本發(fā)明屬于分子標記領域，具體涉及一種蒙古扁桃特異性微衛(wèi)星位點及其應用。

背景技術：

蒙古扁桃(amygdalusmongolica)隸屬于薔薇科桃屬，,為國家三級瀕危保護植物，屬于蒙古高原的古老殘遺種。主要生長在荒漠及荒漠草原區(qū)的低山丘陵地、石質坡地及干河床等生境條件較為嚴酷的地區(qū)。隨著蒙古扁桃的生境島嶼化,分布區(qū)面積不斷縮小,導致其瀕臨滅絕的原因主要為人類采礦、燒柴、土地開發(fā)、工業(yè)化及城市化等活動對其生境的嚴重干擾和破壞，蒙古扁桃的分布范圍和種群數(shù)量都在減少。

微衛(wèi)星(microsatellite)也稱為ssr(simplesequencerepeats)，是由1～6個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列，廣泛分布于真核生物基因組中。由于其有數(shù)量多、特異的pcr擴增、穩(wěn)定性好、在基因組內分布均勻、多態(tài)性信息豐富、易于檢測等特性等諸多優(yōu)點成為近年來應用廣泛的分子標記之一。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種蒙古扁桃特異性微衛(wèi)星位點，包括tr10339、tr10936、tr12298、tr12728、tr16484、tr17663、tr17745、tr18640、tr18807、tr20374、tr21328、tr21918、tr23600、tr24122、tr3320、tr27527、tr29327、tr31156、tr31399、tr37605、tr37811、tr41171和tr47552核苷酸序列的一種或幾種，所述核苷酸序列如seqidno1～seqidno23所示序列。

本發(fā)明還提供了上述蒙古扁桃微衛(wèi)星位點的特異性引物對，所述蒙古扁桃特異性微衛(wèi)星位點的特異性引物對的核苷酸序列分別為：

tr10339的引物對序列如seqidno.24和seqidno.25所示；

tr10936的引物對序列如seqidno.26和seqidno.27所示；

tr12298的引物對序列如seqidno.28和seqidno.29所示；

tr12728的引物對序列如seqidno.30和seqidno.31所示；

tr16484的引物對序列如seqidno.32和seqidno.33所示；

tr17663的引物對序列如seqidno.34和seqidno.35所示；

tr17745的引物對序列如seqidno.36和seqidno.37所示；

tr18640的引物對序列如seqidno.38和seqidno.39所示；

tr18807的引物對序列如seqidno.40和seqidno.41所示；

tr20374的引物對序列如seqidno.42和seqidno.43所示；

tr21328的引物對序列如seqidno.44和seqidno.45所示；

tr21918的引物對序列如seqidno.46和seqidno.47所示；

tr23600的引物對序列如seqidno.48和seqidno.49所示；

tr24122的引物對序列如seqidno.50和seqidno.51所示；

tr3320的引物對序列如seqidno.52和seqidno.53所示；

tr27527的引物對序列如seqidno.54和seqidno.55所示；

tr29327的引物對序列如seqidno.56和seqidno.57所示；

tr31156的引物對序列如seqidno.58和seqidno.59所示；

tr31399的引物對序列如seqidno.60和seqidno.61所示；

tr37605的引物對序列如seqidno.62和seqidno.63所示；

tr37811的引物對序列如seqidno.64和seqidno.65所示；

tr41171的引物對序列如seqidno.66和seqidno.67所示；

tr47552的引物對序列如seqidno.68和seqidno.69所示。

本發(fā)明還提供了用于鑒定蒙古扁桃微衛(wèi)星位點的試劑盒，包括dna聚合酶、dntps、反應緩沖液、引物對與dna模板，其中，所述引物對為以下引物對的一種或幾種：

