ELI SPOT分析結(jié)果。
[005。 圖18示出了描述通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的含有與流感NPw_i55膚融合的PapMV CP 的VLP結(jié)構(gòu)改變圖：(A)含有重組PapMV CP NPw_i55融合體的VLP與沒(méi)有融合體的PapMV VLP相比，在低于小鼠體溫的溫度下表現(xiàn)出PapMV NP-187和NP-C VLP的聚集，做交聯(lián)的 PapMV NP-C VLP顯示了高溫穩(wěn)定性；W及（C)含有經(jīng)戊二酵交聯(lián)或不交聯(lián)的重組PapMV CP NPw_iw膚的VLP進(jìn)行膜蛋白酶裂解的結(jié)果。
[005引圖19示出了消化了的含有經(jīng)邸C化學(xué)修飾的膚的MS/MS譜圖；含有修飾物的區(qū)域 為V16至K30 (A)，M122至K137炬），W及G199至R221似。下劃線的產(chǎn)物離子含有EDC修 飾物。
[005引圖20示出了消化了的含有經(jīng)DEPC化學(xué)修飾的膚的MS/MS譜圖；含有修飾物的區(qū) 域?yàn)镸122至K137 (A)，W及G199至R221炬）。B中的DEPC修飾物不能精確定位，因此，在兩 個(gè)蘇氨酸中的任一個(gè)位置。下劃線的產(chǎn)物離子含有DEPC修飾物。
[0054] 發(fā)明詳述
[0055] 本發(fā)明涉及含有在外殼蛋白（CP)"表面卷曲"區(qū)域內(nèi)融合的一或多個(gè)抗原膚的重 組PapMV外殼蛋白，具體地，在含有野生型CP的N-末端13個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)隨機(jī)卷曲內(nèi)（SEQ ID N0:1 ;見(jiàn)圖16)。含有融合的抗原膚的重組PapMV CP能自我組裝成病毒樣顆粒（VLP)。
[0056] 在某些實(shí)施方案中，一或多個(gè)抗原源自流感病毒，優(yōu)選源自M2e膚，并且在SEQ ID NO: 1的6-12位氨基酸中任一氨基酸之后，或其對(duì)應(yīng)的位置，如SEQ ID NO:4的1-8位氨基 酸中任一氨基酸之后，插入到PapMV CP中。該些重組外殼蛋白制備的病毒樣顆粒（VLPs) 可用于誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)。因此，一些實(shí)施方案涉及該些VLP在誘導(dǎo)哺 乳動(dòng)物，如人類針對(duì)流感病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，其包括VLP 可用作流感疫苗。
[0057] 本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及含有抗原膚融合體的重組PapMV CP蛋白，所述抗 原膚源自流感病毒，如M2e膚，其融合至如SEQ ID N0:1所示的PapMV CP序列的6、7或 10位中任一氨基酸的對(duì)應(yīng)位置之后，例如，如SEQ ID N0:4所示的PapMV CP序列的2、 3或6位氨基酸之后。在一些實(shí)施方案中，所述抗原膚為M2e衍生膚，其含有一般序列： V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID ^:96]，其中《1為￡或0;《2為？或1^;《3為1'或1;《4為1? 或K，且X5為N、S或K。如本申請(qǐng)所示，含有在如SEQ ID NO: 1所示的PapMV CP序列的6、 7或10位中任一氨基酸的對(duì)應(yīng)位置之后融合M2e衍生膚（含有如SEQ ID NO:96所示的一 般序列）的PapMV CP的VLP，能夠通過(guò)單次免疫提供針對(duì)流感病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
[0058] 某些實(shí)施方案包括，重組PapMV CP還可進(jìn)一步包含在CP的二級(jí)表面卷曲區(qū)域和 /或C-末端的融合的一個(gè)或多個(gè)抗原膚。
[0059] 如本申請(qǐng)所述，在一些實(shí)施方案中，可基于VLP的熱穩(wěn)定性預(yù)計(jì)含有重組CP的VLP 引發(fā)針對(duì)融合膚的有效免疫反應(yīng)的能力。因此，在某些實(shí)施方案中，所選擇的含有重組CP 的VLP，在至少3(TC的溫度下是穩(wěn)定的。
[0060] 定義
[0061] 除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域 普通技術(shù)人員所通常理解的含義。
[0062] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"約"是指給定值的約+/-10%變化。應(yīng)理解，該樣的變化常常 包括在本文所提供的任何給定值中，不論有沒(méi)有特別指出。
[0063] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"免疫原性"是指物質(zhì)在動(dòng)物中誘發(fā)可檢測(cè)的免疫反應(yīng)的能力。
