本發(fā)明涉及一種旱稻孢囊線蟲lamp快速檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

旱稻孢囊線蟲(heteroderaelachista)是一種主要侵染水稻的植物寄生線蟲，最早于日本櫪木縣的稻田中被發(fā)現(xiàn)(ohshimay.heteroderaelachistansp.anuplandricecystnematodefromjapan[j].japanesejournalofnematology，1974(4):51-56.)。目前該線蟲病害在湖南省多個(gè)縣(市)丘陵地帶的水稻田首次發(fā)現(xiàn)(dingz，namphuengj，hexf.firstreportofthecystnematode(heteroderaelachista)onriceinhunanprovince,china[j].plantdisease,2012,96(1):151)。旱稻孢囊線蟲一般寄生在寄主根部，其危害癥狀與水肥失調(diào)引起的癥狀極其相似，除吸收寄主的營(yíng)養(yǎng)和對(duì)植物根部造成傷害外，還降低水稻對(duì)水的利用效率，繼而影響寄主的生長(zhǎng)和發(fā)育(丁中,namphuengjanthathang,何旭峰等.旱稻孢囊線蟲生活史及侵染特性[j].中國(guó)水稻科學(xué),2012,26(6):746-750)，造成水稻減產(chǎn)7％～19％(bridgej，lucm，plowrightra.plantparasiticnematodesintropicalandsubtropicalagriculture[m].wallingford：cabinternational,1990:69–108)。目前旱稻孢囊線蟲病主要發(fā)生在長(zhǎng)江中下游水稻種植區(qū)，且危害日趨嚴(yán)重，有可能成為我國(guó)的水稻生產(chǎn)中的又一嚴(yán)重威脅，同時(shí)該線蟲病害的發(fā)生分布還不十分的明確，對(duì)該線蟲做出快速準(zhǔn)確的鑒定是當(dāng)前麥類作物生產(chǎn)急需解決的問題。

旱稻孢囊線蟲屬于cyperi群組，在形態(tài)上與h.oryzae、h.sacchari和h.leuceilyma非常相近。其與h.sacchari和h.leuceilyma最明顯的區(qū)別是在孢囊細(xì)長(zhǎng)的下橋上缺乏指形的投影，而與h.oryzae相比，孢囊略小，二齡幼蟲長(zhǎng)度略短。目前旱稻孢囊線蟲的鑒定大部分仍然依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，但是由于形態(tài)學(xué)鑒定耗時(shí)、需要很熟練的技術(shù)作為基礎(chǔ)，并且需要專門從事分類的人員來完成，這些原因使傳統(tǒng)的鑒定方法時(shí)常存在一定誤差并且不適用于大規(guī)模的樣品檢測(cè)。

近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，pcr等快速檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛的運(yùn)用到植物線蟲的快速檢測(cè)和鑒定中。目前運(yùn)用到孢囊線蟲的檢測(cè)技術(shù)主要包括its-rflp,pcr，realtimepcr等。

amiri等通過對(duì)h.betae、h.ciceri、h.glycines和h.medicaginis、h.schachtii、h.trifolii的its序列進(jìn)行分析，篩選出特異性引物shf6，將此引物與ab28(或rdna2)引物結(jié)合，構(gòu)建了甜菜孢囊線蟲一步雙重pcr的檢測(cè)方法(amiris.,subbotins.a.,moensm.,anefficientmethodforidentificationoftheheteroderaschachtiisensustrictogroupusingpcrwithspecificprimers.nematol.medit.2001,29:241-246)。subbotinsa,pengdl,moensm.運(yùn)用雙重pcr檢測(cè)大豆孢囊線蟲的方法，在一個(gè)pcr反應(yīng)體系中同時(shí)運(yùn)用通用引物d3a和d3b以及特異性引物glyf1和rdna2，從52個(gè)大豆孢囊線蟲群體中均擴(kuò)增出兩個(gè)dna片斷(181bpand345bp)，檢測(cè)的敏感度高達(dá)單個(gè)孢囊、單頭二齡幼蟲的微量dna(subbotons.a.,pengdl,moensm.,arapidmethodfortheidentificationofthesoybeancystnematodeheteroderaglycinesusingduplexpcr.nematology2001,vol.3(4):365-371)。