tr10339的引物對序列如seqidno.24和seqidno.25所示；

tr10936的引物對序列如seqidno.26和seqidno.27所示；

tr12298的引物對序列如seqidno.28和seqidno.29所示；

tr12728的引物對序列如seqidno.30和seqidno.31所示；

tr16484的引物對序列如seqidno.32和seqidno.33所示；

tr17663的引物對序列如seqidno.34和seqidno.35所示；

tr17745的引物對序列如seqidno.36和seqidno.37所示；

tr18640的引物對序列如seqidno.38和seqidno.39所示；

tr18807的引物對序列如seqidno.40和seqidno.41所示；

tr20374的引物對序列如seqidno.42和seqidno.43所示；

tr21328的引物對序列如seqidno.44和seqidno.45所示；

tr21918的引物對序列如seqidno.46和seqidno.47所示；

tr23600的引物對序列如seqidno.48和seqidno.49所示；

tr24122的引物對序列如seqidno.50和seqidno.51所示；

tr3320的引物對序列如seqidno.52和seqidno.53所示；

tr27527的引物對序列如seqidno.54和seqidno.55所示；

tr29327的引物對序列如seqidno.56和seqidno.57所示；

tr31156的引物對序列如seqidno.58和seqidno.59所示；

tr31399的引物對序列如seqidno.60和seqidno.61所示；

tr37605的引物對序列如seqidno.62和seqidno.63所示；

tr37811的引物對序列如seqidno.64和seqidno.65所示；

tr41171的引物對序列如seqidno.66和seqidno.67所示；

tr47552的引物對序列如seqidno.68和seqidno.69所示。

優(yōu)選地，本發(fā)明用于鑒定蒙古扁桃微衛(wèi)星位點的試劑盒，包括2×easytaqpcrsupermix、引物對、dna模板以及超純水；更優(yōu)選地，本發(fā)明用于鑒定蒙古扁桃微衛(wèi)星位點的試劑盒中，包括50-100ngdna模板,7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm引物對各0.5ul，使用超純水補齊至15ul；更優(yōu)選地，所述試劑盒的pcr條件為95℃預變性5min；95℃變性30sec，適宜退火溫度下退火30sec，72℃延伸30sec，反應32個循環(huán)；72℃延伸10min；其中，所述適宜的退火溫度為50℃～61℃；最優(yōu)選地，所述適宜的退火溫度為50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。

優(yōu)選的，所述蒙古扁桃的鑒定包括以下步驟：以前述試劑盒對待測樣品的基因組dna進行pcr擴增，將擴增產(chǎn)物與微衛(wèi)星序列進行對比：若含有上述技術方案所述的至少一種微衛(wèi)星分子標記，則判定所述待測樣品為蒙古扁桃；若不含有上述技術方案所述的任意一種微衛(wèi)星分子標記，則判定所述待測樣品不是蒙古扁桃。

本發(fā)明的再一方面為提供上述蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法，包括以下步驟：

1)收集蒙古扁桃樣品并提取dna；

2)對步驟1)獲得的dna，構建rna-seqcdna文庫，并對所述rna-seqcdna文庫進行高通量測序；

3)檢測微衛(wèi)星位點并設計微衛(wèi)星位點的引物對；

4)篩選并檢測微衛(wèi)星位點及其特異性引物對。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法中，所述步驟1)中提取dna步驟為ctab法；

優(yōu)選地，在本發(fā)明的蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法中，所述步驟2)中rna-seqcdna文庫的高通量測序使用luminahiseq3000測序平臺進行高通量測序；

優(yōu)選地，在本發(fā)明的蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法中，所述步驟3)中采用batchprimer3在線分析工具對所述步驟2)組裝完成的序列檢測微衛(wèi)星位點序列并在微衛(wèi)星位點的側翼序列上進行引物設計；更優(yōu)選地，所述微衛(wèi)星位點檢測的條件為重復單元為2個堿基時，重復次數(shù)需大于等于6；重復單元為3個堿基時，重復次數(shù)需大于等于5；重復單元為4、5和6個堿基時，重復次數(shù)需大于等于4；更優(yōu)選地，所述微衛(wèi)星位點的特異性引物設計的原則為擴增目的片段為100～200bp，引物gc含量為40～60％，上下游引物退火溫度(tm)在50～60℃之間且差異小于5℃。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法中，所述步驟4)中篩選所述微衛(wèi)星特異性引物的方法為：使用蒙古扁桃dna對步驟3)獲得的特異性引物對進行pcr擴增并檢測，篩選能夠穩(wěn)定擴增出目標條帶并具有多態(tài)性的引物對；