[0064] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"免疫反應(yīng)"是指動(dòng)物免疫系統(tǒng)響應(yīng)物質(zhì)（如化合物、分子、材 料等）給予時(shí)反應(yīng)性的改變，并可能涉及抗體產(chǎn)生、誘發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、補(bǔ)體激活、免疫 耐受性的發(fā)展或其組合。
[0065] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"疫苗接種"是指為產(chǎn)生有益免疫反應(yīng)，向?qū)ο蠼o予疫苗。疫 苗接種可具有預(yù)防效果、治療效果或其組合。依據(jù)待處理的對(duì)象，使用各種方法完成疫苗 接種，包括但不限于腸胃外給藥，如腹腔內(nèi)注射（i.p.)、靜脈內(nèi)注射（i.v.)或肌肉內(nèi)注射 (i. m.); 口服給藥；鼻腔給藥；皮內(nèi)給藥；經(jīng)皮給藥和浸泡。
[0066] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"疫苗"是指在能夠產(chǎn)生有益免疫反應(yīng)的組合物。
[0067] 本申請(qǐng)使用的"天然產(chǎn)生的"（如用于指對(duì)象）是指對(duì)象可在自然中發(fā)現(xiàn)的事實(shí)。 例如，可分離自天然來(lái)源并且未在實(shí)驗(yàn)室中被人有意地改造的生物體（包括病毒）或存在 于生物體中的多膚或多核巧酸序列是天然的。
[0068] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"多膚"或"膚"意指一種分子，其至少有兩個(gè)通過(guò)膚鍵連接的 氨基酸，例如至少4個(gè)氨基酸。
[0069] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"病毒樣顆粒"是指自我組裝顆粒，其具有病毒粒子相近 的物理性質(zhì)。VLP可含有或不含有核酸。VLP通常是可W復(fù)制的。
[0070] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"盤"（disc)是指PapMV外殼蛋白的多聚體形式，其 含有約18至約22個(gè)亞單位，并且分子量為約400kDa至約SOOkDa) (Tremblay 等，2006,陽(yáng)BS，273:14-25)。與不具有明確結(jié)構(gòu)的非特定聚合物（aggregate)相比，盤大體 上表現(xiàn)為球形結(jié)構(gòu)，通過(guò)DLS測(cè)量的直徑約為40皿或更小。
[0071] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"抗原"是指一個(gè)分子、多個(gè)分子、分子的一個(gè)部分或多個(gè)部分， 或分子的組合，直至包括整個(gè)細(xì)胞和組織，其能單獨(dú)誘導(dǎo)或與佐劑共同誘導(dǎo)對(duì)象產(chǎn)生免疫 反應(yīng)。免疫原/抗原可含有一個(gè)表位或可含有多個(gè)表位。因此，該術(shù)語(yǔ)包括膚、碳水化合 物、蛋白質(zhì)、核酸和各種微生物（整體或部分），包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲。半抗原也可被認(rèn) 為是包含在本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"抗原"內(nèi)。
[0072] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"對(duì)象"或"患者"是指有接種疫苗或治療需要的動(dòng)物。
[0073] 本文中使用的術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物"是既指人也指非人動(dòng)物，包括但不限于哺乳動(dòng)物、鳥和 魚，并且包括家畜、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、動(dòng)物園動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物和野生動(dòng)物，例如牛、豬、馬、山羊、綿 羊或其他有蹄動(dòng)物、狗、貓、雞、鴨、非人靈長(zhǎng)類、豚鼠、兔、雪貂、大鼠、倉(cāng)鼠和小鼠。
