專利名稱：一種重組Mut^s型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)。除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等，具有高度的化學(xué)選擇性和立體異構(gòu)性。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點，如在油水界面促進酯水解，而在有機相中可以酶促合成和酯交換，廣泛應(yīng)用于食品、輕紡、皮革、香料、化妝品、洗滌劑、有機 合成、醫(yī)藥等領(lǐng)域。脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中，但以微生物種類最多，目前發(fā)現(xiàn)的微生物中有近60個種屬產(chǎn)脂肪酶，工業(yè)化生產(chǎn)的就有近20種。微生物脂肪酶按其晶體結(jié)構(gòu)可分為根毛霉脂肪酶家族、褶皺假絲酵母脂肪酶家族、洋蔥假單胞菌脂肪酶家族、葡萄球菌脂肪酶家族以及黑曲霉脂肪酶、熒光假單胞菌脂肪酶、莓實假單胞菌脂肪酶、南極假絲酵母脂肪酶等。微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動植物更廣的作用pH、作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，而且在理論研究方面也具有重要的意義。我國在20世紀(jì)60年代就開展了微生物脂肪酶的研究，工業(yè)化生產(chǎn)解脂假絲酵母脂肪酶已有40多年的歷史，但是自然菌株產(chǎn)酶量低，難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，而脂肪酶基因在重組甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母中的表達(dá)取得了較大成功，使得人們把注意力集中到脂肪酶的克隆和基因表達(dá)調(diào)控上。甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌不僅具有真核表達(dá)系統(tǒng)所特有的特點，而且營養(yǎng)要求低、生長快、培養(yǎng)基廉價，使得其在學(xué)術(shù)和工業(yè)上的應(yīng)用越來越廣泛。甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母含有兩個醇氧化酶編碼基因一AOXl和A0X2，當(dāng)菌株同時含有AOXl和A0X2基因，菌株表型為Mut+型，當(dāng)菌株缺失AOXl基因，會喪失大部分的醇氧化酶活性，產(chǎn)生表型為Muts型的菌株。Mut+型菌株甲醇代謝能力強，多數(shù)情況下外源蛋白的表達(dá)量比Muts型菌株高，所以一直以來重組甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母多采用Mut+型菌株，但是該型菌株發(fā)酵時，甲醇消耗大、溶氧要求高，進而導(dǎo)致電能、冷卻水等能耗消耗大，不僅成本高，設(shè)備要求高，而且也不易于控制。同時甲醇易揮發(fā)易燃，大量存放存在潛在危險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，以減少甲醇用量，降低能耗，從而節(jié)省工業(yè)成本。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，具體步驟如下
I)重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母GSl 15接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基BSM中培養(yǎng)；2)通氣攪拌發(fā)酵，發(fā)酵過程中溶氧控制在20-40%，加入氨水調(diào)節(jié)pH5-6 ；3)發(fā)酵培養(yǎng)基甘油耗盡，補加補料培養(yǎng)液，維持溶氧20-35% ；4)細(xì)胞濕重達(dá)到350g/L以上，停止補加補料培養(yǎng)液；5)待甘油耗盡，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)液，流加量為l_3ml/L. h，控制培養(yǎng)溫度為22_26°C，氨水調(diào)節(jié)PH6，誘導(dǎo)培養(yǎng)；6) 6000rpm離心IOmin,得到含有脂肪酶的上清液。所述的補料生長液為含UmVLPTM1的50%甘油。
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)液為含12ml/L PTM1的100%甲醇。本發(fā)明通過采用缺失了 AOXl基因的重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶，該菌株對甲醇的消耗和溶氧的需求較小，能夠減輕動力負(fù)荷，能耗少，節(jié)省原材料成本，便于控制。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GBT23535-2009，對本發(fā)明生產(chǎn)的脂肪酶進行酶活測定，脂肪酶酶活可達(dá)9000U/ml，部分生產(chǎn)工藝條件下，脂肪酶產(chǎn)量甚至可以提高到10000U/ml，所以更利于脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母購自鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所。