優(yōu)選地，在本發(fā)明的蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法中，所述步驟4)中檢測所述微衛(wèi)星特異性引物方法為：使用tamara350熒光分子量標準在abi3730dna測序儀中使用聚丙烯酰胺凝膠對篩選出來的引物對進行基因分型；基因分型的結果使用genmarker軟件進行讀取，并輸入excel文件；使用excelmircosatellitetoolkit程序統(tǒng)計各微衛(wèi)星位點的期望雜合度(expectedheterozygosity,he)、觀測雜合度(observedheterozygosity，ho)和多態(tài)性信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)，以檢測所述微衛(wèi)星位點的多態(tài)性狀況，篩選出上述三個多態(tài)性數(shù)值均大于0.5作為微衛(wèi)星位點的特異引物對。

因此，本發(fā)明提供了蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點及其特異性引物在藜科駝絨藜屬植株的基因標記、定位與qtl分析、品種鑒定、種群及進化研究、分子標記輔助育種中的應用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明首次公開了蒙古扁桃的23條特異性微衛(wèi)星序列及23對特異性微衛(wèi)星引物。這些位點在對蒙古扁桃的遺傳多樣性分析、保護遺傳學研究、種質資源調查和輔助育種中起到重要作用，也為研究植物抗旱機制的研究提供基礎材料。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明中的實施例，對本發(fā)明中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

1、dna抽提

采集32個蒙古扁桃樣品，采集自內蒙古阿拉善左旗。采下后立即使用硅膠保存，采用ctab法進行蒙古扁桃基因組dna抽提。

2、建庫、高通量測序及組裝

使用illuminatruseqstrandedtotalrnasampleprepkit(晶能生物技術(上海)有限公司)構建蒙古扁桃的標準rna-seqcdna文庫；采用illuminahiseq3000測序平臺的雙端測序模式對構建的rna-seqcdna文庫進行高通量測序。對經(jīng)過質量控制分析后的高質量序列進行樣本組裝。

序列經(jīng)組裝后共得到103923個轉錄本異構體，并定義為73225個原始序列unigene。

3、微衛(wèi)星序列檢測和引物設計

采用batchprimer3在線分析工具對所述步驟2組裝完成的序列檢測微衛(wèi)星位點序列并在微衛(wèi)星位點的側翼序列上進行引物設計；所述微衛(wèi)星位點檢測的條件為重復單元為2個堿基時，重復次數(shù)需大于等于6；重復單元為3個堿基時，重復次數(shù)需大于等于5；重復單元為4、5和6個堿基時，重復次數(shù)需大于等于4；所述微衛(wèi)星位點的引物設計的原則為擴增目的片段為100～200bp，引物gc含量為40～60％，上下游引物退火溫度(tm)在50～60℃之間且差異小于5℃。

在此條件下，共檢測到19498個微衛(wèi)星序列，設計到14586對引物對。

4、微衛(wèi)星引物的初步篩選

在14586對設計成功的引物對中選擇50個引物對進行pcr擴增條件確定。選擇的原則是：優(yōu)選重復堿基單元為2或者3(這類微衛(wèi)星多態(tài)性較高)；優(yōu)選重復序列無堿基變異、無插入或者缺失的；優(yōu)選重復單元數(shù)目大的(但不超過50個)。

使用8個蒙古扁桃樣品的dna為模板，對這50個引物對進行梯度pcr擴增。梯度pcr反應體系如下：50-100ngdna模板,7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm上下游引物各0.5ul，使用超純水補齊至15ul。梯度pcr反應循環(huán)設置如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，45～65℃范圍內12個梯度溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明所述12個梯度優(yōu)選為50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。

梯度pcr得到的擴增產(chǎn)物使用2％的瓊脂糖-eb凝膠電泳檢測，選取符合以下條件的引物對作為初步篩選引物對：(1)擴增產(chǎn)物為單一條帶；(2)片段大小符合目的片段大??；(3)在8個個體中均擴增得到一致結果。記錄符合上述條件時的pcr退火溫度，記為該引物對的最適退火溫度。

在此條件下，共得到25個初篩引物對。

4、微衛(wèi)星位點的多態(tài)性檢測

對上述初篩引物對的上游引物5’端加上熒光標記(fam/hex/tamra)，并使用32個蒙古扁桃樣品的dna進行擴增。pcr反應體系為：50-100ngdna模板，7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm上下游引物各0.5ul，使用超純水補齊至15ul。循環(huán)設置為：95℃預變性5min；95℃變性30sec，最適退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應35個循環(huán)；72℃延伸10min。

