專利名稱：一種抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)自小麥近緣物種易變山羊草的抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸序列，以及基于該基因通過(guò)生物技術(shù)的方法在植物抗蟲改良方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禾谷孢囊根線蟲(Cereal cyst nematode, Heterodera avenae,)是危害小麥等禾谷類作物的重要土傳病原線蟲，在我國(guó)華北小麥主產(chǎn)區(qū)均有分布，危害面積達(dá)100萬(wàn)公頃以上，嚴(yán)重地區(qū)可導(dǎo)致小麥產(chǎn)量損失達(dá)27% 45%。因此，發(fā)掘抗禾谷孢囊線蟲基因資源，培育抗性小麥新品種迫在眉睫。普通小麥中抗禾谷孢囊線蟲基因資源十分匱乏。從其近緣植物克隆、轉(zhuǎn)移抗性基因，是培育抗根線蟲小麥新品種的重要途徑。目前，有關(guān)抗禾谷孢囊線蟲基因分離的報(bào)道極少。迄今，只有一個(gè)來(lái)自節(jié)節(jié)麥的抗禾谷孢囊線蟲基因fr^ 通過(guò)圖位克隆的被分離出來(lái)， 但對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證等后續(xù)研究卻未見報(bào)到。本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)易變山羊草iAegilops variabilis 2n=28, UvUvSS)對(duì)禾谷孢囊線蟲、根結(jié)線蟲(Meloidogyne ftrnsi)的雙重抗性主要受一對(duì)顯性基因Rkn-mrA控制， 并通過(guò)染色體工程將Ja variabilis 3SV染色體或其小片段轉(zhuǎn)移到小麥，獲得一些抗雙 avenae和ftaasi小麥附加系和重組系，并建立了抗禾谷孢囊線蟲近等基因系“E_10”。為了克隆該基因，應(yīng)用DDRT-PCR技術(shù)和RAP-RCR技術(shù)，獲得與CCN抗性相關(guān)的 EST序列。通過(guò)序列比對(duì)搜索，發(fā)現(xiàn)其中含有與已知抗禾谷孢囊線蟲基因freJ同源的片段。于是，根據(jù)基因核苷酸結(jié)合區(qū)(NBS)設(shè)計(jì)引物，從E-IO基因組DNA中擴(kuò)增得到一個(gè)528bp的非完整開放讀碼框敵(GenBank:AF320845)；接著，在敵基礎(chǔ)上，采用 SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)的方法將敵向 3，端延伸了 1209bp， 采用RACE技術(shù)分別向5 ‘和3 ‘端延伸了 1173 bp和449bp 3 ‘序列，最終拼接得到一個(gè)長(zhǎng)度為3057 bp的基因序列，該序列含2775 bp的完整開放閱讀框，可編碼擬4個(gè)氨基酸， 與Cre3的氨基酸序列一致性為87%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種來(lái)自易變山羊草的抗禾谷孢囊線蟲基因(CreZE)核酸序列及其變體或片段。發(fā)明人在■序列基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)PCR引物，以E-IO基因組DNA 為模板擴(kuò)增獲得一條長(zhǎng)約3600bp左右的片段(圖1)，經(jīng)DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)該片段包含本發(fā)明所提供的長(zhǎng)度為3586 bp的抗禾谷孢囊線蟲基因完整編碼序列(frel)。該序列由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成(圖2)，可編碼934個(gè)氨基酸。CreZE的核苷酸序列如下 ATGGATCCAATTACCATTGCTGCCGTAGGATGGAGCGTGGCCATGGTTGGTTGGGTCGCCTCGGCCACCAT
CTCTAAGCTCCTCGCCAAAGGCTTCGATTACCTCGAATATGACACAGCAAAGAAGCTGGCACAACTTGAGCCAAAAATCTTGGTGCTGGAACGGGTCATGGAAGTTGTCGAGACGAGCCCATACAGGCCTCGTCTAGAGCAGCTGTTCAAGCGG CTTAAATACGCTTTCTATGAAGCCGAAGAAATCTTGGATGCTGTCGAGTATCACTGTCTAGAGAAGCAGATCAAAGC TGGAAAACTACAGCCGGGCGATGGCTCATCTCAACCTAAAAAGGATCGTCTGAAGAAAATAAGGTCTGCCGTGGCCA AGAGCTCGCTCCCGAAAAAGAAGGTACTTTCCTTTCTTCCATTTGTTTTGTGTTCTGTCAGTCCAGCTTTTGTTGTT CCATATATATGTTTGAAGGTACTAGAAACACATCATCAATGGTAAGTCAAATTTTGGCATATCAATGTTTCTTTGGT CATATCCTGTATTTTGCGACCAAAGGTACATAGATATGCCAAACTGGATGTAGCCTAAACCTACATTGAAACTTTTG CAAGGCAAAATTTGGGAAATTCGAACGCTGATCTTGTAGCACAAAATTGCAATACAAGTAGTAGAGAATATTTATTT CTCTTGTATATTGGCGCTGATACTGTAGTCGTCGATTCTGGCTCACATGTATTCCCTTAGATTACCCTTTTGCGGCA CAAAATTCTCTCTCCGAAATCAGCAAATTTCTAGCTCATGAGTATGTTCATATAGTCCATAGAGGGCATGCACACGT GTGTGTGTGTGCCAGATGGTATTGGTATACCTCGGTGATTCCTAGCTCAAGCAGTAGAGAACTAGGTTTAGGGCAAG TGATTTCTCGGTGTATCTAAAAAACCTTGGAGGTTAGACGATTTCCCTATACAAACATTGACTTATTTCTTCATTTA GCGTGGGGATAGTTCGATGTAAAAATTTCTCTCATCTGTATGGTCACGTACAATTATTTTGAAAGACTTTTCACTTG CTATTTGGTGTCGCAGGAGAGTCGTATGTCAAATAAGAAGCTGGTAAAGAGCCTAAAGAAGATAGAGAACATTATAA ATGAAGCACACCAGATTTTGGAGAAGCTTAACTTGTCAAGCATAAGTGATGGCAATATAAGACACACAAAGGTTGTC AATCCTACGACTACCGCAGTTTCCCCACAAAAAGTATTTGGTCGAGATAATGATCGCGACAAGATCATAGCAATGCT