專利名稱：白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法與引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藤壺的鑒別，尤其是涉及一種白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法與引物。
背景技術(shù)：
藤壺隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)，甲殼動(dòng)物亞門(mén)(Crustacea),顎足綱 (Maxillopoda)，鞘甲亞綱(Thecostraca)，蔓足下綱(Cirripedia)，圍胸總目(Tho腦ca)， 無(wú)柄目(Sessilia)，藤壺亞目(Balanomorpha)。迄今為止共記錄8科約541種，其中 我國(guó)約有110種。
藤壺是常見(jiàn)的污損生物，主要分布于潮間帶至潮下帶淺水區(qū)，若附著在艦船的底部， 則會(huì)大大降低航速，全世界每年消除藤壺要花費(fèi)上百億美元；若藤壺附著在水下管道系 統(tǒng)內(nèi)，則容易造成堵塞，產(chǎn)生事故；此外，藤壺能破壞金屬構(gòu)筑物的油漆保護(hù)層，還與 貽貝、牡蠣等養(yǎng)殖貝類爭(zhēng)奪附著基質(zhì)和餌料，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害。因此，針對(duì)不同 種類的藤壺有目標(biāo)地進(jìn)行防除是海洋污損生物防除的主要內(nèi)容。目前，藤壺分類的主要 方法是形態(tài)學(xué)分類法(劉瑞玉；任先秋.中國(guó)動(dòng)物志無(wú)脊椎動(dòng)物第四十二巻[M].北 京科學(xué)出版社，2007)，但是同種藤壺在不同的生境中，其外形隨環(huán)境而有所改變，并 且藤壺的幼體與成體之間的形態(tài)差異較大，給藤壺樣品的分類鑒定造成了很大的困難， 降低了鑒定的準(zhǔn)確度。若將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于藤壺的鑒定可以提高樣品鑒定的準(zhǔn)確度 和效率，可幫助研究者鑒定處于不同發(fā)育階段的藤壺幼體及成體，從而有助于研究者針 對(duì)不同的藤壺種類有目標(biāo)的進(jìn)行防除。中國(guó)專利200610135259.2公開(kāi)一種不同種群大 黃魚(yú)的鑒別引物和鑒別方法，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同種群大黃魚(yú)進(jìn)行了有效的鑒別。
藤壺同時(shí)還是研究海洋生物的浮游幼體集群與擴(kuò)散情況的模式生物，對(duì)其準(zhǔn)確鑒定 還為物種定界、親緣關(guān)系和遺傳多樣性等方面的科學(xué)研究提供保障。白脊管藤壺與紋藤 壺是我國(guó)主要的固著藤壺。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于區(qū)別白脊管藤壺的混合引物。 本發(fā)明的另一目的在于提供白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法。 本發(fā)明所述混合引物為引物18SCOM、引物18SB1及引物18SW1。 所述弓l物18SCOM為5'-TTACCCACTCCCAGTTCAGG-3，；所述引物18SB1為5'-GAATATGTATACAGGCATTC-3，； 所述引物18SW1為5，-CATCAGGCCCCTCCGAAGAA-3，。
本發(fā)明所述白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法包括以下步驟-
1) 提取白脊管藤壺與紋藤壺的DNA;
2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為25pL，反應(yīng)體系如下 ddH20 16.7pL
10xPCR緩沖液 2.5pL dNTP (各2.5mmol/L) 2pL 引物18SC0M (10nmol/ml) lpL 引物18SB1 (10nmol/ml) lpL 引物18SW1 (10nmol/ml) 1^L DNA模板 0單 DNA聚合酶 0.2pL PCR循環(huán)參數(shù)是
94°C 4min—(94°C lmin—55°C lmin—72°C lmin)x34 cycles—72°C lOmin;
