本發(fā)明屬于家禽的分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與鵪鶉產(chǎn)蛋性能相關(guān)的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用。該遺傳標(biāo)記克隆自eed基因的一個片段，可應(yīng)用于鵪鶉標(biāo)記輔助選擇育種。

背景技術(shù)：

鵪鶉是一種特種經(jīng)濟禽類，具有極高的食用價值和食療功效。隨著人們生活水平的提高，對鵪鶉蛋的需求量越來越大。目前飼養(yǎng)的蛋用鵪鶉品種多表現(xiàn)為產(chǎn)蛋性能較低、蛋重大小不均勻等缺點，培育高產(chǎn)性能的鵪鶉品種成為目前鵪鶉育種與養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究重點之一。通過表型選擇等常規(guī)育種方法進行產(chǎn)蛋性能的遺傳改良，所需時間長、成本高；隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助選擇并結(jié)合傳統(tǒng)育種方法已經(jīng)成為目前加快畜禽品種選育的主要方法之一。因此，篩選與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀基因座相連鎖的分子遺傳標(biāo)記，應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇培育蛋用鵪鶉新品種，是目前及今后一段時間鵪鶉分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究重點之一。

胚胎外胚層發(fā)育基因(embryonicectodermdevelopment,eed)是pcg蛋白家族的成員之一。pcg蛋白家族是一類重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子，與細(xì)胞增殖相關(guān)的調(diào)控基因啟動子區(qū)結(jié)合(piuntietal,2011)，可偶聯(lián)dna特異序列結(jié)合因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子等，動態(tài)調(diào)控細(xì)胞周期、靶基因表達、衰老等(laietal，2013)。作為pcg蛋白家族的成員，eed基因在細(xì)胞增殖、性成熟啟動中發(fā)揮著重要的作用，但目前關(guān)于eed基因在畜禽上的研究還較少，僅見少量研究結(jié)果表明，eed基因在哺乳動物的器官發(fā)生中發(fā)揮作用(morin-kensickietal，2001)，初步表明eed轉(zhuǎn)錄抑制因子與雞性成熟啟動相關(guān)(盛中偉等，2016)。然而關(guān)于eed基因進一步的功能及其在其他家禽中的研究還未見報道。

綜合所述，eed基因與家禽性成熟啟動密切相關(guān)，研究性成熟啟動的調(diào)節(jié)機制對于家禽高產(chǎn)品種的育種具有重要意義。通過研究基因突變位點在群體中的多態(tài)性，并進行性狀的關(guān)聯(lián)分析是發(fā)掘與特定性狀相關(guān)的分子標(biāo)記、研究基因功能的重要手段之一。鑒于此，申請人克隆了鵪鶉eed基因外顯子8-9部分序列，并進行了該序列的多態(tài)性及其與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)分析研究，為鵪鶉的遺傳改良提供了重要的理論支持。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于獲得與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記及在鵪鶉上的應(yīng)用。從鵪鶉eed基因克隆得到一個特異的dna片段(外顯子8-9部分片段)，分析該片段與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性，本發(fā)明為鵪鶉的標(biāo)記輔助選擇育種提供一種新的遺傳標(biāo)記。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明人通過大量試驗研究和不懈探索，最終獲得了如下技術(shù)方案：

一種與與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的snp遺傳標(biāo)記，通過對鵪鶉eed基因外顯子8-9區(qū)域的分離克隆，發(fā)現(xiàn)了一種與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記，該標(biāo)記的核苷酸序列如seqidno:1所示，序列長度為605bp，其中在該序列所示的“r”(即第187bp處的堿基突變)是a或g(即存在一個a/g替換)、“y”(即第208bp處的堿基突變)是t或c，(即存在一個t/c替換)，采用直接測序的方法進行上述位點的檢測。

申請人設(shè)計了一種擴增鵪鶉eed基因和檢測該基因片段突變的引物對，該引物對的dna序列如下所示：

正向引物：5’-ttgggtgacctaattctt-3’，與seqidno:2所示的序列對應(yīng)。

反向引物：5’-tttgactcacttggcttg-3’，與seqidno:3所示的序列對應(yīng)。

本發(fā)明建立了一種與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記的制備方法，按照以下步驟進行制備：