國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有關(guān)于旱稻孢囊線蟲pcr快速檢測(cè)技術(shù)研究。彭德良等根據(jù)旱稻孢囊線蟲特異性rapd擴(kuò)增片段，設(shè)計(jì)特異性scar標(biāo)記引物hef1和her1，可擴(kuò)增出434bp的特異性片段(發(fā)明專利：旱稻孢囊線蟲旱稻孢囊線蟲特異性rapd和scar標(biāo)記快速分子檢測(cè)方法-cn201210200140.4)；丁中等根據(jù)旱稻孢囊線蟲its序列開發(fā)出特異性檢測(cè)旱稻孢囊線蟲的pcr方法，該特異性引物可在旱稻孢囊線蟲群體特異性擴(kuò)增出281bp的片段，其靈敏度達(dá)1/256條2齡幼蟲(發(fā)明專利特異性檢測(cè)旱稻孢囊線蟲的pcr方法-cn201210322051.7)。

循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplificationofdna，lamp)是2000年日本榮研株式會(huì)社notomi等人開發(fā)的一種新型循環(huán)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。(notomit，okayamah，masubuchih，yonekawat,watanabek,aminonandhaset.loop-mediatedisothermalamplificationofdna[j].nucleicacidsres，2000，28(12):e63.)，該技術(shù)通過識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的特異性引物和利用具有鏈置換功能的bstdna聚合酶，在恒溫條件下能特異、高敏、快速地?cái)U(kuò)增靶序列。2008年日本科學(xué)家首次利用lamp技術(shù)建立了從病木中直接檢測(cè)松材線蟲lamp檢測(cè)的方法(kikuchit,aikawat,oeday,karimn,kanzakin.arapidandprecisediagnosticmethodfordetectingthepinewoodnematodebursaphelenchusxylophilusbyloop-mediatedisothermalamplification.nematology,2009,12:1365-1369)。隨后在建立了南方根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、香蕉穿孔線蟲、柑橘半穿刺線蟲等重要病原線蟲的lamp檢測(cè)技術(shù)(niujh,guoqx,jianh,chencl,yangd,liuq,guoyd.rapiddetectionofmeloidogynespp.bylampassayinsoilandroots.cropprotection,2011,8:1063-1069；niujh,jianh,guoqx,chencl,wangxy,liuq,guoyd.evaluationofloop-mediatedisothermalamplification(lamp)assaysbasedon5srdna-igs2regionsfordetectingmeloidogyneenterolobii.plantpathology,2011,02562.x；pengh,pengdl,huxq,hexf,wangq,huangwk,hewt.loop-mediatedisothermalamplificationforrapidandprecisedetectionoftheburrowingnematode,radopholussimilis,directlyfromdiseasedplanttissues.nematology，2012,14(8):977-986.)靈敏度比常規(guī)pcr檢測(cè)高10-100倍。lamp檢測(cè)技術(shù)在旱稻孢囊線蟲上尚無相關(guān)報(bào)道，本發(fā)明首次建立了旱稻孢囊線蟲lamp快速檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(lamp)檢測(cè)旱稻孢囊線蟲的lamp快速檢測(cè)方法，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)工作的使用，也適合在實(shí)驗(yàn)條件不足的室外檢測(cè)。

一種旱稻孢囊線蟲lamp快速檢測(cè)方法，其特征在于：其中l(wèi)amp反應(yīng)體系所使用的引物是：

1)he-f3：5’-gctctctgtccatgtcagga-3’

2)he-b3：5’-ccgcaactagcccaatgc-3’

3)he-fip：5’-gcaggacagctgcccatgtggcggatcgttcgggagaa-3’

4)he-bip：5’-gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg-3’

5)he-lb：5’-aggttggagctgggatgcg-3’

其中的he-fip采用熒光基團(tuán)標(biāo)記，5`段采用生物素標(biāo)記。

其中的lamp反應(yīng)體系包括：

(1)引物混合液：外引物he-f3和he-b3各0.2μmol/l，內(nèi)引物he-fip和he-bip各1.4μmol/l,環(huán)引物he-lb為0.4μmol/l；

(2)反應(yīng)混合液：3.2mmol/ldntp,20mmol/ltris-hcl(ph8.8),10mmol/lkcl,3mmol/lmgs04,10mmol/l(nh4)2s04,0.1％tritonx-100,8ubstdna大片段聚合酶；

(3)1μldna模板；

加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25μl。

其中l(wèi)amp反應(yīng)條件如下：將引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加入1μldna模板，61～65℃溫育30～90min，85℃保溫5min。

還包括lamp反應(yīng)后的鑒定步驟，所述鑒定步驟包括顯色鑒定或電泳圖鑒定。

所述顯色鑒定為在擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入的顯色劑為100倍sybrgreeni，以肉眼觀察顯色結(jié)果，顯綠色熒光的為旱稻孢囊線蟲。