TCATGAAAAGGAAGCTGGTCTTGATCCAGGCACTAGCAAAGGTCTATGTTTTTCTGTAATTGGCATACATGGAGTCA GCGGGTCTGGGAAATCTACCCTTGCACAGTTTGTTTATGCCCACGAGAAAAATGACAAGCAAGACAACAAGGAAGAC CATTTTGACCTTGTTATGTGGGTTCATGTCTCTCAGGATTTTAGTGTGTGGGGCATCTTCAAGGAGTTGTATGAGGC AGCTTCAGATCCTAAGGTTCCATGCCCTCAATTTAATAACTTGAATGCCTTGGAAGAAGAACTGGAGAGGAAACTAG ATGGAAAGCGATTCCTTCTGGTACTGGATGATGTCTGGTGCAATGCGGATGTTGGTAACCAGGAGCTACCAAAGTTA CTTTCTCCATTGAAGAAAGGAAAGAAAGGAAGCAAGATCCTAGTGACAACTCGAAGTAAATATGCATTACCGGATCT ATGTCCTGGTGTGAGATATACTGCCATGCCGATAACTGAGGTTGATGATACCGCCTTCTTTGAGCTGTTCATGCATT ATGCCCTCGAAGATGGCCAAGATCAAAGCATGTTCCAGGACATTGGGGTTGAGATTGCAAAAAAGCTGAAGGGGTCA CCTCTAGCAGCTAGAACAGTGGGTGGGAATTTACGTCGACAGCAAGATGTTGACCATTGGAGAAGAGTCGGAGATCA AGACCTTTTCAAGGTATGGACGGGACCTCTGTGGTGGAGCTACTATCAGCTAGGTGAGCAGGCTAGGCGTTGCTTTG CTTACTGCAGTATTTTTCCTAGGAGACATCGCTTGTACCGTGATGAATTAGTTAGACTCTGGATGGCAGAAGGGTTC ATAAGAAACACAGATGAAGGGGCTGATGCTGAAGATGTTGGTCTGGGAATATTTAATGAACTATTGTCGATGTCATT TCTTCAACCAGGAGGCAAGGACTGGTACAATCATGGCAAGGAATACTATTTAGTTCATGATTTACTGCATGATTTAG CAGGGGCAGTAGCTGGAAGTGACTGCTTCAGAATTGACAATAACATGATCCAGAAAGGAGAAAGGTGGGCAAGAGAT GTACCCAGAGACGTTCGTCATCTTTTTGTTCAGAGTTATGATGCAGCATTGATTACAGGGAAGATTCTTTTATTGGA AAATTTACACACACTCATCATTTATAGTGTTGGAGGGGATACACCAGTTGAGGAAATAGTCATCAAGAACATACTCA AGAGTCTGCCGAAACTGCGGGTACTAGCAATAGCTTTATGTCTGGAAAAGGATGGATTTATTTGTAGACCAAATATA TTGTCTGTTCCAGAATCTATTAGCCAATTAAAACATCTACGATATCTTGCTTTCCGGACAGATATTGGATGCAGAGT AATTTTACCAAGCAGTCCAAACCAGCTTTACCAGATGCAGCTGCTAGATTTTGGTGTCTGCATGAATTTGGTATTTT CCTGTGGTGATCTTATCAACTTGCGGCATGTATTCAGCGGTCCTGGATTGCAATTTTCAAACATCGGTAGGCTTGTC TCACTCCAAACAATCCCAGCACTCAAAGTAAGTCATGAACAAGGACATGAGGCAAAGCAGTTGAGGTACCTAAACAG GCTCAGCGGCGAACTGAGTATATATGGTCTCCGAAGTGTTGAAAGCAGAGAGGAAGCTCTTGCATTCGATCTAGCTG CCAAGAAACGGCTCACAGAACTAACACTATCACTCGGTGGAAGTTCAAAAGTTGCGGCAGAGGTACTTGAGGGCCTT TGTCCTCCCGTGGGGCTTGTAACACTCGACATCCGTGACTACGATGGTTTGGTATACCCAAAGTGGATGGTGGGTAGGCAAAATGGCGGACCAGAGAAGCTGCAACAACTTGGTCTCTCTGGATGGAGCCAGCCAGGGCCTGCTCCTGCACTGA AGGCTTTCAATCATCTTCGTTGCCTCAATCTGATGCACTGCAGCTGGAACGCCTTGCCATGCAATATGGAGCACCTC AGCTCTCTGGAAACAGTAATCATTATTAAATGTTTGAATATCCGGTCGCTTCCAACGCTGCCACAGTCCCTTACGTA TTTTTGGCTCCTGAAGTGCGACGATGGGTTTATGGAGTCTTGTCAAACAGTTGGACATCCAAACTGGAAAAAGATTC AACATATCTGCAGGAAATATTTTAGGTGAAGAATGCAATCCCCCTTGTAGAGCGTTTCTTTATGAATTGTTATTAGT GACCACCACCTATGTTCTCTAACACATGTGCTTCCCTTTCTAGTGAATGA 。通過(guò)本發(fā)明獲得的CreZE基因序列得到的CreZE的氨基酸序列如下
MDPITIAAVGffSVAMVGffVASATISKLLAKGFDYLEYDTAKKLAQLEPKILVLERVMEVVETSPYRPRLEQL FKRLKYAFYEAEEILDAVEYHCLEKQIKAGKLQP⑶GSSQPKKDRLKKIRSAVAKSSLPKKKESRMSNKKLVKSLKK IENIINEAHQILEKLNLSSISDGNIRHTKVVNPTTTAVSPQKVFGRDNDRDKIIAMLHEKEAGLDPGTSKGLCFSVI GIHGVSGSGKSTLAQFVYAHEKNDKQDNKEDHFDLVMWVHVSQDFSVWGIFKELYEAASDPKVPCPQFNNLNALEEE LERKLDGKRFLLVLDDVWCNADVGNQELPKLLSPLKKGKKGSKILVTTRSKYALPDLCPGVRYTAMPITEVDDTAFF ELFMHYALEDGQDQSMFQDIGVEIAKKLKGSPLAARTVGGNLRRQQDVDHWRRV⑶QDLFKVWTGPLffffSYYQLGEQ ARRCFAYCSIFPRRHRLYRDELVRLWMAEGFIRNTDEGADAEDVGLGIFNELLSMSFLQPGGKDWYNHGKEYYLVHD LLHDLAGAVAGSDCFRIDNNMIQKGERWARDVPRDVRHLFVQSYDAALITGKILLLENLHTLIIYSVGGDTPVEEIV IKNILKSLPKLRVLAIALCLEKDGFICRPNILSVPESISQLKHLRYLAFRTDIGCRVILPSSPNQLYQMQLLDFGVC MNLVFSCGDLINLRHVFSGPGLQFSNIGRLVSLQTIPALKVSHEQGHEAKQLRYLNRLSGELSIYGLRSVESREEAL AFDLAAKKRLTELTLSLGGSSKVAAEVLEGLCPPVGLVTLDIRDYDGLVYPKWMVGRQNGGPEKLQQLGLSGWSQPG PAPALKAFNHLRCLNLMHCSWNALPCNMEHLSSLETVIIIKCLNIRSLPTLPQSLTYFWLLKCDDGFMESCQTVGHP NWKKIQHICRKYFSE 。在本申請(qǐng)的說(shuō)明書和權(quán)利要求書中使用的以下術(shù)語(yǔ)具有如下的含義