[0074] 本申請(qǐng)中關(guān)于核酸或氨基酸序列使用的術(shù)語(yǔ)"基本相同"是指，當(dāng)最佳比對(duì)（例 女口，使用下述方法）時(shí)，核酸或氨基酸序列與限定的第二核酸或氨基酸序列（或"參考序 列"）共有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至 少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。"基本的同一性"可用于指序列（例如全長(zhǎng) 序列、功能性結(jié)構(gòu)域、編碼和/或調(diào)控序列、啟動(dòng)子和基因組序列）的多種類型和長(zhǎng)度。兩 條氨基酸或核酸序列之間的百分比同一性可W按本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)中的多種方式來(lái)確 定，例如，使用可公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)軟件，例如Smith Waterman Alignment (Smith, T.F.和 M.S.Waterman(1981)J Mol Bioll47 ;195-7) ;"BestFit" (Smith 和 Waterman, Advances in Applied Mathematics，482-489(1981))，合并到 GeneMatcher Plus?, Schwarz 和 Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence 和 Structure, Dayhof，M.O.編，第 353-358 頁(yè) 中；BLAST 程序（基本局部比對(duì)檢索工具（Altschul，S. F.，W. Gish, et al. (1990)J Mol Biol215 ;403-10)及其變體，包括 BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、 ALIGN、ALIGN-2、化USTAL和Megali即值NASTAR)軟件。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定用于 測(cè)量比對(duì)的合適參數(shù)，包括在待比較序列長(zhǎng)度上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的算法。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于 氨基酸序列，比較序列的長(zhǎng)度為至少10個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，實(shí)際長(zhǎng)度取決 于待比較序列的總長(zhǎng)度，并且可W是至少20個(gè)、至少30個(gè)、至少40個(gè)、至少50個(gè)、至少60 個(gè)、至少至少70個(gè)、至少80個(gè)、至少90個(gè)、至少100個(gè)、至少110個(gè)、至少120個(gè)、至少130 個(gè)、至少140個(gè)、至少150個(gè)或至少200個(gè)氨基酸，或者其可W是全長(zhǎng)的氨基酸序列。對(duì)于 核酸，比較序列的長(zhǎng)度一般是至少25個(gè)核巧酸，但可W是至少50個(gè)、至少100個(gè)、至少125 個(gè)、至少150個(gè)、至少200個(gè)、至少250個(gè)、至少300個(gè)、至少350個(gè)、至少400個(gè)、至少450 個(gè)、至少500個(gè)、至少550個(gè)或至少600個(gè)核巧酸，或者其可W是全長(zhǎng)的核酸序列。
[007引本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"多數(shù)"是指多于一個(gè)，例如，兩個(gè)或更多，立個(gè)或更多，四個(gè)或 更多等。
[0076] 當(dāng)在本申請(qǐng)中術(shù)語(yǔ)"包含"與"一"或"一個(gè)"一起使用時(shí)可W表示"一"，但其也符 合"一或更多"、"至少一"W及"一或多于一"的含義。
[0077] 本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"包含"、"具有"、"包括"或"含有"及其語(yǔ)法變體是包括性的或 開(kāi)放性的，并且不排除另外的、未引用的元件或方法步驟。當(dāng)本申請(qǐng)術(shù)語(yǔ)"基本由……組成" 與組合物、用途或方法一起使用時(shí)，表示還存在其它元件和/或方法步驟，但其對(duì)所述的組 合物、方法或用途沒(méi)有實(shí)質(zhì)性作用。當(dāng)本申請(qǐng)術(shù)語(yǔ)"由……組成"與組合物、用途或方法一 起使用時(shí)，排除了存在其他元件和/或步驟。本申請(qǐng)中W包含某些元件和/或步驟描述的 組合物、用途或方法，在某些實(shí)施方案中，也可基本由那些元件和/或步驟組成，且在其它 實(shí)施方案中，由那些元件和/或步驟組成，不論該些實(shí)施方案有沒(méi)有特別指出。
[0078] 包括了本文所討論的可針對(duì)本發(fā)明的任何方法、用途或組合物實(shí)施的任何實(shí)施方 案，并且反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物和試劑盒可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法和用途。
[0079] 重組PapMV外殼蛋白
[0080] 根據(jù)本發(fā)明，重組PapMV外殼蛋白（CP)包含一個(gè)或多個(gè)源自抗原的抗原膚，所述 抗原膚在CP的N-末端表面卷曲區(qū)域內(nèi)的某個(gè)位點(diǎn)與PapMV CP融合。