所述電泳圖鑒定為電泳圖顯示為梯形條帶的為旱稻孢囊線蟲。

所述電泳圖鑒定為在擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入探針，雜交后，插入lfd試紙，發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在測(cè)試帶和控制帶，所述探針的序列為：

he-probe：5-cgccgaggttggagctgggatgc-3`，

所述探針5`段采用fitc標(biāo)記。

上述任一檢測(cè)方法在旱稻孢囊線蟲早期診斷和輔助鑒定中應(yīng)用。

本發(fā)明利用循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立針對(duì)旱稻孢囊線蟲的lamp檢測(cè)方法。本方法具有多條引物的擴(kuò)增，并在兩端形成了帶有引物功能的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種多引物結(jié)合和可自產(chǎn)生引物的原理使其具有了靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，由于lamp反應(yīng)操作步驟簡(jiǎn)單及反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)熒光顯色后，結(jié)果可以通過肉眼直接判定，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)工作的使用,特別適合在實(shí)驗(yàn)條件不足的室外檢測(cè)。

本發(fā)明的方案具體實(shí)施步驟如下：

1.dna的提取

挑取單個(gè)旱稻孢囊放入裝有10μlddh2o的0.2ml離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用無菌的玻璃棒在離心管中轉(zhuǎn)動(dòng)至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μl的10倍pcr緩沖液，2μl的600μg/ml蛋白酶k溶液，然后在-80℃下冷凍30min。將離心管取出，在65℃下溫育90min，95℃反應(yīng)10min處理后上清液作為線蟲dna模板直接用于lamp和pcr反應(yīng)。

2.旱稻孢囊線蟲lamp引物設(shè)計(jì)

根據(jù)ncbi中旱稻孢囊線蟲its-rdna序列(genbank登錄號(hào)：jn_257082,kc_618466,kf_430213andkm_017067)及其近源種heteroderaoryzicola(af_274387)、h.cyperi(af_274388)、h.mothi(af_498392)等its序列，通過比對(duì)后，選擇旱稻孢囊線蟲特異區(qū)域，采用primerexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html).在線軟件設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)篩選出以下5條特意性強(qiáng)，穩(wěn)定性高的引物，序列如下:

1)he-f3:5’-gctctctgtccatgtcagga-3’

2)he-b3:5’-ccgcaactagcccaatgc-3’

3)he-fip5’-gcaggacagctgcccatgtggcggatcgttcgggagaa-3’

4)he-bip5’-gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg-3’

5)he-lb5’-aggttggagctgggatgcg-3’

3.lamp反應(yīng)體系配置

外引物he-f3和he-b3各0.2μmol/l，內(nèi)引物he-fip和he-bip各1.4μmol/l,環(huán)引物he-lb為0.4μmol/l；反應(yīng)混合液：3.2mmol/ldntp,20mmol/ltris-hcl(ph8.8),10mmol/lkcl,3mmol/lmgso4,10mmol/l(nh4)2so4,0.1％tritonx-100,8ubstdna大片段聚合酶；1μldna模板；加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25μl。

lamp反應(yīng)條件如下：將引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加入1μldna模板，61～65℃溫育30～90min，85℃保溫5min。

lamp結(jié)果結(jié)果可以采用以下三種檢測(cè)方法：

1)將上述反應(yīng)完的體系中加入1μl的顯色劑。輕晃混勻，即可觀察；

2)取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶；

3)擴(kuò)增產(chǎn)物種加入1μlfitc標(biāo)記的探針(10μm)，65℃保溫5min后，自然冷卻至室溫，取10ul雜交液，加入到100μlofbps緩沖液中，插入一根lfd試紙，靜置5-15min觀察。4.結(jié)果觀察

在最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，旱稻孢囊線蟲陽(yáng)性反應(yīng)的凝膠電泳能夠觀察到典型的階梯狀條帶。此外，加入sybrgreeni染色劑后，肉眼可以觀察到lamp產(chǎn)物變成綠色，且在側(cè)向?qū)游霰O(jiān)測(cè)中，測(cè)試線和對(duì)照線均出現(xiàn)條帶。而使用其他種線蟲dna進(jìn)行l(wèi)amp無法得到陽(yáng)性結(jié)果，表明lamp方法準(zhǔn)確度高；本發(fā)明lamp檢測(cè)體系能夠檢測(cè)到1/20000頭旱稻孢囊線蟲，比常規(guī)pcr檢測(cè)靈敏10倍，具有極高的靈敏度。