3) 電泳圖譜PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取產(chǎn)物5pL，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，溴 化乙錠染色，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存結(jié)果；
4) 結(jié)果判斷若只有400bp左右或者有400bp和330bp左右的兩條帶擴(kuò)出，則是 白脊管藤壺；若只有330bp左右的條帶擴(kuò)出，則是紋藤壺。
在步驟l)中，所述提取白脊管藤壺與紋藤壺的DNA可采用酚氯仿抽提法，其具 體步驟為
(1) 取用藤壺的閉殼肌，放入加有雙蒸水的Eppendorf離心管中剪碎，靜置；
(2) 將剪碎，靜置后的藤壺的閉殼肌離心，棄上清液；
(3) 加入抽提緩沖液和SDS溶液至終濃度5mg/ml，加入蛋白酶K至終濃度為 100ng/ml，混勻，水浴，至組織完全消化；
(4) 將溶液冷卻至室溫，加入酚、氯仿和異戊醇的混合溶液，混勻，離心，將上 清液移入另一個(gè)Eppendorf離心管中；
(5) 重復(fù)步驟(4) 一次；
(6) 改用氯仿，重復(fù)步驟(4) 一次；
(7) 加入乙酸鈉溶液，混勻，加入預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻至水相和無(wú)機(jī)相間無(wú)分層， 放入冰箱中，離心，棄上清液，保留沉淀；(8) 加入乙醇，上下顛倒至少l次，離心，棄上清；
(9) 重復(fù)步驟(8) —次后干燥；
(10) 加入TE，溶解DNA，冰箱保存。
在步驟(1)中，按質(zhì)量/體積比，藤壺的閉殼肌雙蒸水最好為10mg : 200pL，所 述剪碎可采用剪刀剪碎。
在步驟(2)中，所述離心可采用10，000r/min離心lmin。
在步驟(3)中，所述抽提緩沖液與SDS溶液的體積比最好為564 : 30，所述SDS 溶液的濃度(重量體積比)最好為10%，蛋白酶K的濃度最好為10 mg/ml，水浴的溫 度最好為55t:，水浴的時(shí)間最好為2 3h，在水浴期間最好每隔10min翻轉(zhuǎn)一次。
在步驟(4)中，所述酚、氯仿和異戊醇的混合溶液，按體積比最好為酚氯仿
異戊醇=25 : 24 : 1，所述離心最好在4。C下，10000r/min離心10min，所述將上清液移 入另一個(gè)Eppendorf離心管中可采用用剪掉尖部2 3mm的槍頭將上清液小心移入另一 個(gè)Eppendorf離心管中。
在步驟(7)中，所述乙酸鈉溶液的摩爾比濃度最好為3mol/L，加入乙酸鈉溶液的 量最好按體積比為步驟(6)的終產(chǎn)物的10%，所述預(yù)冷的溫度最好為-20 'C，所述放 入冰箱中的時(shí)間最好為2h，所述離心最好是12000r/min離心10min。
在步驟(8)中，按體積百分比，乙醇的濃度最好為70%,所述離心最好是10000r/min 離心10min。
在步驟(10)中，所述加入TE，溶解DNA最好是加入100ulTE， 45°C， 15min溶 解DNA。
由于本發(fā)明利用混合引物18SCOM、 18SB1及18SW1對(duì)白脊管藤壺與紋藤壺的 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)擴(kuò)增圖譜對(duì)兩物種進(jìn)行有效辨別，根據(jù)電泳結(jié)果目的片段 的長(zhǎng)度和數(shù)量可以有效區(qū)別兩種藤壺，因此提高了鑒定的準(zhǔn)確度和效率。


圖1為引物18SCOM， 18SB1與18SW1的溫度梯度PCR擴(kuò)增。在圖1中，1 6 為白脊管藤壺；7 12為紋藤壺；13為陰性對(duì)照；M為DL2000。
具體實(shí)施例方式
1)常規(guī)方法提取白脊管藤壺與紋藤壺的DNA
采用酚氯仿抽提法，提取白脊管藤壺與紋藤壺的DNA，其具體步驟如下 (1)取用藤壺的閉殼肌10mg左右，放入加有20(HiL雙蒸水的1.5mL Eppendorf 離心管中，用剪刀將其剪碎，靜置0.5h。 .(2) 10，000r/min離心lmin，棄上清液。
(3) 加入564pL抽提緩沖液，30nL的10。/。SDS(重量體積比)溶液至終濃度5mg/ml， 加入6nL蛋白酶K (10mg/ml)至終濃度為100嗎/ml，混勻。55t:水浴2 3h，期間每 隔10min翻轉(zhuǎn)一次，至組織完全消化。
(4) 將溶液冷卻至室溫，加入600pL的酚氯仿異戊醇(25 : 24 : i)溶液，充
分輕柔地混勻3 5min。在臺(tái)式高速離心機(jī)上4°C ， 10000r/min離心10min，用剪掉尖 部2 3mm的槍頭將上清液小心移入另一個(gè)1.5ml Eppendorf離心管中。