[0081] 在一些實(shí)施方案中，重組CP還可包含多個(gè)抗原膚（即兩個(gè)或更多），并且多個(gè)膚可 在N-末端表面卷曲區(qū)域內(nèi)融合，或者它們各自在不同的表面卷曲區(qū)域內(nèi)和/或在C-末端 融合。
[0082] PapMV外殼蛋白
[0083] 根據(jù)本發(fā)明，用于制備重組PapMV CP的PapMV外殼蛋白可W是完整的PapMV外 殼蛋白或其一部分，或者其可W是野生型PaPMV外殼蛋白的經(jīng)遺傳修飾形式，例如，包含一 個(gè)或更多個(gè)氨基酸缺失、插入、替換等，前提是所述外殼蛋白保留自組裝成VLP的能力。野 生型PapMV外殼（或衣殼）蛋白的氨基酸序列在本領(lǐng)域中是已知的（參見(jiàn)Sit等，1989， J. Gen. Virol.，70 ;2325-2331，和 GenBank 登錄號(hào) NP_0443：M. 1)，并且在本文中提供為 SEQ ID NO ;1(參見(jiàn)圖1A)。PapMV CP的核巧酸序列在本領(lǐng)域中也是已知的（參見(jiàn)，Sit等， ibid.，和GenBank登錄號(hào)NC_001748巧889-6536位核巧酸））并且在本文中提供為SEQ ID N0;2(參見(jiàn)圖IB)。
[0084] 如上所述，用于制備重組PapMV CP的PapMV CP氨基酸序列不需要精確對(duì)應(yīng)于親 本（野生型）序列，即，其可W是"突變序列"。例如，PapMV CP可通過(guò)一個(gè)或更多個(gè)氨基酸 殘基的替換、插入或缺失來(lái)突變，使得該位點(diǎn)的殘基不對(duì)應(yīng)于親本（參考）序列。但是，本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，該樣的突變將不是廣泛的，并且不會(huì)大大影響重組PapMV CP自我組 裝成VLP的能力。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如本申請(qǐng)實(shí)施例中公開(kāi)的例示性方法，可通過(guò)電子顯微鏡 評(píng)估突變版本的PapMV CP自我組裝成VLP的能力。
[0085] PapMV CP 的天然突變體也是已知的。例如，據(jù) Noa-Carrazana&Silva-Rosales (20 01，Plant Science，85;558)報(bào)道，鑒定了具有外殼蛋白的PapMV的兩個(gè)墨西哥（Mexican) 分離物，其具有與66址3證登錄號(hào)齡.013957(即569 10^:1)88%的序列相似性，彼此序 列相似性為94%。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，也包括該些天然突變體。
[0086] 因此，在一些實(shí)施方案中，還包括通過(guò)野生型CP的片段制備的重組PapMV CP，所 述片段保留自我組裝成VLP的能力（即，"功能性"片段）。例如，片段可W包含從蛋白質(zhì)的 N-末端、C-末端或內(nèi)部或其組合中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失。一般來(lái)說(shuō)，功能性片段的 長(zhǎng)度為至少100個(gè)氨基酸，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，功能性片段被定義為長(zhǎng)度為至少 150個(gè)氨基酸、至少160個(gè)氨基酸、至少170個(gè)氨基酸、至少180個(gè)氨基酸或至少190個(gè)氨基 酸。
[0087] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，當(dāng)重組CP包含變體序列時(shí)，該變體序列與親本（參 考）序列具有至少約70%的同一性，例如與參考序列有至少約75%的同一性。在一些實(shí)施 方案中，該變體序列與參考序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、 至少約97%或至少約98%的同一性，或它們之間的任何量。在一個(gè)實(shí)施方案中，參考氨基 酸序列是SEQ ID NO ;1(圖1A)。
[008引在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，用于制備重組PapMV CP的PapMV CP是PapMV外殼 蛋白CP的經(jīng)遺傳修飾（即變體）形式。在一些實(shí)施方案中，對(duì)PapMV CP進(jìn)行了遺傳修飾 W從所述蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端缺失氨基酸和/或包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換。在 一些實(shí)施方案中，對(duì)PapMV CP進(jìn)行了遺傳修飾W從所述蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端缺失約 1至約10個(gè)氨基酸，例如約1至約5個(gè)氨基酸。