“變體”是指對(duì)一個(gè)目的DNA序列進(jìn)行一個(gè)或者多個(gè)堿基的任何取代、變異、修飾、替換、 缺失或者添加所產(chǎn)生的序列，該序列仍然表現(xiàn)出類似于所述目的DNA序列的活性?！捌巍?是指基本DNA序列的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，其仍然具有類似于基本DNA序列的活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，frel在E-IO的根部特異表達(dá)(圖3)，并且隨著侵染禾谷孢囊線蟲時(shí)間的增長(zhǎng)，表達(dá)量顯著升高(圖3、圖4)。表明該基因表達(dá)受到禾谷孢囊線蟲侵染的調(diào)控。本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)在
普通小麥中抗禾谷孢囊線蟲基因資源十分匱乏。從其近緣植物克隆、轉(zhuǎn)移抗性基因，是培育抗根線蟲小麥新品種的重要途徑。目前，有關(guān)抗禾谷孢囊線蟲基因分離的報(bào)道極少。雖然已報(bào)到通過(guò)圖位克隆從山羊草屬的節(jié)節(jié)麥Ma tauschii)中分離獲得了的抗禾谷孢囊線蟲基因fr^ ，但對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證等后續(xù)研究卻未見報(bào)到。本發(fā)明人通過(guò)數(shù)年研究，先后利用DDRT-PCR、RAP-RCR、SON-PCR、RACE等技術(shù)最終從抗禾谷孢囊線蟲近等基因系E-IO中獲得了抗禾谷孢囊線蟲基因CreZE。通過(guò)對(duì)E-IO人工接種線蟲，對(duì)CreZE的表達(dá)譜進(jìn)行了深入分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了其功能，表明CreZE與禾谷孢囊線蟲抗性密切相關(guān)，是重要的基因資源?？蓪⒈景l(fā)明所提供的抗禾谷孢囊線蟲基因構(gòu)建至植物真核表達(dá)載體中，通過(guò)基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道等本領(lǐng)域研究人員共知的方法導(dǎo)入普通大麥、青稞、小麥、水稻等單子葉植物，或番茄、煙草等雙子葉植物中，使其過(guò)量表達(dá)。該基因在提高植物對(duì)線蟲的抗(耐受)性、通過(guò)基因工程手段進(jìn)行植物抗線蟲改良等領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。


圖1. CreZE的PCR擴(kuò)增結(jié)果
M: DNA分子量標(biāo)注，1 一 4為以E-IO總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果。圖2. CreZE基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖
黑框表示外顯子，白框表示內(nèi)含子，框中數(shù)值表示堿基對(duì)數(shù)(單位bp)，ATG和TGA分別表示起始密碼子和終止密碼子。圖3. frel在不同組織和不同侵染階段的半定量PCR檢測(cè)結(jié)果
A 表示在被侵染的E-IO根部的表達(dá)水平，B 表示在未被侵染的E-IO根部的表達(dá)水平，C 表示在被侵染的E-IO葉內(nèi)的表達(dá)水平，Un 表示未被侵染的ElO的根或葉，ld_15d 接種禾谷孢囊線蟲后的1天、5天、10天、15天。圖4.接種禾谷孢囊線蟲后frel在E-IO根部表達(dá)情況。χ軸表示接種天數(shù)，y軸表示基因表達(dá)水平；1(1、5(1、10(1、15(1、分別表示接種禾谷孢囊線蟲1天、5天、10天、15天后； 左側(cè)斜格線柱子表示在未接種線蟲的E-IO根部情況，右側(cè)網(wǎng)格線柱子表示fraZ 在接種線蟲的E-IO根部情況。
具體實(shí)施例方式
l.frel基因完整編碼區(qū)克隆及測(cè)序 1. ■全長(zhǎng)基因序列擴(kuò)增根據(jù)拼接得到的基因序列設(shè)計(jì)引物 Pl: 5' -GGACTAGTCTATCTGTCTGTAGTGATGGAT-3’
Ρ2: 5，-AAAGCTGGGATTCCAAGCCCGCGTCATTC-3，用于全長(zhǎng)基因序列的擴(kuò)增；
PCR擴(kuò)增體系
ElO基因組DNA
10XLA PCR Buffer
dNTP (各 2. 5mmol/L)
正/反向引物(10ymol/L)
TaKaRa LA TaqDNA (5U/y L)
Mg2+ (25mmol/L)
1 μ L
2 μ L 5 μ L 4 μ L 各3 μ L
3 μ L
力口 dH20 M 50 μ L0
反應(yīng)循環(huán)條件94°C 5min; 94°C 1 min, 60°C 1 min，72°C 2.5 min, 35 cycles; 72°C 7 min;4°C 保溫。
1. 2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)和回收
(1)將50μ L PCR產(chǎn)物與DNA上樣緩沖液一起加入到1.洲的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，在 5v/cm的電壓下電泳；
(2)當(dāng)溴酚藍(lán)達(dá)一定位置時(shí)，停止電泳，把凝膠放入EB中染色15-20min，在紫外燈下用一新的鋒利手術(shù)刀片對(duì)照DNA Marker切下所要回收的DNA目的帶，盡量去除不含DNA的瓊脂膠，轉(zhuǎn)入1. 5mL干凈的離心管中；(3)按每IOOmg凝膠加入350μ L膠回收Binding Buffer,與60°C水浴鍋中放置&iiin， 每2-;3min搖動(dòng)混勻一次；
(4)將融化的凝膠轉(zhuǎn)入回收柱中，并將回收柱放入收集管中，室溫下以8，OOOrpm離心 Imin ；
(5)取下回收柱，倒掉收集管中的溶液，重新將回收柱放入收集管中，加入Wash solution 700 μ L，室溫下以8，OOOrpm離心Imin后再重復(fù)洗滌一次；
(6)將回收柱放入另一個(gè)干凈的1.5mL離心管中，加入20 40μ L Elution Buffer (如果加dH20, PH要高于7. 0)于回收柱膜上，室溫靜置2min，8，OOOrpm離心Imin ；
(7)回收目的基因片段通過(guò)電泳檢測(cè)后，于-20°C保存用于pMDlS-T連接轉(zhuǎn)化。1. 3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