(5) 重復(fù)步驟4一次。
(6) 改用氯仿，重復(fù)步驟4一次。
(7) 加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，輕柔混勻，加入兩倍體積的 預(yù)冷(-20'C)無(wú)水乙醇，輕柔混勻至水相和無(wú)機(jī)相間無(wú)分層。放在-2(TC冰箱中2h。4°C， 12000r/min離心10min，棄上清液，保留沉淀。
(8) 加入lml70。/。乙醇，上下顛倒數(shù)次，4°C， 10000r/min離心10min，棄上清。
(9) 重復(fù)步驟8—次，室溫下干燥。
(10) 加入100ulTE， 45°C， 15min溶解DNA， 4。C冰箱保存。
2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為25uL，反應(yīng)體系如下 ddH20為16單，10xPCR緩沖液為2.5^L， dNTP (各2.5mmol/L)為2pL; 引物18SCOM (10nmol/ml) 1 ;
引物18SB1 (10nmol/ml) lpL; 引物18SW1 (10nmol/ml) lpL; DNA模板為0.6pL， DNA聚合酶為0.2pL。 PCR循環(huán)參數(shù)是
94。C 4min—(94°C lmin~>55°C lmin—72°C lmin)x34 cycles—72°C 10min; 所述引物18SCOM為5，-TTACCCACTCCCAGTTCAGG-3，。 所述引物18SB1為5，-GAATATGTATACAGGCATTC-3，。 所述引物18SW1為5，-CATCAGGCCCCTCCGAAGAA-3，。
3) 電泳圖譜PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取產(chǎn)物5uL，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，溴 化乙錠染色，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存結(jié)果。
4) 結(jié)果判斷如果只有400bp左右或者有400bp和330bp左右的兩條帶擴(kuò)出，則 是白脊管藤壺；如果只有330bp左右的條帶擴(kuò)出，則是紋藤壺，參見(jiàn)圖l。
權(quán)利要求
1.混合引物，其特征在于為引物18SCOM、引物18SB1及引物18SW1；所述引物18SCOM為5’-TTACCCACTCCCAGTTCAGG-3’；所述引物18SB1為5’-GAATATG TATACAGGCATTC-3’；所述引物18SW1為5’-CATCAGGCCCCTCCGAAGAA-3’。
2. 白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法，其特征在于包括以下步驟[1) 提取白脊管藤壺與紋藤壺的DNA;[2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為25pL，反應(yīng)體系如下 d線O 16.7nL10xPCR緩沖液 2.5pL dNTP，各2.5mmol/L 2pL 引物18SCOM， 10nmol/ml lpL 引物18SB1， 10nmol/ml lpL 引物18SW1， 10nmol/ml lpL DNA模板 0.6pL DNA聚合酶 0.2nL PCR循環(huán)參數(shù)是94°C 4min—(94°C lmin—55°C lmin—72°C lmin)x34 cycles—72°C lOmin;[3) 電泳圖譜PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取產(chǎn)物5pL，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，溴 化乙錠染色，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存結(jié)果；[4) 結(jié)果判斷若只有400bp左右或者有400bp和330bp左右的兩條帶擴(kuò)出，則是 白脊管藤壺；若只有330bp左右的條帶擴(kuò)出，則是紋藤壺。
