專利名稱：用甲醇酵母(Pichia pastoris)生產(chǎn)人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程藥物領(lǐng)域，具體地說，涉及利用工程菌甲醇酵母(Pichia pastoris)生產(chǎn)制備人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF，以及在制備治療維持和促進(jìn)外周神經(jīng)嵴和基板來源的多種感覺神經(jīng)元的發(fā)育、生長(zhǎng)和分化，神經(jīng)中樞基底前腦、膽堿能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元、中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和一些如早老性癡呆、帕金森病、外周神經(jīng)損傷等神經(jīng)性疾病藥物中的應(yīng)用。
近年來國(guó)內(nèi)也有一些實(shí)驗(yàn)室從事BDNF表達(dá)的研究。陳燕、何曉龍等以PET為載體在大腸桿菌中表達(dá)了包涵體形式的BDNF；陳謙等在COS7細(xì)胞中表達(dá)了生物活性的BDNF，但表達(dá)量極低，培養(yǎng)上清濃縮后，蛋白電泳經(jīng)銀染才看得見帶型；李金照等在雛雞的肌肉中表達(dá)BDNF，產(chǎn)物可促進(jìn)損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活和再生，表明有生物活性；劉健等在成肌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)了BDNF，產(chǎn)物也具生物活性，但表達(dá)量低，約為25ng(106細(xì)胞數(shù)每ml每24h)。
從目前已有技術(shù)而言，雖然動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)得到的BDNF蛋白活性較高。但動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件要求高，成本高，表達(dá)量低，當(dāng)前還主要處在實(shí)驗(yàn)室摸索階段；大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)本身較成熟，易培養(yǎng)，對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)更有利，但是仍然存在嚴(yán)重的缺陷，必須解決復(fù)性問題，而且產(chǎn)率也不高。
作為真核表達(dá)系統(tǒng)，甲醇酵母具有許多其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。可概括如下(1)具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶基因(AOX1)啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；(2)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工和修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性；(3)營(yíng)養(yǎng)要求低，生長(zhǎng)快，培養(yǎng)基廉價(jià)，便于工業(yè)化生產(chǎn)；(4)可高密度發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中細(xì)胞干重甚至可達(dá)130g/L以上；(5)表達(dá)量高，許多蛋白可達(dá)到每升克以上水平，如破傷風(fēng)毒素C片段表達(dá)量高達(dá)12g/L；(6)在Pichia Pastoris中表達(dá)的蛋白既可存在于胞內(nèi)，又可分泌至胞外。Pichia自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于純化。如表達(dá)的重組水蛭素(HIR)，僅經(jīng)過二步層析純化，純度就高達(dá)97％以上；(7)糖基化程度低。和釀酒酵母相比，甲醇酵母中加到翻譯蛋白上的糖鏈長(zhǎng)度平均每條側(cè)鏈為8-14個(gè)甘露糖殘基，較之釀酒酵母每條側(cè)鏈平均50-150甘露糖殘基短得多。
甲醇酵母系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種蛋白表達(dá)宿主。它兼顧了動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)而克服了彼此的不足(動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成本高、表達(dá)量低、培養(yǎng)條件高，難于工業(yè)化生產(chǎn)；大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)率也不高，純化繁瑣，需要復(fù)雜的變性和復(fù)性才能恢復(fù)生物活性)。本發(fā)明在克隆BDNF基因的基礎(chǔ)上，在甲酵酵母系統(tǒng)中嘗試著表達(dá)了這種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
目前，國(guó)內(nèi)外還未見有BDNF和用作醫(yī)藥產(chǎn)品出售，美國(guó)Promega公司有分子生物學(xué)試劑級(jí)產(chǎn)品，BDNF為$240/5ug包裝($4.8萬/mg)，抗體為$255/200ug包裝。因?yàn)橛么竽c桿菌表達(dá)BDNF表達(dá)量低，純化繁瑣，需要復(fù)雜的變性、復(fù)性才能恢復(fù)生物活性，并且復(fù)性率也不高(成熟BDNF含三對(duì)二硫鍵，容易形成不正確的二硫鍵連接)。這些問題造成成本過高，價(jià)格如此昂貴也就不足為奇了。