綜上所述，本發(fā)明比現(xiàn)有的檢測(cè)旱稻孢囊線蟲方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性?？梢栽趯?shí)際生產(chǎn)中進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用檢測(cè)。該技術(shù)可應(yīng)用于對(duì)旱稻孢囊線蟲田間土壤樣品及小麥孢囊線蟲病的發(fā)生早期快速分子檢測(cè)，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為旱稻孢囊線蟲lamp引物設(shè)計(jì)示意圖，

圖2為旱稻孢囊線蟲lamp方法檢測(cè)，

a為加熒光染料檢測(cè)結(jié)果，1，2：陽(yáng)性結(jié)果，具有綠色熒光，3：陰性對(duì)照，為棕色。

b檢測(cè)結(jié)果為電泳圖，m:100bpdna標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，2：陽(yáng)性結(jié)果，為lamp擴(kuò)增梯形條帶，3：陰性對(duì)照，無擴(kuò)增產(chǎn)物。

c檢測(cè)結(jié)果為電泳圖，1，2：陽(yáng)性結(jié)果同時(shí)具有控制線和測(cè)試線；3：陰性對(duì)照，只有控制線。

圖3為旱稻孢囊線蟲靈敏度檢測(cè)結(jié)果

a為lamp檢測(cè)電泳圖，m：1000dna標(biāo)準(zhǔn)分子量，單頭孢囊，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和陰性對(duì)照(ck)。

b為普通pcr法檢測(cè)電泳圖，m：100dna標(biāo)準(zhǔn)分子量，，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4個(gè)孢囊及陰性對(duì)照(ck)。

圖4為旱稻孢囊線蟲lamp特異性檢測(cè)結(jié)果

1-7為旱稻孢囊線蟲(he01、he02、he03、he04、he05、he06、he07)，8-22分別為南方根結(jié)線蟲(mi01andmi02),象耳豆根結(jié)線蟲(me01),擬禾本科根結(jié)線蟲(mg01andmg02),北方根結(jié)線蟲m.hapla,爪哇根結(jié)線蟲(mj),花生根結(jié)線蟲(ma),水稻潛根線蟲(ho01andho02),h.mucronata,禾谷孢囊線蟲(ha),菲利普孢囊線蟲(hf),玉米短體線蟲(pz)和tylenchorhynchusannulatus(ta)；23-24為陰性對(duì)照。.

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

所述試劑均為市售，所用測(cè)試線蟲本申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室均有保存，可以免費(fèi)向公眾發(fā)放。

主要試劑：taqdna聚合酶購(gòu)自天根公司；dnamarker購(gòu)自takara公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；pgem-teasyvector購(gòu)于美國(guó)promegaprok(蛋白酶k)購(gòu)自roche公司；bstdna聚合酶大片段購(gòu)自newenglandbiolabs公司；sybrgreeni購(gòu)自invitrogen公司。

實(shí)施例1旱稻孢囊線蟲dna的提取、its擴(kuò)增及序列分析

1.1旱稻孢囊線蟲dna的提取

挑取單個(gè)旱稻孢囊放入裝有10μlddh2o的0.2ml離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用無菌的玻璃棒在離心管中轉(zhuǎn)動(dòng)至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μl的10倍pcr緩沖液，2μl的600μg/ml蛋白酶k溶液，然后在-80℃下冷凍30min。將離心管取出，在65℃下溫育90min，95℃反應(yīng)10min處理后上清液作為線蟲dna模板直接用于lamp和pcr反應(yīng)。

1.2旱稻孢囊線蟲its片段擴(kuò)增及序列分析

應(yīng)用its通用引物tw81和ab28擴(kuò)增旱稻孢囊線蟲its片段。pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為50μl，pcr反應(yīng)體系為10×buffer(含mg²⁺)5μl，10mmdntp4μl，引物tw81和ab28(10μmol/l)各1μl，taq酶(5u/μl,takara)0.5μl，模板dna5μl，滅菌ddh2o補(bǔ)足至50μl。pcr擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min；35個(gè)循環(huán)；72℃再次延伸10min，4℃保存。pcr擴(kuò)增后，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物加1μl加樣緩沖液在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，eb染色，在紫外燈下觀測(cè)并照相回收、克隆和測(cè)序，序列測(cè)定由北京六合華大基因科技有限公司完成。

實(shí)施例2旱稻孢囊線蟲lamp檢測(cè)的建立

2.1lamp引物設(shè)計(jì)

根據(jù)旱稻孢囊線蟲its區(qū)域特異性片段的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)并篩選下述lamp引物(見圖1)，引物交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下：