[0089] 在某些實(shí)施方案中，對(duì)PapMV CP進(jìn)行了遺傳修飾W移除接近野生型蛋白質(zhì)N-末 端存在的兩個(gè)蛋氨酸密碼子（即，在SEQ ID N0;1的第1位和6位）中的一個(gè)，并且可W起 始翻譯。翻譯起始密碼子中一個(gè)的移除使得產(chǎn)生同源蛋白質(zhì)群體?？衫缤ㄟ^(guò)替換構(gòu)成該 密碼子的一個(gè)或更多個(gè)核巧酸使得該密碼子編碼除蛋氨酸W外的氨基酸或者變?yōu)闊o(wú)義密 碼子來(lái)移除所選蛋氨酸密碼子?？蛇x地，可缺失密碼子的全部或一部分，或包含所選密碼子 的編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的5'區(qū)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，對(duì)PapMV CP進(jìn)行了遺傳 修飾W在1位缺失蛋氨酸，例如從蛋白質(zhì)的N-末端缺失1至5個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案 中，經(jīng)遺傳修飾的PapMV CP具有與SEQ ID NO ;4(圖1C)基本相同的氨基酸序列，并且可任 選地包含多至6個(gè)組氨酸殘基的組氨酸標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，對(duì)PapMV CP進(jìn)行了遺傳 修飾W在C-末端包括額外的氨基酸（例如，約1至約8個(gè)氨基酸）。引入所述的氨基酸， 例如，可在編碼核巧酸序列中產(chǎn)生一個(gè)或更多個(gè)特異性限制酶位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中， PapMV CP具有與SEQ ID NO ;5(圖1D)基本相同的氨基酸序列，有或沒(méi)有組氨酸標(biāo)簽。
[0090] 當(dāng)使用包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換的變體PapMV CP序列制備重組PapMV CP 時(shí)，該些替換可W是"保守"替換或"非保守"替換。保守替換涉及用具有相似側(cè)鏈性質(zhì)的 另一個(gè)殘基替換一個(gè)氨基酸殘基。如本領(lǐng)域中已知的，可W根據(jù)其側(cè)鏈的物理化學(xué)性質(zhì)將 20種天然氨基酸分組。合適的組包括丙氨酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯 丙氨酸和色氨酸（疏水側(cè)鏈）；甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半脫氨酸、酪氨酸、天冬醜胺和谷氨 醜胺（極性，不帶電側(cè)鏈）；天冬氨酸和谷氨酸（酸性側(cè)鏈）W及賴氨酸、精氨酸和組氨酸 (堿性側(cè)鏈）。另一組氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸（芳族側(cè)鏈）。保守替換涉及用 來(lái)自同組的另一氨基酸替換一個(gè)氨基酸。非保守替換涉及用具有不同側(cè)鏈性質(zhì)的另一個(gè)殘 基替換一個(gè)氨基酸殘基，例如用中性或堿性殘基替換酸性殘基，用酸性或堿性殘基替換中 性殘基，用親水性殘基替換疏水性殘基等等。
[0091] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，重組CP包含具有一個(gè)或多個(gè)非保守替換的變體序 列。將一個(gè)氨基酸替換為具有不同性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸可W改進(jìn)CP的性質(zhì)。例如，如之前 所述，CP的第128位殘基的突變促進(jìn)了所述蛋白質(zhì)組裝成VLPCTremblay等，2006，F(xiàn)EBSJ.， 273 ; 14-25)。因此，在一些實(shí)施方案中，所述CP包含第128位殘基處的突變，其中該位的谷 氨酸殘基被中性殘基替換。在一個(gè)實(shí)施方案中，第128位處的谷氨酸殘基被丙氨酸殘基替 換。
[0092] 已表明，用另一個(gè)疏水性殘基替換野生型PapMV CP的F13位處的苯丙氨酸殘基， 導(dǎo)致與使用野生型蛋白質(zhì)序列相比，表達(dá)重組蛋白質(zhì)時(shí)形成更高比例的VLP。在本發(fā)明的上 下文中，認(rèn)為下述氨基酸殘基是適合于在F13位替換的疏水性殘基；Ile、Trp、Leu、Val、Met 和Tyr。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述重組CP包含在13位用lie、T巧、Leu、Val、Met 或Tyr替換化e。在一些實(shí)施方案中，所述重組CP包含在13位用Leu或Tyr替換化e。
[0093] 在某些實(shí)施方案中，所述CP的F13位的突變可W與E128位的突變、N-末端的缺 失或其組合相組合。