發(fā)明人克隆BDNF基因于質(zhì)粒pUC，序列測(cè)定后，構(gòu)建了甲醇酵母Pichia Pastoris重組胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5K-BDNF。原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化，G418、點(diǎn)雜交篩選。選出的高拷貝轉(zhuǎn)化子經(jīng)誘導(dǎo)后，在甲醇酵母中表達(dá)了BDNF。該工程菌已交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No 0550。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法包括以下步驟1.腦基因組DNA的提取和純化；2.BDNF基因的擴(kuò)增，克隆和測(cè)序；3.甲醇酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建；4.重組表達(dá)載體pPIC3.5K-BDNF用SacI酶切線性化，原生質(zhì)球方法轉(zhuǎn)化甲醇酵母，G418篩選。得到的高抗性轉(zhuǎn)化子抽提其DNA，用特異引物PCR擴(kuò)增，以確證BDNF基因的整合；5 BDNF在甲醇酵母中的胞內(nèi)表達(dá)；6 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鹽沉淀，離子交換柱純化，純度達(dá)95％以上；7 BDNF表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性測(cè)定。
到目前為止，國(guó)內(nèi)外用甲醇酵母生產(chǎn)BDNF未見任何報(bào)道。本發(fā)明BDNF在甲醇酵母中的表達(dá)，無論表達(dá)生物量以及提取制備步驟都優(yōu)于其它表達(dá)體系，所以為BDNF藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用成為現(xiàn)實(shí)。
以下的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
將模板DNA于100℃處理2分鐘，迅速放入冰中，按kit說明加入各反應(yīng)液；輕輕混合反應(yīng)物，室溫反應(yīng)60分鐘后，100℃變性2分鐘，迅速放入冰中冷卻，備雜交用。d.放射性標(biāo)記的探針與固定在硝酸纖維素濾膜上的核酸進(jìn)行雜交將含有靶DNA的硝酸纖維素濾膜飄浮在一盤6×SSC的液面上，待其由下至上完全浸濕，將濾膜浸入液體內(nèi)泡2分鐘。
將濕潤(rùn)濾膜裝入雜交袋中，按每平方厘米膜面積加入0.2ml預(yù)雜交液，放入42℃水浴中溫育2小時(shí)，間或溫和地?fù)u動(dòng)。預(yù)雜交液6×SSC5×Denhardt試劑0.5％SDS100μg/ml經(jīng)變性并斷裂成片段的鮭精DNA50％甲酰胺取出雜交袋，剪去袋的一角，向預(yù)雜交液中加入經(jīng)變性的探針，重新封口，再封于另一個(gè)未污染的袋內(nèi)，放入42℃水浴中溫育20小時(shí)，間或溫和地?fù)u動(dòng)。e. 從水浴中取出雜交袋，并迅速剪開雜交袋，取出濾膜，放入400ml 2×SSC和0.5％SDS中，室溫浸泡5分鐘。
將濾膜轉(zhuǎn)移到400mL 0.1×SSC和0.1％SDS中，37℃溫育1小時(shí)。
再將濾膜轉(zhuǎn)移到400mL 0.1×SSC和0.1％SDS中，68℃溫育。用小型檢測(cè)器檢測(cè)膜上的放射性活度，直到陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)分別為陰性、陽(yáng)性時(shí)，終止洗滌。f)將硝酸纖維素膜置于濾紙上，除去大部分液體，做好標(biāo)記，置暗盒壓上X光片，于-70曝光℃48小時(shí)后顯影和定影。(4)BDNF的誘導(dǎo)表達(dá)。高拷貝轉(zhuǎn)化子接種于BMGY培養(yǎng)基，30℃搖瓶培養(yǎng)約24h后，離心，棄上清，用BMMY培養(yǎng)基懸浮酵母菌體，搖床培養(yǎng)，每隔24h加一次甲醇，并且每隔24h取2ml發(fā)酵液，離心去上清，得菌體。用酸洗的玻璃珠破細(xì)胞。0.1％SDS-15％PAGE和Western Blotting分析上清(見圖3，4)。(5)表達(dá)產(chǎn)物的內(nèi)切糖苷酶分析。破細(xì)胞后的上清用終濃度為10％的三氯乙酸沉淀濃縮后，溶解。比色法測(cè)蛋白濃度。取約20ug的蛋白溶液，加入變性緩沖液(0.5％SDS，10％巰基乙醇)，100℃變性10分鐘。然后加入0.05M的醋酸鈉溶液(PH5.5)和3ul的內(nèi)切糖苷酶H，37℃保溫三小時(shí)。0.1％SDS-15％PAGE和Western Blotting分析結(jié)果(見圖5，6)。(6)表達(dá)產(chǎn)物的純化。發(fā)酵培養(yǎng)液離心去除菌體，上清加硫酸銨至80％飽和度，4℃下沉淀6小時(shí)。離心得沉淀。沉淀溶解后，對(duì)25mM硼酸鈉，pH9.0溶液長(zhǎng)時(shí)間透析。透析好的樣品上DEAE-Sephadex陰離子交換柱(2.5×12cm，已用25mM，pH9.0硼酸鈉溶液平衡)。用0.1-1.0M NaCl(溶于平衡緩沖液中)梯度分部洗脫。合并有ELISA反應(yīng)的分管，濃縮后對(duì)25mM磷酸緩沖液(PBS)、pH7.0溶液透析。透析好的樣品上S-sepharose柱(2.5×20cm，預(yù)先用25mM PBS，pH7.0溶液平衡)，用0.1-0.5MNaCl溶液洗脫。收集有ELISA反應(yīng)的部分，電泳分析。(7)表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性測(cè)定。樣品分三種，即陽(yáng)性對(duì)照NGF、胞內(nèi)表達(dá)的55kD hBDNF、胞內(nèi)表達(dá)55kD蛋白經(jīng)內(nèi)切糖苷酶消化后的14kD hBDNF。