3. 如權(quán)利要求2所述的白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法，其特征在于在步驟1) 中，所述提取白脊管藤壺與紋藤壺的DNA采用酚氯仿抽提法，其具體步驟為(1) 取用藤壺的閉殼肌，放入加有雙蒸水的E卯endorf離心管中剪碎，靜置；(2) 將剪碎，靜置后的藤壺的閉殼肌離心，棄上清液；(3) 加入抽提緩沖液和SDS溶液至終濃度5mg/ml，加入蛋白酶K至終濃度為 100ng/ml，混勻，水浴，至組織完全消化；(4) 將溶液冷卻至室溫，加入酚、氯仿和異戊醇的混合溶液，混勻，離心，將上 清液移入另一個(gè)Eppendorf離心管中；(5) 重復(fù)步驟(4) 一次；(6) 改用氯仿，重復(fù)步驟(4) 一次；(7) 加入乙酸鈉溶液，混勻，加入預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻至水相和無(wú)機(jī)相間無(wú)分層，放入冰箱中，離心，棄上清液，保留沉淀；(8) 加入乙醇，上下顛倒至少l次，離心，棄上清；(9) 重復(fù)步驟(8) —次后干燥；(10) 加入TE，溶解DNA，冰箱保存。
4. 如權(quán)利要求3所述的白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法，其特征在于在步驟(1)中，按質(zhì)量/體積比，藤壺的閉殼肌雙蒸水為iomg : 20(HiL。
5. 如權(quán)利要求3所述的白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法，其特征在于在步驟(2)中，所述離心采用10，000r/min離心lmin。
6. 如權(quán)利要求3所述的白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法，其特征在于在步驟(3)中，所述抽提緩沖液與SDS溶液的體積比為564 : 30，所述SDS溶液的濃度按重量體積比為10%，蛋白酶K的濃度為10mg/ml，水浴的溫度為55。C，水浴的時(shí)間為2 3h，在水浴期間每隔10min翻轉(zhuǎn)一次。
7. 如權(quán)利要求3所述的白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法，其特征在于在步驟(4)中，所述酚、氯仿和異戊醇的混合溶液，按體積比為酚氯仿異戊醇=25 : 24 : l，所述離心在4。C下，10000r/min離心10min，所述將上清液移入另一個(gè)Eppendorf離心管中采用用剪掉尖部2 3mm的槍頭將上清液小心移入另一個(gè)Eppendorf離心管中。
8. 如權(quán)利要求3所述的白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法，其特征在于在步驟(7)中，所述乙酸鈉溶液的摩爾比濃度為3mol/L，加入乙酸鈉溶液的量按體積比為步驟(6)的終產(chǎn)物的10%，所述預(yù)冷的溫度為-20'C，所述放入冰箱中的時(shí)間為2h，所述離心是12000r/min離心10min。
9. 如權(quán)利要求3所述的白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法，其特征在于在步驟(8)中，按體積百分比，乙醇的濃度為70%，所述離心是10000r/min離心10min。
10. 如權(quán)利要求3所述的白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法，其特征在于在步驟(IO)中，所述加入TE，溶解DNA是加入100ulTE， 45°C， 15min溶解DNA。
全文摘要
白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法與引物，涉及藤壺的鑒別。提供一種白脊管藤壺與紋藤壺的鑒別方法與引物。所述引物為混合引物18SCOM、18SB1及18SW1。提取白脊管藤壺與紋藤壺的DNA；PCR擴(kuò)增反應(yīng)；電泳圖譜；結(jié)果判斷。利用混合引物18SCOM、18SB1及18SW1對(duì)白脊管藤壺與紋藤壺的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)擴(kuò)增圖譜對(duì)兩物種進(jìn)行有效辨別，根據(jù)電泳結(jié)果目的片段的長(zhǎng)度和數(shù)量可以有效區(qū)別兩種藤壺，因此提高了鑒定的準(zhǔn)確度和效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101654704SQ20091011259
公開(kāi)日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者翠 梁, 王德祥, 王麟鶴 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)