[0094] 同樣地，用于制備重組PapMV CP的編碼PapMV CP的核酸序列不需要精確對(duì)應(yīng)于 親本參考序列，而是可通過(guò)遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同，和/或使得其編碼如上所述的變體 氨基酸序列。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，編碼變體CP的核酸序列與參考序列具有 約70%的同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼重組CP的核酸序列與親本（參考）序列具有至 少約75%的同一性，例如，與參考序列具有至少約80%、至少約85%或至少約90%的同一 性，或它們之間的任何量。在一個(gè)實(shí)施方案中，參考核酸序列是SEQ ID NO ;2(圖1B)。
[009引抗原膚
[0096] 根據(jù)本發(fā)明的重組PapMV CP包含在預(yù)測(cè)的CP N-末端表面卷曲內(nèi)與CP融合的一 個(gè)或多個(gè)抗原膚。優(yōu)選地，抗原膚來(lái)源于流感抗原。抗原膚選自那些不干擾重組CP表達(dá)或 自組裝成CLP能力的抗原膚，二者均可通過(guò)如上所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0097] 與CP融合的抗原膚大小可不同，但是一般來(lái)說(shuō)長(zhǎng)度為約3個(gè)氨基酸至約50個(gè)氨 基酸，例如長(zhǎng)度為約3個(gè)至約40個(gè)氨基酸，約3個(gè)至約30個(gè)氨基酸，約3個(gè)至約25個(gè)氨基 酸，約3個(gè)至約20個(gè)氨基酸，約3個(gè)至約15個(gè)氨基酸，約3個(gè)至約12個(gè)氨基酸，或它們之 間的任何量。在一些實(shí)施方案中，抗原膚的長(zhǎng)度是至少5個(gè)，例如至少6個(gè)或至少7個(gè)氨基 酸W及多至約10、11、12、15或20個(gè)氨基酸，或它們之間的任何量。在本發(fā)明某些實(shí)施方案 中，抗原膚至少長(zhǎng)度為25個(gè)或更少的氨基酸，例如20個(gè)或更少的氨基酸，15個(gè)或更少的氨 基酸，14個(gè)或更少的氨基酸，13個(gè)或更少的氨基酸，12個(gè)或更少的氨基酸，范圍的下限為例 如3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，抗原膚長(zhǎng)度為約5、6、7、8、9、10、11、 12或13個(gè)氨基酸。
[0098] 產(chǎn)生抗原膚的抗原可含有被T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞巨瞻細(xì)胞上的表面結(jié)構(gòu)，I類 或II類APC(抗原遞呈細(xì)胞）有關(guān)的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)或其組合識(shí)別的表位。在某些實(shí)施方案 中，抗原膚含有T細(xì)胞或CTL表位。如本領(lǐng)域已知的，T細(xì)胞表位和CTL表位被T細(xì)胞受體 識(shí)別和結(jié)合，并且可位于抗原內(nèi)部未暴露部位，在抗原蛋白酶解后成為T細(xì)胞受體可接近 的。CTL表位還可在抗原表面被發(fā)現(xiàn)。各種與流感病毒有關(guān)的T細(xì)胞表位和CTL表位是本 領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，所選的用于融合PapMV CP的抗原膚含有B細(xì)胞表位。如 本領(lǐng)域已知的，B細(xì)胞表位被B細(xì)胞受體識(shí)別和結(jié)合。該種表位通常位于抗原表面上。各 種與流感病毒有關(guān)的B細(xì)胞表位是本領(lǐng)域已知的。
[0099] 在某些實(shí)施方案中，例如，當(dāng)重組CP含有多于一個(gè)抗原膚時(shí)，所述抗原膚可含有T 細(xì)胞表位或CTL表位與B細(xì)胞表位的組合。
[0100] 已知的流感病毒抗原包括，例如那些來(lái)源于血細(xì)胞凝集素（HA)、神經(jīng) 醇胺酶（NA)、核蛋白（NP)、Ml和M2蛋白的抗原。該些蛋白質(zhì)的序列是本領(lǐng)域 已知的，可便利地從美國(guó)國(guó)家生物信息中也（NCBI)維護(hù)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)處獲 得。適合的HA、NP和基質(zhì)蛋白的抗原膚包括但不限于，含有一個(gè)或多個(gè)血細(xì)胞 凝集素表位的片段；HA 91-108、HA 307-319 和 HA 306-324(Rothbard, Cell, 198 8, 52:515-523)、HA 458-467 G. Immunol. 1997, 159 (10) :4753-61)、HA 213-227、 HA 241-255、HA 529-543 和 HA 533-547 (Gao, al.，J. Virol.