三者均經(jīng)離子交換純化，純度達(dá)95％以上。培養(yǎng)細(xì)胞傳3-4代后，調(diào)整細(xì)胞懸液至濃度為0.8×105-1×105個(gè)/mL，加入24孔培養(yǎng)板，每孔1mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天。待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，加入1mL新鮮培養(yǎng)基，并加入不同量的四種樣品(1至100ng范圍之內(nèi))，以不加樣品的培養(yǎng)孔為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天。相差倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)(見圖7-13)。結(jié)果重復(fù)三次，計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值。
下面結(jié)合附圖
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述
權(quán)利要求
1，一種用甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌生產(chǎn)人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF的方法，其特征包括以下步驟人腦基因組DNA的提取和純化；BDNF基因的擴(kuò)增，克隆和測(cè)定；BDNF重組胞內(nèi)表達(dá)載體的構(gòu)建；含有BDNF重組表達(dá)載體的甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌的構(gòu)建；和BDNF在甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的人腦基因組DNA的提取和純化方法，是以胎兒腦組織為原料提取和純化腦組織總的DNA。
3，根據(jù)權(quán)利要求1所述的BDNF基因的擴(kuò)增，克隆和測(cè)定的方法，是用如下所示的引物I和引物II，以純化的腦組織總DNA為模板，擴(kuò)增BDNF基因。引物I5′-ACT ATG CAC TCT GAC CCT GCC AGA AGA G-3′；引物II5′-CAC TTA TCT TCC CCT TTT AAT G-3′。
4，根據(jù)權(quán)利要求1所述的BDNF基因的測(cè)定的方法，BDNF基因由357個(gè)核苷酸組成，其序列如下所示CACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGGCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGA
5，一種BDNF重組載體的構(gòu)建，是根據(jù)權(quán)利要求4的BDNF基因與載體pUC連接，重組載體為pUC-BDNF。
6，根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體的構(gòu)建，是利用pUC-BDNF重組載體與表達(dá)載體pPIC3.5K酶切，連接，轉(zhuǎn)化，構(gòu)建為BDNF重組胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5K-BDNF。
7，根據(jù)權(quán)利要1的所示BDNF重組甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌的構(gòu)建，重組表達(dá)載體pPIC3.5K-BDNF利用原生質(zhì)球方法轉(zhuǎn)化甲醇酵母(Pichia pastoris)，得到重組含有BDNF表達(dá)載體的重組甲醇酵母轉(zhuǎn)化子CGMCC，NO.0550。
8，根據(jù)權(quán)利要4或5或6或7，其中任選一項(xiàng)，在生產(chǎn)制備人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF藥物；或制備一種治療，維持和促進(jìn)外周神經(jīng)嵴和基板來源的多種感覺神經(jīng)元的發(fā)育、生長(zhǎng)和分化、神經(jīng)中樞的基底前腦、膽堿能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元、中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和早老性癡呆、帕金森病和外周神經(jīng)損傷神經(jīng)性疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程藥物領(lǐng)域，具體地說，涉及利用工程菌甲醇酵母(Pichia pastoris)生產(chǎn)制備人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF，以及在制備治療維持和促進(jìn)外周神經(jīng)嵴和基板來源的多種感覺神經(jīng)元的發(fā)育、生長(zhǎng)和分化，神經(jīng)中樞基底前腦、膽堿能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元、中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和一些如早老性癡呆、帕金森病、外周神經(jīng)損傷等神經(jīng)性疾病藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1394962SQ0112021
公開日2003年2月5日 申請(qǐng)日期2001年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月6日
發(fā)明者康良儀, 彭毅, 楊希才 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所