從鵪鶉血液中提取dna，根據(jù)鵪鶉eed基因序列設(shè)計引物，該引物對的dna序列如序列表seqidno:2和seqidno:3所示，用序列表seqidno:2和seqidno:3所示的引物在鵪鶉基因組dna中進行pcr擴增，pcr產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆測序后，獲得如序列表seqidno:1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的遺傳標(biāo)記可用于鵪鶉產(chǎn)蛋性狀檢測中，其中所設(shè)計的引物對也可應(yīng)用于鵪鶉產(chǎn)蛋性狀的檢測中。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和顯著的進步：(1)利用本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記，在蛋用鵪鶉育種群體中增加at/gc單倍型個體的選擇，可以使鵪鶉的開產(chǎn)適當(dāng)提前，增加at/ac單倍型個體的選擇會提高選育群體的產(chǎn)蛋量，同時選擇這兩種單倍型的個體，可以提前選育群體的開產(chǎn)日齡同時提高產(chǎn)蛋量；(2)實現(xiàn)了對鵪鶉產(chǎn)蛋性狀進行早期選擇，檢測方法快速、準(zhǔn)確，且不受養(yǎng)殖環(huán)境條件因素影響，并可縮短育種周期、降低育種成本。

附圖說明

圖1：本發(fā)明pcr擴增獲得的eed基因部分序列的瓊脂糖凝膠電泳圖，瓊脂糖濃度為2％，圖中標(biāo)記說明：1-6為泳道編號，m是ds^tm2000marker。

圖2：本發(fā)明中鵪鶉eed基因外顯子8-9區(qū)域部分序列直接測序檢測到的突變位點測序峰圖比較結(jié)果，其中(a)為187bp突變位點測序峰圖比較結(jié)果，(b)為208bp突變位點的測序峰圖比較結(jié)果。

具體實施方式

以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步作描述，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

實施例1eed基因部分基因組序列的獲得及多態(tài)性檢測方法的建立

1、引物設(shè)計

根據(jù)鵪鶉eed基因序列(genbankaccessionno.nc_029516)，設(shè)計該基因外顯子8-9的引物序列如下：

正向引物f：5’-ttgggtgacctaattctt-3’

反向引物r：5’-tttgactcacttggcttg-3’

以蛋用鵪鶉為試驗群體，提取鵪鶉的血液基因組dna，并以此dna為模板擴增鵪鶉eed基因部分序列片段。

2、pcr擴增條件

利用上述引物在鵪鶉基因組dna中進行pcr擴增，pcr反應(yīng)總體積15μl，體系中各組分的濃度為：鵪鶉基因組dna約100ng，1×taqbuffer，1.5mmol/lmgcl2，dntp2.5mmol/l，引物終濃度為0.2μmol/l，2utaqdna聚合酶。pcr擴增程序是:預(yù)變性95℃5min，然后再循環(huán)34次94℃30s，53℃35s，72℃45s，最后72℃延伸10min。pcr反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，結(jié)果如圖1，1-6泳道分別為eed基因外顯子8-9區(qū)域部分個體的擴增結(jié)果，m為markerds^tm2000，擴增的結(jié)果均可用于進一步的分析中。

3、pcr產(chǎn)物的純化

上述pcr產(chǎn)物用北京天根生化技術(shù)有限公司生產(chǎn)的凝膠回收純化試劑盒進行切膠純化，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下：

(1)在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml離心管中，稱重；

(2)向膠塊中加入等倍體積的溶液pn，50℃水浴放置10分鐘至膠完全溶解，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解；

(3)將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，室溫放置2min，12,000rpm離心30-60秒，棄廢液，吸附柱放回收集管；

(4)向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心30-60秒，棄廢液。

(5)重復(fù)步驟4；

(6)將吸附柱放回收集管中，12,000rpm離心2分鐘。室溫放置數(shù)分鐘徹底晾干吸附柱。

(7)將吸附柱放入一干凈的離心管中，向吸附柱膜中間加入洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘后，12,000rpm離心1分鐘收集純化產(chǎn)物。

4、利用pcr產(chǎn)物直接測序法檢測分子標(biāo)記

將上述獲得的pcr純化產(chǎn)物直接送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序，直接從測序色譜圖(圖2)上進行基因型分析。