(1)用無(wú)菌鉬絲直接蘸取凍存的大腸桿菌JM109菌液，在LB瓊脂平板表面劃線，于 37 °C 培養(yǎng) 16h ；
(2)從培養(yǎng)后的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落接種于2mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩 (200rpm)過(guò)夜培養(yǎng)；
(3)取0.5ml活化的菌液轉(zhuǎn)入含50ml LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C振蕩(200rpm) 培養(yǎng)約2-3h，使0D_值為0. 35左右(活細(xì)胞數(shù)務(wù)必小于IO8個(gè)細(xì)胞/mL)；
(4)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，冰上放置IOmin；
(5)4000rpm, 4°C，離心 IOmin,回收細(xì)胞；
(6)倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin使培養(yǎng)液流盡；
(7)用冰冷的10mL 0. IM CaCl2溶液(經(jīng)抽濾滅菌)懸浮沉淀，立即放在冰上保溫 30min ；
(8)6000rpm，4°C，離心lOmin，回收細(xì)胞；
(9)用冰冷的2mL 0. IM CaCl2溶液懸浮細(xì)胞(務(wù)必放在冰上)；
(10)分裝成200μ L/份。此細(xì)胞即為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞； 1.4目的產(chǎn)物與T-載體連接
T-載體和連接緩沖液放在冰上融化。將T-載體和對(duì)照連接DNA (control insert DNA)作短暫離心；
建立連接反應(yīng)體系(10 μ L總反應(yīng)體積) 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照
連接緩沖液5 μ L5 μ L
Τ-載體(50ng/y L)0. 5 μ L0. 5 μ L
PCR回收產(chǎn)物4.5yL-
對(duì)照連接DNA-2 μ L
去離子水加至終體積IOyLIOyL
將反應(yīng)液混勻并短暫離心，在16°C下連接過(guò)夜。1.5大腸桿菌高效轉(zhuǎn)化
(1)取200 μ L新鮮配制的感受態(tài)細(xì)胞(若是冰存的，需在冰上融化后立即使用)加入 5μ L上述連接產(chǎn)物混勻，同時(shí)在一管感受態(tài)細(xì)胞中加入PUC18質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。冰浴 30min ；(2)42°C熱激90s(其間不能搖動(dòng))，立即冰浴5min ；
(3)加0.8mL 37°C保溫的SOC培養(yǎng)基(也可用LB培養(yǎng)基)，混勻37 °C在搖床中50r/min 恢復(fù)培養(yǎng)1. 5-2h ；
(4)4000印111，41，離心51^11，菌體沉淀用150μ L SOC培養(yǎng)基(或取上清，留下150 μ L SOC培養(yǎng)基)吹散；
(5)均勻地涂布在含ampicillin(50_100mg/L)的LB平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。1.6質(zhì)粒DNA小量提取
(1)挑取E.coli單菌落接種于含有ampicillin (50_100mg/L)的3mL LB液體培養(yǎng)基， 37 °C，搖床培養(yǎng)12-1 ；
(2)取2mL菌液轉(zhuǎn)入1.5mL EP管中，13000rpm離心Imin (其余菌液用做菌液保存)。 棄去上清液，將EP管倒立，使殘余液體控干；
(3)用100μ L溶液I懸浮沉淀，劇烈振蕩混勻；
(4)加入200μ L新鮮配置的溶液II，蓋上EP管，快速顛倒數(shù)次，混勻內(nèi)含物(不要渦旋)JfEP管放置在冰上；
(5)加入150μ L冰預(yù)冷的溶液III，蓋上EP管，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液III在黏綢的細(xì)菌裂解物中分散均勻，冰浴3-5min ；
(6)40C，13000rpm離心5min，上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)EP管；
(7)加等體積酚，氯仿，異戊醇(25^4:1)混合有機(jī)溶劑，振蕩混勻有機(jī)相和水相， 13000rpm 離心 5min ；
(8)轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)1.5mL的EP管中，加2倍體積_20°C的無(wú)水乙醇，振蕩混合后， 室溫放置anin沉淀質(zhì)粒DNA ；
(9)40C，13000rpm離心5min，棄去上清液，控干；
(10)加入ImL70%乙醇洗滌沉淀，4°C，13000rpm離心5min回收質(zhì)粒DNA ；
(11)控干液體，并將EP管開口放置于37°C烘箱，使酒精揮發(fā)完；
(12)加入含20mg/LRNA酶的50 μ L無(wú)菌去離子水或TE溶解DNA，37°C保溫2h ； *溶液I (用前現(xiàn)配)
50mM葡萄糖(glucose )
25mMTris-Cl (pH 8. 0)
IOmMEDTA (pH 8.0)
*溶液II
0. 2mM NaOH (10mol/L 貯存液)、1% SDS，用前配制； *溶液III
5M KAC60mL
冰乙酸11.5mL
水28. 5mL 。1.7限制性內(nèi)切酶酶切鑒定重組子
建立10 μ L酶切反應(yīng)體系質(zhì)粒DNA 5 μ L，IOX酶切緩沖液1 μ L，限制性內(nèi)切酶幻w I (10U/yL)0. 5yL，限制性內(nèi)切酶 Ai I (10U/μ L) 0. 5 μ L, ddH20 3 μ L0 37 °C 下保溫 3h， 65°C加熱IOmin以終止酶切反應(yīng)。
1.8序列的測(cè)定與分析
陽(yáng)性克隆送至上海英駿公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。相似性比較在NCBI站點(diǎn)用BLAST完成。序列比對(duì)用 http://www. ebi. ac. uk/ 站點(diǎn) CluatalW 完成。2.禾谷孢囊線蟲侵染及RNA提取。2. 1禾谷孢囊線蟲的收集和孵化
自然條件下，在禾谷孢囊線蟲的孵化期從感病的小麥田間采集土樣，置聚乙烯袋內(nèi)運(yùn)回，先通過(guò)漂浮法分離，再在解剖鏡下室內(nèi)用毛筆收集孢囊；