擴增產(chǎn)物使用tamara350熒光分子量標準在abi3730dna測序儀中使用聚丙烯酰胺凝膠進行基因分型。基因分析的結果使用genmarke軟件進行讀取，并輸入excel文件。使用excelmircosatellitetoolkit程序計算期望雜合度(expectedheterozygosity，he)、觀測雜合度(observedheterozygosity，ho)和多態(tài)性信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)，以檢測所述微衛(wèi)星位點的多態(tài)性狀況，選擇上述三個多態(tài)性數(shù)值均大于0.5的位點。

最終獲得23個穩(wěn)定的高多態(tài)性微衛(wèi)星位點，所述微衛(wèi)星位點命名為tr10339、tr10936、tr12298、tr12728、tr16484、tr17663、tr17745、tr18640、tr18807、tr20374、tr21328、tr21918、tr23600、tr24122、tr3320、tr27527、tr29327、tr31156、tr31399、tr37605、tr37811、tr41171和tr47552；所述tr10339、tr10936、tr12298、tr12728、tr16484、tr17663、tr17745、tr18640、tr18807、tr20374、tr21328、tr21918、tr23600、tr24122、tr3320、tr27527、tr29327、tr31156、tr31399、tr37605、tr37811、tr41171和tr47552的核苷酸序列分別如seqidno1～seqidno23所示序列。

所述微衛(wèi)星位點tr10339、tr10936、tr12298、tr12728、tr16484、tr17663、tr17745、tr18640、tr18807、tr20374、tr21328、tr21918、tr23600、tr24122、tr3320、tr27527、tr29327、tr31156、tr31399、tr37605、tr37811、tr41171和tr47552的特異性引物對依次為：

tr10339的引物對序列如seqidno.24和seqidno.25所示；

tr10936的引物對序列如seqidno.26和seqidno.27所示；

tr12298的引物對序列如seqidno.28和seqidno.29所示；

tr12728的引物對序列如seqidno.30和seqidno.31所示；

tr16484的引物對序列如seqidno.32和seqidno.33所示；

tr17663的引物對序列如seqidno.34和seqidno.35所示；

tr17745的引物對序列如seqidno.36和seqidno.37所示；

tr18640的引物對序列如seqidno.38和seqidno.39所示；

tr18807的引物對序列如seqidno.40和seqidno.41所示；

tr20374的引物對序列如seqidno.42和seqidno.43所示；

tr21328的引物對序列如seqidno.44和seqidno.45所示；

tr21918的引物對序列如seqidno.46和seqidno.47所示；

tr23600的引物對序列如seqidno.48和seqidno.49所示；

tr24122的引物對序列如seqidno.50和seqidno.51所示；

tr3320的引物對序列如seqidno.52和seqidno.53所示；

tr27527的引物對序列如seqidno.54和seqidno.55所示；

tr29327的引物對序列如seqidno.56和seqidno.57所示；

tr31156的引物對序列如seqidno.58和seqidno.59所示；

tr31399的引物對序列如seqidno.60和seqidno.61所示；

tr37605的引物對序列如seqidno.62和seqidno.63所示；

tr37811的引物對序列如seqidno.64和seqidno.65所示；

tr41171的引物對序列如seqidno.66和seqidno.67所示；

tr47552的引物對序列如seqidno.68和seqidno.69所示。

所述微衛(wèi)星位點tr10339、tr10936、tr12298、tr12728、tr16484、tr17663、tr17745、tr18640、tr18807、tr20374、tr21328、tr21918、tr23600、tr24122、tr3320、tr27527、tr29327、tr31156、tr31399、tr37605、tr37811、tr41171和tr47552微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性數(shù)據(jù)見表1。

表1：微衛(wèi)星位點遺傳多樣性檢測結果

由表1數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明提供的用于鑒定的微衛(wèi)星位點的分子標記多態(tài)性數(shù)據(jù)均大于0.5，均可以用于遺傳多樣性調查、種群遺傳結構分析、個體識別以及親緣關系鑒定等遺傳學分析。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