實施例2本發(fā)明制備的遺傳標(biāo)記在鵪鶉群體中的分布情況

申請人在黃羽系和栗羽系2個蛋用鵪鶉群體中檢測了鵪鶉eed基因外顯子8-9區(qū)兩個等位基因的分布頻率，檢測結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明：在第187bp處的g/a多態(tài)性分布，在黃羽系群體中a等位基因占主要優(yōu)勢，而在栗羽系群體中g(shù)等位基因占主要優(yōu)勢，且雜合型個體所占比最大，但兩個群體中等位基因頻率分布差異不顯著；在第208bp處的t/c多態(tài)性分布，在黃羽和栗羽兩個群體中均表現(xiàn)為t等位基因占主要優(yōu)勢，且兩個群體中均為tt基因型所占比例最大。

表1eed基因外顯子8-9區(qū)多態(tài)在不同鵪鶉群體中的分布

實施例3本發(fā)明制備的遺傳標(biāo)記與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀關(guān)聯(lián)分析及應(yīng)用

1、單倍型的構(gòu)建

將上述利用pcr-直接測序法得到的所有個體的兩個多態(tài)位點的基因型數(shù)據(jù)輸入haploview軟件，計算得到每個個體的單倍型，同時計算位點之間的成對連鎖不平衡程度，用標(biāo)準(zhǔn)化的連鎖不平衡系數(shù)d’表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個位點之間的連鎖不平衡系數(shù)d’等于1，即為完全連鎖不平衡。共有4種單體型ac、at、gc和gt，其所占等位基因的頻率分別為22.73％、27.27％、12.5％和37.5％，構(gòu)成5種單體型組合ac/ac、at/ac、at/gc、at/gt、gt/gt。

2、單體型組合與蛋用鵪鶉產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)分析

申請人在蛋用鵪鶉群體(來自湖北神丹健康食品有限公司)528個具有完整生產(chǎn)數(shù)據(jù)的個體中分析本發(fā)明制備的遺傳標(biāo)記與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)關(guān)系。所分析的產(chǎn)蛋性狀主要包括開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重、蛋重、蛋品質(zhì)、20周齡體重及20周齡產(chǎn)蛋數(shù)等。采用實施例1所建立的pcr-直接測序方法進行個體的基因分型，采用spss統(tǒng)計軟件(statisticalpackageforthesocialsciences,version18.0)一般線性模型進行統(tǒng)計分析，其中除了隨機效應(yīng)以外，其他因素均為固定效應(yīng)。

關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果見表2。由表中可以看出，單倍型不同時，開產(chǎn)日齡、蛋重和20周產(chǎn)蛋數(shù)等性狀存在顯著差異(p<0.05)；其中，單倍型為at/gc的個體開產(chǎn)日齡和蛋重顯著高于其他4種單倍型(p<0.05)，單倍型為at/ac的個體20周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于其他4種單倍型(p<0.05)。由此可以看出，at/gc單倍型個體開產(chǎn)更早、蛋重較大，而at/ac單倍型個體20周齡產(chǎn)蛋數(shù)最多，在育種實踐中，可以根據(jù)不同的育種目標(biāo)選擇不同的單倍型個體進行育種。

表2eed基因內(nèi)外顯子8-9區(qū)多態(tài)與產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)分析

注：標(biāo)有不同上標(biāo)字母a、b、c表示差異顯著(p<0.05)；n表示個體數(shù)。

seqidno:1

<110>湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的snp遺傳標(biāo)記及應(yīng)用

<160>3

<210>1

<211>605

<212>dna

<400>1

ttgggtgacctaattctttccaaggtaaagtgcaagctttttcagctaccttgcttttat60

ttgcttttttaggctcttaaacagtagtagtttcactagaatacgaattgtaggttaact120

tattatgctgcatgaaatgattttatgttaaagattttggtgtctgtttgcatgtgtaga180

taagcarcttttacatcaaaagtaaaaygagttcagtggtcagaactgtgctagaagtag240

caacatgtcaactacccgtgttctgcatgaggagtacagaaagagaatgaatatatagtt300

actcatgtagggtcctgcagctgaaaggagaaatgaggattcatgcaatggagttccttg360

gatttgtgtgataacactagcactgcttgctcggagacattaaactacatggtggcattg420

catctttggcagaaattggtgcatgtgtgttctcctaaaactgaatgttgtacgcttttt480

gttgttgttcattgtttttttttggtttttttttttcctccctagtcttgtgaaaatgcc540

attgtgtgctggaaacctggcaaaatggaagatgatatagataaaatcaagccaagtgag600

tcaaa605

seqidno:2

<210>2

<211>18

<212>dna

<400>2

ttgggtgacctaattctt18

seqidno:3

<210>3

<211>18

<212>dna

<400>3

tttgactcacttggcttg18