將收集到的孢囊通過(guò)淺盤法孵化。取200目篩放培養(yǎng)皿中，加水置剛剛浸過(guò)篩底；將孢囊放入篩上，水中可加入小麥浸提物以刺激線蟲孵化，4°C培養(yǎng)30-60天；16-18°C左右孵化，其間隨時(shí)加水及注意線蟲孵化情況；逐日收集孵出的2齡幼蟲，孵化出的2齡幼蟲只能在水中存活一周左右，可放于4°C冰箱內(nèi)延長(zhǎng)線蟲生活期，待線蟲收集到足夠數(shù)量用于接種。2. 2孢囊線蟲接種
寄主種子催芽后分別播入盛有消毒土 (土與沙1 :1混合)的小缽(7X10cm)中，同時(shí)在培養(yǎng)小麥根部滴加幼蟲懸浮液Iml，接種量約3000條二齡幼蟲/缽。每種材料重復(fù)5次，在人工控制的光照生長(zhǎng)室內(nèi)生長(zhǎng)，溫度控制在16-18°C，每天光照14小時(shí)。2. 3 總 RNA 提取
提取接種禾谷孢囊線蟲1天、5天、10天、15天后ElO根部總RNA，提取過(guò)程參照TaKaRa 公司RNAiso Reagent RNA提取試劑盒進(jìn)行；
(1)將足夠的1.5mL和2. OmL離心管、吸頭、0. 5mL的PCR管浸泡于配制好的0. 1%的 DEPC水中，37°C放置過(guò)夜，取出，高壓滅菌30min，烘干備用；玻璃器皿用0. 5N的NaOH處理， 80°C烘4小時(shí)以上；
(2)將待提植物根部用DEPC處理過(guò)的水清洗干凈，分別剪取約500mg根和葉，馬上加入液氮，充分研磨后轉(zhuǎn)入2mL的離心管中，研磨過(guò)程中避免樣品潮解；
(3)立即加入TRNzol-RNA植物總RNA提取試lmL，上下顛倒20秒，室溫下靜置3-5min 后，加入600 μ L氯仿，劇烈震蕩混勻30秒后置于冰上約IOmin ；
(4)4°C，12000g離心15min，溶液分為三層，將最上層溶液轉(zhuǎn)移到RNase-free1. 5ml的離心管里，加入等體積的異丙醇，室溫下放置5min ；
(5)4°C,12000g離心IOmin,小心地倒掉上清，用70%的酒精洗滌兩次，每次700 μ L， 12，000 rpm,室溫離心 2min ；
(6)沉淀用30-50 μ L DEPC-H2O (0.01%)溶解，加入 RNase-free DNA 酶，37°C，30min 除去溶液中的DNA;
(7)用酚氯仿異戊醇(2524 :1)抽提2次，小心倒掉上清，4°C，12000g離心lmin，用 RNase-free吸頭吸去殘留液，室溫放置IOmin ；
(8)提取出的總RNA 用無(wú) RNase 的 DNase I (TaKaRa) (3 U /10 ng RNA)37°C處理 30
min ；
(9)加入0.01%的DEPC水30-40 μ L，于_70°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?. 4總RNA質(zhì)量檢測(cè)
提取的總RNA質(zhì)量對(duì)后續(xù)基因克隆影響較大，必須保證很高的完整性和純度。提取得到的總RNA可用1. 2%瓊脂糖電泳檢測(cè)完整性。電泳槽，梳子等試驗(yàn)器材用95%酒精洗后， 3% H2O2浸泡lOmin，三蒸水沖洗兩遍，加入新鮮配制的TAE緩沖液。80V電泳30min，EB染色；
總RNA在核酸蛋白儀上測(cè)定濃度及OD26Q/OD28Q比值，并用DEPC處理過(guò)的水稀釋RNA至 1 μ g/ μ L備用?？俁NA稀釋時(shí)，終濃度不應(yīng)過(guò)低，否則容易降解。
2. 5 逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR)
第1鏈cDNA的合成將總RNA樣品通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定樣品在^Onm和觀0 nm的吸收值確定RNA的質(zhì)量和純度，并將樣品稀釋為1. O μ g/ μ L，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下
(1)在Microtube管中配制模板RNA/引物混合液，全量6μL ；
模板 RNA (1.0 μ g/μ L)IuL
引物 Oligo(dT)w (50ymol/L)IyL
力口 RNase free dH20 至 6 μ L ；
70°C保溫IOmin后迅速冰上急冷^iin以上；離心數(shù)秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集于Microtube管底部；
(2)在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液；
6 μ L
2μ L 1 μ L
0. 25 μ L 0. 5μ L
上述模板RNA/引物的變性溶液 5X M-MLV Buffer dNTP (各 10mmol/L) RNase Inhibitor (40U/y L) RNase M-MLV (Rnase F) (200U/μ L) RNase free dH20 至 10 μ L ；
42°C保溫Ih (以Random Primers作為反轉(zhuǎn)錄引物時(shí)應(yīng)先進(jìn)行30°C反應(yīng)lOmin，然后再在42V保溫Ih)；70°C保溫15min后冰上冷卻，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-Mrand cDNA的合成或者PCR擴(kuò)增等，PCR擴(kuò)增時(shí)cDNA溶液的使用量為1 μ L -5 μ L。3 frel半定量表達(dá)分析
采用半定量PCR初步研究禾谷孢囊線蟲抗性基因CreZ在不同組織、不同誘導(dǎo)階段的的表達(dá)模式。采用先用小麥〃J 基因作為內(nèi)參，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物單鏈cDNA為模板
進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使不同的樣品所擴(kuò)增的a-tubulin J 的量一致(以電泳條帶的光密度值計(jì)量)，進(jìn)一步確定所需的單鏈cDNA的模板量，然后進(jìn)行樣品的半定量PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系
cDNA 模板LOyL
IOXBuffer2. 5 μ L
Mg2+ (25mmol/L)1. 5μ L
dNTP (2. 5mmol/L)2μ L
Primer(P1ZP2, 10ymol/L)各 IyL
TagOM 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ L
力口 dH20 至 25 μ L ；
反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94°C預(yù)變性5min，94°C 45 s,60°C 45 s, 72°C 1 min,經(jīng)；35個(gè)循環(huán)后， 72°C終延伸7min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1. 2%瓊脂糖凝膠上分離。
11
4 frel實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析。4. 1目的基因和內(nèi)參基因的引物專一性檢測(cè)