，2006, 80:1959-1964); 核蛋白表位；NP 206-229(化 ett，1991，J. Immunol.l47:984-991)、NP335-350 和 NP38〇-393 (Dyer 和 Middleton, 1993, In:Histocompatibility testing,a practical approach (Ed. : Rickwood, D. and Hames, B. D. ) IRL Press, Oxford, p. 292 ； Gulukota 和 DeLisi,1996,Genetic Analysis:Biomolecular Engineering, 13:81)、 NP 305-313(Di化ino，1993，PNAS 90:1508-12) ;NP 384-394化vist,1991，化ture 348:446-448) ；NP 89-101 (Cerundolo, 1991,Proc.R.Soc.Lon. 244:169-7) ；NP 91-99(Silver 等，1993,化ture 360:367-369) ;NP 380-388(Suhrbier,1993,J. Immunology 79:171-173) ;NP 44-52 和 NP 265-273 化iBrino, 1993, ibid.);和 NP 365-380(Townsend, 1986, Cell 44:959-968);基質(zhì)蛋白（Ml)表位；Ml 2-22、Ml 2-12、Ml 3-11、Ml 3-12、Ml 41-51、Ml 50-59、Ml 51-59、Ml 134-142、Ml 145-155、 Ml 164-172、Ml 164-173(所有描述見(jiàn) Nijman, 1993,化r.J. Immunol. 23:1215-1219); Ml 17-31、Ml 55-73、Ml 57-68 (Carreno, 1992, Mol Immunol 29:1131-1140); Ml 27-35、Ml 232-240(DiBrino，1993，ibid.)、Ml 59-68 和 Ml 60-68(Eur. J. Immunol. 1994, 24 (3):777-80);和 Ml 128-135 巧ur. J. Immunol. 1996, 26(2):335-39)。
[0101] 其它流感病毒蛋白的抗原區(qū)域和表位是已知的，例如，流感離子通道蛋白（M2)的 片段，包括M2e膚（M2的胞外域）。該膚的序列在不同的流感毒株間是高度保守的。本發(fā)明 的某些實(shí)施例中，抗原膚源自M2e膚。M2e膚序列的實(shí)例示于表1的SEQ ID NO ;8。該序列 的變體已被鑒定，該變體的一些實(shí)例也示于表1。
[0102] 表l:M2e膚及其突變體
[0103]
【權(quán)利要求】
1. 一種含有肽抗原的融合蛋白，所述肽抗原源自流感M2e肽，其融合至木瓜花葉病毒 (PapMV)外殼蛋白的SEQ ID N0:1的6、7、8、9、10、11或12位氨基酸所對(duì)應(yīng)的氨基酸之后， 其中所述融合蛋白能夠自我組裝成病毒樣顆粒（VLP)，且其中所述肽抗原長(zhǎng)度為20個(gè)或更 少的氨基酸，且包含一般序列：V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID NO:96]，其中XI為E或D ;X2 為P或L ;X3為T或I ;X4為R或K，且X5為N、S或K。
2. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原融合在SEQ ID NO: 1的6、7或10 位氨基酸所對(duì)應(yīng)的氨基酸之后。
3. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原融合在SEQ ID N0:1的6位氨基酸 所對(duì)應(yīng)的氨基酸之后。
4. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中，所述PapMV外殼蛋白含有如SEQ ID N0:4所 示的氨基酸序列，所述肽抗原融合至PapMV外殼蛋白的SEQ ID N0:4的1、2、3、4、5、6、7或 8位氨基酸之后。
5. 如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原融合至PapMV外殼蛋白的SEQ ID N0:4的2、3、或6位氨基酸之后。
6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原長(zhǎng)度為約7至約12個(gè) 氨基酸，或者長(zhǎng)度為約7至約10個(gè)氨基酸。
7. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原長(zhǎng)度為約7至約9個(gè)氨 基酸。
8. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原含有如SEQ ID NO: 14-22和96-104中任一個(gè)所示的序列。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原含有序列 EVETPIRNE[SEQ ID N0:21]或 VETPIRN[SEQ ID N0:22]。
10. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原基本上由序列 EVETPIRNE[SEQ ID N0:21]或 VETPIRN[SEQ ID N0:22]組成。