1)he-f3:5’gctctctgtccatgtcagga-3’

2)he-b3:5’-ccgcaactagcccaatgc-3’

3)he-fip5’-gcaggacagctgcccatgtggcggatcgttcgggagaa-3’

4)he-bip5’-gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg-3’

5)he-lb5’-aggttggagctgggatgcg-3’

2.2lamp反應(yīng)體系配置：

外引物he-f3和he-b3各0.2μmol/l，內(nèi)引物he-fip和he-bip各1.4μmol/l,環(huán)引物he-lb為0.4μmol/l；反應(yīng)混合液：3.2mmol/ldntp,20mmol/ltris-hcl(ph8.8),10mmol/lkcl,3mmol/lmgs04,10mmol/l(nh4)2s04,0.1％tritonx-100,8ubstdna大片段聚合酶；1μldna模板；加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25μl。

2.3lamp反應(yīng)擴(kuò)增條件：將以上混合液置于65℃恒溫水浴中等溫?cái)U(kuò)增45min，85℃保溫10min，反應(yīng)結(jié)束后加入1μl配制好的顯色劑混勻后觀察結(jié)果(圖2-a)。取2μl產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，eb染色，在紫外燈下觀測(cè)并照相，可看到有l(wèi)amp的特征性梯形帶(圖2-b)，加入探針雜交后，插入lfd試紙，發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在測(cè)試帶和控制帶(圖2-c)。

實(shí)施例3旱稻孢囊線蟲lamp靈敏度檢測(cè)

將單頭旱稻普孢囊dna模板按10倍稀釋成1～1.0×10^-76個(gè)濃度，各取1μldna做模板，將上述的引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后，按2.3反應(yīng)條件進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，取3μl產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，eb染色，在紫外燈下觀測(cè)并照相(圖4-a)，在2-5泳道均觀察到lamp的特征性梯形帶，說明dna稀釋1000倍后，仍能夠檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為1/20000頭線蟲。同時(shí)以上述稀釋dna為模板，以外側(cè)引物f3和b3為引物，進(jìn)行常規(guī)pcr檢測(cè)，體系如下：2.5μl10×pcrbuffer(含mg²⁺)，2.5μl10mmdntps，1μlf3和b3(10um)，0.3μltaqdna聚合酶(5u/ul)，1μl模板dna，滅菌ddh2o補(bǔ)足至25μl，采用無線蟲dna模板為陰性對(duì)照。pcr擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，52℃退火30sec，72℃延伸1.5min；35個(gè)循環(huán)；72℃再次延伸10min，4℃保存。pcr擴(kuò)增后，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物加1μl加樣緩沖液在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，eb染色后，凝膠電泳觀察結(jié)果(圖4-b)。結(jié)果表明在dna稀釋到10^-2倍時(shí)，能夠觀察到擴(kuò)增條帶，10^-3和更低的濃度時(shí)常規(guī)pcr則不能檢測(cè)。

以上結(jié)果說明：上述lamp檢測(cè)體系能夠檢測(cè)到1/20000頭旱稻孢囊線蟲，比常規(guī)pcr檢測(cè)靈敏10倍，具有極高的靈敏度。

實(shí)施例4旱稻孢囊線蟲lamp特異性檢測(cè)

收集旱稻孢囊線蟲、禾谷孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲、潛根線蟲短體線蟲等22個(gè)種群(見表1)，分別提取其dna作為模板與旱稻孢囊線蟲dna模板一起進(jìn)行l(wèi)amp檢測(cè)，以檢測(cè)旱稻孢囊線蟲lamp檢測(cè)方法的特異性。

表1供試的其它植物線蟲群體樣品代碼及來源

上述引物混合液和反應(yīng)緩沖混合液混合均勻后，加入1μl模板dna，按2.3的反應(yīng)條件進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后加入1μl配制好的顯色劑混勻后，觀察顏色變化。結(jié)果表明1-7管為旱稻孢囊線蟲dna，可以觀察到綠色熒光，其他植物線蟲和陰性對(duì)照為模板的反應(yīng)均為紅褐色(圖4)。結(jié)果表明上述lamp引物和反應(yīng)體系能夠特異性的檢測(cè)旱稻孢囊線蟲。

sequencelisting

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120>一種旱稻孢囊線蟲lamp快速檢測(cè)方法

<130>pp17088－zwb

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>he-f3序列

<400>1

gctctctgtccatgtcagga20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>he-b3序列

<400>2

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<210>4

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<400>4

gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg40

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<213>he-probe序列

<400>6

cgccgaggttggagctgggatgc23