(1)以接種前后ElO的根部cDNA為模板，對(duì)freZ基因和內(nèi)參a-toto/i/^基因進(jìn)行引物專一性檢測(cè)，反應(yīng)體系如下
逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物l.OyL
ExTaqmk 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ L IOX Buffer2. 5 μ L
Mg2+ (25mmol/L)1. 5μ L
dNTP(2. 5mmol/L)2. 0 μ L
基因特異引物P1A32(IOymoVL)各2. 0 μ L
力口 dH20 至 25 μ L ；
反應(yīng)參數(shù)為 95°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s, 72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸 8min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；
(2)以接種前后ElO根部的cDNA，進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因的SYBRGreen定量PCR，檢測(cè)它們的裂解曲線(Melt curve)與基準(zhǔn)曲線(PCR base line substracted curve fit), 判斷目的基因和內(nèi)參基因引物的專一性。4. 2擴(kuò)增效率檢測(cè)
以接種前后ElO的根部cDNA為模板，同時(shí)對(duì)CreZ基因和內(nèi)參α -toto/i/^基因進(jìn)行擴(kuò)增效率檢測(cè)；
用上述10倍梯度稀釋的PCR產(chǎn)物為模板，采用優(yōu)化好的條件進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR，每個(gè)生物學(xué)樣品都至少進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)稀釋度設(shè)2個(gè)平行，以Ct值為縱坐標(biāo)，以稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲。4. 3 SYBR Green 定量 PCR 檢測(cè)
根據(jù)目的基因和內(nèi)參的反應(yīng)參數(shù)，對(duì)接種及未接種ElO根總RNA逆轉(zhuǎn)錄樣品進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)在禾谷孢囊線蟲不同誘導(dǎo)時(shí)間處理后，CreZ基因在不同時(shí)間段相對(duì)表達(dá)水平；
反應(yīng)體系為(20 μ L)
SYBR Green Supermix (TAKARA)10 μ L
Primer F1 μ L
Primer R1 μ L
cDNA (cDNA模板取IOyL加水30 μ L稀釋)8 μ L
目的基因CreZ和內(nèi)參σ -tubulin 2的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)同時(shí)在Eppendorf Mastercycle realplex Real-Time Detection System實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀上進(jìn)行，相關(guān)反應(yīng)參數(shù)為 94°C 4 min ；94°C 20 s, 54°C 20s, 72°C 20s 40 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸 8min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線分析來(lái)確定PCR產(chǎn)物的單一性。所有樣品在同一次試驗(yàn)的同一 PCR模塊中進(jìn)行。freZ基因在沒有侵染的ElO的根部不同時(shí)期的表達(dá)情況作為對(duì)照。4. 4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)處理
每種材料的禾谷孢囊線蟲誘導(dǎo)處理樣品被取樣2次，用于freZ基因的相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)每次每個(gè)樣品被重復(fù)3個(gè)復(fù)管用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定目的基因(freZ基因)與內(nèi)參基因(檢測(cè)的線性范圍，目的基因的相對(duì)表達(dá)水平通過(guò) 2 分析(Δ Ct-Ctj^rez-Ctj α -tubulin2) °
SEQUENCE LISTING 〈110〉中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所 〈120〉一種抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸 序列及其用途 〈130〉說(shuō)明書 〈160〉 2
<170> PatentIn version 3. 3 〈210〉 1 〈211〉 3586 〈212〉 DNA
<213> Aegilops variabilis 〈400〉 1
atggatccaa ttaccattgc tgccgtagga tggagcgtgg ccatggttgg ttgggtcgcc60
tcggccacca tctctaagct cctcgccaaa ggcttcgatt acctcgaata tgacacagca120
aagaagctgg cacaacttga gccaaaaatc ttggtgctgg aacgggtcat ggaagttgtc180
gagacgagcc catacaggcc tcgtctagag cagctgttca agcggcttaa atacgctttc240
tatgaagccg aagaaatctt ggatgctgtc gagtatcact gtctagagaa gcagatcaaa300
gctggaaaac tacagccggg cgatggctca tctcaaccta aaaaggatcg tctgaagaaa360
ataaggtctg ccgtggccaa gagctcgctc ccgaaaaaga aggtactttc ctttcttcca420
tttgttttgt gttctgtcag tccagctttt gttgttccat atatatgttt gaaggtacta480
gaaacacatc atcaatggta agtcaaattt tggcatatca atgtttcttt ggtcatatcc540