11. 如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白含有如SEQ ID N0:23中的 1-224位氨基酸；SEQ ID NO :24中1-222位氨基酸；SEQ ID NO :25中1-221位氨基酸；SEQ ID NO :26 中 1-219 位氨基酸；SEQ ID NO :27 中 1-224 位氨基酸；或 SEQ ID NO :28 中 1-222 位氨基酸所示的氨基酸序列。
12. 如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白含有如SEQ ID N0:23中1-224 位氨基酸所示的氨基酸序列。
13. 如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中，所述VLP在至少37°C的溫度下 是穩(wěn)定的。
14. 一種病毒樣顆粒（VLP)，其含有權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的融合蛋白。
15. -種藥物組合物，其含有權(quán)利要求14所述的VLP和藥學(xué)可接受的載體。
16. 如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其配制為疫苗。
17. -種誘導(dǎo)對(duì)象針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)的方法，其包括向?qū)ο蠼o予有效量的權(quán)利 要求14所述的VLP。
18. -種降低對(duì)象發(fā)生流感的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括向?qū)ο蠼o予有效量的權(quán)利要求14所 述的VLP。
19. 一種給對(duì)象免疫以對(duì)抗流感病毒感染的方法，其包括向?qū)ο蠼o予有效量的權(quán)利要 求14所述的VLP。
20. 如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述VLP在對(duì)象中誘導(dǎo)體液免疫反 應(yīng)。
21. 含有權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)，用于在有需要 的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)。
22. 含有權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)在有需要的對(duì)象 中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)的用途。
23. 含有權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)在制備誘導(dǎo)對(duì)象 針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)的藥物中的用途。
24. 含有權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)，用于降低對(duì)象 發(fā)生流感的風(fēng)險(xiǎn)。
25. 含有權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)在降低對(duì)象發(fā)生 流感的風(fēng)險(xiǎn)中的用途。
26. 含有權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)在制備降低對(duì)象 發(fā)生流感風(fēng)險(xiǎn)的藥物中的用途。
27. 含有權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)，用于給對(duì)象免 疫以對(duì)抗流感病毒的感染。
28. 含有權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)在給對(duì)象免疫以 對(duì)抗流感病毒的感染中的用途。
29. 含有權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)在制備給對(duì)象免 疫以對(duì)抗流感病毒感染的藥物中的用途。
30. 如權(quán)利要求21、24或27中任一項(xiàng)所述的VLP，或如權(quán)利要求22、23、25、26、28或29 中任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述VLP誘導(dǎo)對(duì)象的體液免疫反應(yīng)。
31. -種含有權(quán)利要求14所述的VLP以及使用說(shuō)明書的藥物試劑盒。
【文檔編號(hào)】A61K39/295GK104395346SQ201380028970
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月2日
【發(fā)明者】丹尼斯·勒克萊爾, 娜塔莉·馬杰奧 申請(qǐng)人:弗利亞生物技術(shù)公司