序列表

<110>內蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院

<120>一種蒙古扁桃特異性微衛(wèi)星位點及其應用

<160>69

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>314

<212>dna

<213>蒙古扁桃

<400>1

tcaatttcttcttgttacaggtaggtaggggctgctcaccttctttttgtcaggattctc60

ttgccagtctctaaagtataacaaaaggtgttgcaagcaaacaataaaaacacccccata120

taaccactagaatagaagcaactcaatcagatctttctccatctttttaactcttctctc180

cattgagtcccatagtcataccaaccaattaattaacctctgtagacttccactcctttg240

ctctctctctctctctctctctctctctctctctctctcttcctaaatttcccagatgag300

gacaattatggccg314

<210>2

<211>321

<212>dna

<213>蒙古扁桃

<400>2

aaagtagaaacgaaggaaaagaaagaaaatgcaaatagaagagagaagcaaactgcgaag60

gcaaacctctgaaaaaccctaaaaccggcgaatgaaaacatcattcacgaagaagaagaa120

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agagggagggggggggggggg321

<210>3

<211>399

<212>dna

<213>蒙古扁桃

<400>3

tttggtcgtcctatgatgtttgagttattgctggtgtatctcattggctcattggctcac60

cttagaatttgcgaacgtttaaatgcatttctgtccattttcttgttcaacatattaatc120

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ggcaaatcgtaccagaggctaccgcgggtcaaaatccgtgaaatgcgcgacgactacatg360

aagttcgagctccgcgacaccgacgccagcgtcgccaac399

<210>4

<211>385

<212>dna

<213>蒙古扁桃

<400>4

ggatgctattgaaatctaagcccacgtacatcatgagagagagagagagagagagagaga60

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gtccttgtattagtgaatatacaagaaaaatctgattatgagttaccagggtgttacagc180

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ctggtttttgccactggagtttatcctgatgcctgaaaatgttggactgcaaattaagcc300

atatgaagaaacagaaaattgatttgagcaatgggactatagatctctcctcatttgcac360

tggcgctacaatagactcaacaatt385

<210>5

<211>564

<212>dna

<213>蒙古扁桃

<400>5

gacggcaagtcttgaggctcaagcatatgcaaaccgggaatactagtaacatcaccacca60

tgatacttcatatagtaaatataattgaccgtgcaggtttgagtaaaaaaggcagcggac120

gctagaccaaactgtttggctacatccagagcccagggcaaaaatggatcatatattatg180

caattaatagggtggggtgagttgctgtactttgtaatgagctcgattagggttctggag240

ccctcggcttccatccggtctagataagcatcgatgctttcagctcgggcaaagccttcc300

tcatcgtagccatcggatatggtgtcgaattggacggaaccgcttgatttgagcggcaat360

gacttgctgatgaagatggtgttggctagagtgactttgaggcccttagaggctaagcgc420

ttggagaactggagcaaggggtttatgtgaccttgagcaggataaggaattgccaagacg480

tggcttctatccatttgagatctctctctctctctctctctctctctctctctcaaaaac540

ttaggtgtggcggtgctgtgcaga564

<210>6

<211>455

<212>dna

<213>蒙古扁桃

<400>6

atcacttccaatatttcaaaatcatctcctctacctttttccttcatccctctctctctc60

tctctctctctctctctctctctctctgtgtctctggggtatgcatatttacaataggaa120

taacatttacatataaaagcgtcaaacgcaccgtatcaagcagagatcatgaccatggac180

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<213>蒙古扁桃

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<213>蒙古扁桃

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<212>dna

<213>蒙古扁桃

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<213>蒙古扁桃

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<213>蒙古扁桃

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<213>蒙古扁桃

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tcttttcttcttccttccctccttctgtctctctcttcacgccactacagattcaaccat60

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<213>蒙古扁桃

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<210>14

<211>534

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<213>蒙古扁桃

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<213>蒙古扁桃

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ctcgcctcctctctctctctatctctctctctctctctctctctctctctctctctctcc60

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<213>蒙古扁桃

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ccctaccttctattcccaatctctctctctcttaatatttccctcaccatccaccaaacc60

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<213>蒙古扁桃

<400>17

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<213>蒙古扁桃

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<210>19

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<212>dna

<213>蒙古扁桃

<400>19

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<212>dna

<213>蒙古扁桃

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<213>蒙古扁桃

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<213>蒙古扁桃

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<213>蒙古扁桃

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