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tgtgtgtgtg tgccagatgg tattggtata cctcggtgat tcctagctca agcagtagag900
aactaggttt agggcaagtg atttctcggt gtatctaaaa aaccttggag gttagacgat960
ttccctatac aaacattgac ttatttcttc atttagcgtg gggatagttc gatgtaaaaa1020
tttctctcat ctgtatggtc acgtacaatt attttgaaag acttttcact tgctatttgg1080
tgtcgcagga gagtcgtatg tcaaataaga agctggtaaa gagcctaaag aagatagaga1140
acattataaa tgaagcacac cagattttgg agaagcttaa cttgtcaagc ataagtgatg1200
gcaatataag acacacaaag gttgtcaatc ctacgactac cgcagtttcc ccacaaaaag1260
tatttggtcg agataatgat cgcgacaaga tcatagcaat gcttcatgaa aaggaagctg1320
gtcttgatcc aggcactagc aaaggtctat gtttttctgt aattggcata catggagtca1380
gcgggtctgg gaaatctacc cttgcacagt ttgtttatgc ccacgagaaa aatgacaagc1440
aagacaacaa ggaagaccat tttgaccttg ttatgtgggt tcatgtctct caggatttta1500
權(quán)利要求
1. 一種抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸序列，其特征是含有以下基因片段 ATGGATCCAATTACCATTGCTGCCGTAGGATGGAGCGTGGCCATGGTTGGTTGGGTCGCCTCGGCCACCATC TCTAAGCTCCTCGCCAAAGGCTTCGATTACCTCGAATATGACACAGCAAAGAAGCTGGCACAACTTGAGCCAAAAAT CTTGGTGCTGGAACGGGTCATGGAAGTTGTCGAGACGAGCCCATACAGGCCTCGTCTAGAGCAGCTGTTCAAGCGGC TTAAATACGCTTTCTATGAAGCCGAAGAAATCTTGGATGCTGTCGAGTATCACTGTCTAGAGAAGCAGATCAAAGCT GGAAAACTACAGCCGGGCGATGGCTCATCTCAACCTAAAAAGGATCGTCTGAAGAAAATAAGGTCTGCCGTGGCCAA GAGCTCGCTCCCGAAAAAGAAGGTACTTTCCTTTCTTCCATTTGTTTTGTGTTCTGTCAGTCCAGCTTTTGTTGTTC CATATATATGTTTGAAGGTACTAGAAACACATCATCAATGGTAAGTCAAATTTTGGCATATCAATGTTTCTTTGGTC ATATCCTGTATTTTGCGACCAAAGGTACATAGATATGCCAAACTGGATGTAGCCTAAACCTACATTGAAACTTTTGC AAGGCAAAATTTGGGAAATTCGAACGCTGATCTTGTAGCACAAAATTGCAATACAAGTAGTAGAGAATATTTATTTC TCTTGTATATTGGCGCTGATACTGTAGTCGTCGATTCTGGCTCACATGTATTCCCTTAGATTACCCTTTTGCGGCAC AAAATTCTCTCTCCGAAATCAGCAAATTTCTAGCTCATGAGTATGTTCATATAGTCCATAGAGGGCATGCACACGTG TGTGTGTGTGCCAGATGGTATTGGTATACCTCGGTGATTCCTAGCTCAAGCAGTAGAGAACTAGGTTTAGGGCAAGT GATTTCTCGGTGTATCTAAAAAACCTTGGAGGTTAGACGATTTCCCTATACAAACATTGACTTATTTCTTCATTTAG CGTGGGGATAGTTCGATGTAAAAATTTCTCTCATCTGTATGGTCACGTACAATTATTTTGAAAGACTTTTCACTTGC TATTTGGTGTCGCAGGAGAGTCGTATGTCAAATAAGAAGCTGGTAAAGAGCCTAAAGAAGATAGAGAACATTATAAA TGAAGCACACCAGATTTTGGAGAAGCTTAACTTGTCAAGCATAAGTGATGGCAATATAAGACACACAAAGGTTGTCA ATCCTACGACTACCGCAGTTTCCCCACAAAAAGTATTTGGTCGAGATAATGATCGCGACAAGATCATAGCAATGCTT CATGAAAAGGAAGCTGGTCTTGATCCAGGCACTAGCAAAGGTCTATGTTTTTCTGTAATTGGCATACATGGAGTCAG CGGGTCTGGGAAATCTACCCTTGCACAGTTTGTTTATGCCCACGAGAAAAATGACAAGCAAGACAACAAGGAAGACC ATTTTGACCTTGTTATGTGGGTTCATGTCTCTCAGGATTTTAGTGTGTGGGGCATCTTCAAGGAGTTGTATGAGGCA GCTTCAGATCCTAAGGTTCCATGCCCTCAATTTAATAACTTGAATGCCTTGGAAGAAGAACTGGAGAGGAAACTAGA TGGAAAGCGATTCCTTCTGGTACTGGATGATGTCTGGTGCAATGCGGATGTTGGTAACCAGGAGCTACCAAAGTTAC TTTCTCCATTGAAGAAAGGAAAGAAAGGAAGCAAGATCCTAGTGACAACTCGAAGTAAATATGCATTACCGGATCTA TGTCCTGGTGTGAGATATACTGCCATGCCGATAACTGAGGTTGATGATACCGCCTTCTTTGAGCTGTTCATGCATTA TGCCCTCGAAGATGGCCAAGATCAAAGCATGTTCCAGGACATTGGGGTTGAGATTGCAAAAAAGCTGAAGGGGTCAC CTCTAGCAGCTAGAACAGTGGGTGGGAATTTACGTCGACAGCAAGATGTTGACCATTGGAGAAGAGTCGGAGATCAA GACCTTTTCAAGGTATGGACGGGACCTCTGTGGTGGAGCTACTATCAGCTAGGTGAGCAGGCTAGGCGTTGCTTTGC TTACTGCAGTATTTTTCCTAGGAGACATCGCTTGTACCGTGATGAATTAGTTAGACTCTGGATGGCAGAAGGGTTCA TAAGAAACACAGATGAAGGGGCTGATGCTGAAGATGTTGGTCTGGGAATATTTAATGAACTATTGTCGATGTCATTT CTTCAACCAGGAGGCAAGGACTGGTACAATCATGGCAAGGAATACTATTTAGTTCATGATTTACTGCATGATTTAGC AGGGGCAGTAGCTGGAAGTGACTGCTTCAGAATTGACAATAACATGATCCAGAAAGGAGAAAGGTGGGCAAGAGATG TACCCAGAGACGTTCGTCATCTTTTTGTTCAGAGTTATGATGCAGCATTGATTACAGGGAAGATTCTTTTATTGGAA AATTTACACACACTCATCATTTATAGTGTTGGAGGGGATACACCAGTTGAGGAAATAGTCATCAAGAACATACTCAA GAGTCTGCCGAAACTGCGGGTACTAGCAATAGCTTTATGTCTGGAAAAGGATGGATTTATTTGTAGACCAAATATAT TGTCTGTTCCAGAATCTATTAGCCAATTAAAACATCTACGATATCTTGCTTTCCGGACAGATATTGGATGCAGAGTA ATTTTACCAAGCAGTCCAAACCAGCTTTACCAGATGCAGCTGCTAGATTTTGGTGTCTGCATGAATTTGGTATTTTC CTGTGGTGATCTTATCAACTTGCGGCATGTATTCAGCGGTCCTGGATTGCAATTTTCAAACATCGGTAGGCTTGTCT CACTCCAAACAATCCCAGCACTCAAAGTAAGTCATGAACAAGGACATGAGGCAAAGCAGTTGAGGTACCTAAACAGGCTCAGCGGCGAACTGAGTATATATGGTCTCCGAAGTGTTGAAAGCAGAGAGGAAGCTCTTGCATTCGATCTAGCTGC CAAGAAACGGCTCACAGAACTAACACTATCACTCGGTGGAAGTTCAAAAGTTGCGGCAGAGGTACTTGAGGGCCTTT GTCCTCCCGTGGGGCTTGTAACACTCGACATCCGTGACTACGATGGTTTGGTATACCCAAAGTGGATGGTGGGTAGG CAAAATGGCGGACCAGAGAAGCTGCAACAACTTGGTCTCTCTGGATGGAGCCAGCCAGGGCCTGCTCCTGCACTGAA GGCTTTCAATCATCTTCGTTGCCTCAATCTGATGCACTGCAGCTGGAACGCCTTGCCATGCAATATGGAGCACCTCA GCTCTCTGGAAACAGTAATCATTATTAAATGTTTGAATATCCGGTCGCTTCCAACGCTGCCACAGTCCCTTACGTAT TTTTGGCTCCTGAAGTGCGACGATGGGTTTATGGAGTCTTGTCAAACAGTTGGACATCCAAACTGGAAAAAGATTCA ACATATCTGCAGGAAATATTTTAGGTGAAGAATGCAATCCCCCTTGTAGAGCGTTTCTTTATGAATTGTTATTAGTG ACCACCACCTATGTTCTCTAACACATGTGCTTCCCTTTCTAGTGAATGA。
2.權(quán)利要求1所述的抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸序列，其氨基酸序列如下MDPITIAAVGffSVAMVGffVASATISKLLAKGFDYLEYDTAKKLAQLEPKILVLERVMEWETSPYRPRLEQL FKRLKYAFYEAEEILDAVEYHCLEKQIKAGKLQPGDGSSQPKKDRLKKIRSAVAKSSLPKKKESRMSNKKLVKSLKK IENIINEAHQILEKLNLSSISDGNIRHTKVVNPTTTAVSPQKVFGRDNDRDKIIAMLHEKEAGLDPGTSKGLCFSVI GIHGVSGSGKSTLAQFVYAHEKNDKQDNKEDHFDLVMWVHVSQDFSVWGIFKELYEAASDPKVPCPQFNNLNALEEE LERKLDGKRFLLVLDDVWCNADVGNQELPKLLSPLKKGKKGSKILVTTRSKYALPDLCPGVRYTAMPITEVDDTAFF ELFMHYALEDGQDQSMFQDIGVEIAKKLKGSPLAARTVGGNLRRQQDVDHWRRV⑶QDLFKVWTGPLffffSYYQLGEQ ARRCFAYCSIFPRRHRLYRDELVRLWMAEGFIRNTDEGADAEDVGLGIFNELLSMSFLQPGGKDWYNHGKEYYLVHD LLHDLAGAVAGSDCFRIDNNMIQKGERWARDVPRDVRHLFVQSYDAALITGKILLLENLHTLIIYSVGGDTPVEEIV IKNILKSLPKLRVLAIALCLEKDGFICRPNILSVPESISQLKHLRYLAFRTDIGCRVILPSSPNQLYQMQLLDFGVC MNLVFSC⑶LINLRHVFSGPGLQFSNIGRLVSLQTIPALKVSHEQGHEAKQLRYLNRLSGELSIYGLRSVESREEAL AFDLAAKKRLTELTLSLGGSSKVAAEVLEGLCPPVGLVTLDIRDYDGLVYPKWMVGRQNGGPEKLQQLGLSGWSQPG PAPALKAFNHLRCLNLMHCSWNALPCNMEHLSSLETVIIIKCLNIRSLPTLPQSLTYFWLLKCDDGFMESCQTVGHP NWKKIQHICRKYFSEo
3.一種抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸序列為權(quán)利要求1所述的抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸序列的變體或片段。
4.權(quán)利要求1或3所述的抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸序列在植物抗性改良中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)自小麥近緣物種易變山羊草的抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸序列，以及基于該基因通過(guò)生物技術(shù)的方法在植物抗蟲改良方面的應(yīng)用。本發(fā)明公開的抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸序列為長(zhǎng)度是3586bp的抗禾谷孢囊線蟲基因完整編碼序列，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，可編碼934個(gè)氨基酸。本發(fā)明抗禾谷孢囊根線蟲基因核酸序列用于植物抗性改良中。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102234651SQ20101015399
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者余懋群, 徐德林, 潘志芬, 鄧光兵, 龍海 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所