培養(yǎng)基及培養(yǎng)液的制備I)種子培養(yǎng)基酵母粉10g/ml,蛋白胨 20g/ml,甘油 10g/ml, IOOmM pH6. O 磷酸鹽緩沖液 100ml/L。2)發(fā)酵培養(yǎng)基BSM85%H3P0426. 7ml/L, CaSO4O. 93g/L, K2S0418. 2g/L, MgSO4 · 7H2014. 9g/L, K0H4. 13g/L,甘油 40g/L，PTM1I OOml/L, 25% 氨水調(diào)節(jié) pH5_6。3) PTM1CuSO4 · 5H206g/L, NaIO. 08g/L, MnSO4 · H203g/L, Na2MoO4 · 2H200. 2g/L, H3BO3O. 02g/L, CoCl2O. 5g/L, ZnCl220g/L, FeSO4 · 7H2065g/L, H2S045ml/L,生物素 0. 2g/L。4)補料生長液含UmVLPTM1 的 50% 甘油。5)誘導(dǎo)培養(yǎng)液含12ml/L PTM1 的 100% 甲醇。實施例I本實施例重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，具體步驟如下I)挑取重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母GS115單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，280C 200rpm培養(yǎng)20h，再接種于滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基BSM中，接種量為5% ；2)通氣攪拌發(fā)酵，發(fā)酵過程中溶氧控制在40%，自動流加25%工業(yè)氨水調(diào)節(jié)pH6，溫度控制在28 °C ；3)待發(fā)酵培養(yǎng)基甘油耗盡，補加含12ml/L PTM1的50%甘油，繼續(xù)維持溶氧在35% ；4)待細(xì)胞濕重達(dá)到350g/L以上，停止補加甘油，維持饑餓狀態(tài)；
5)待甘油耗盡，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培養(yǎng)溫度為22°C，流加量l-6h為lml/L. h，6h后增加至2ml/L. h，25%工業(yè)氨水調(diào)節(jié)pH6，誘導(dǎo)培養(yǎng)80h ；6)6000rpm離心lOmin，得到含有脂肪酶的上清液。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GBT23535-2009，測定本實施例生產(chǎn)的脂肪酶酶活。測試結(jié)果為80h發(fā)酵上清中脂肪酶酶活為9000U/ml。實施例2本實施例重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，具體步驟如下I)挑取重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母GS115單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，280C 200rpm培養(yǎng)20h，再接種于滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基BSM中，接種量為10% ；2)通氣攪拌發(fā)酵，發(fā)酵過程中溶氧控制在30%，自動流加25%工業(yè)氨水調(diào)節(jié)pH5，溫度控制在28 °C ； 3)待發(fā)酵培養(yǎng)基甘油耗盡，補加含12ml/L PTM1的50%甘油，繼續(xù)維持溶氧在30% ；4)待細(xì)胞濕重達(dá)到350g/L以上，停止補加甘油，維持饑餓狀態(tài)；5)待甘油耗盡，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培養(yǎng)溫度為26°C，流加量l-6h為lml/L. h，6h后增加至2ml/L. h，25%工業(yè)氨水調(diào)節(jié)pH6，誘導(dǎo)培養(yǎng)80h ；6)6000rpm離心lOmin，得到含有脂肪酶的上清液。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GBT23535-2009，測定本實施例生產(chǎn)的脂肪酶酶活。測試結(jié)果為80h發(fā)酵上清中脂肪酶酶活為9700U/ml。實施例3本實施例重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，具體步驟如下I)挑取重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母GS115單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，280C 200rpm培養(yǎng)20h，再接種于滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基BSM中，接種量為8% ；2)通氣攪拌發(fā)酵，發(fā)酵過程中溶氧控制在20%，自動流加25%工業(yè)氨水調(diào)節(jié)pH6，溫度控制在28 °C ；3)待發(fā)酵培養(yǎng)基甘油耗盡，補加含12ml/L PTM1的50%甘油，繼續(xù)維持溶氧在20% ；4)待細(xì)胞濕重達(dá)到350g/L以上，停止補加甘油，維持饑餓狀態(tài)；5)待甘油耗盡，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培養(yǎng)溫度為24°C，流加量l-6h為lml/L. h，6h后增加至2ml/L. h，25%工業(yè)氨水調(diào)節(jié)pH6，誘導(dǎo)培養(yǎng)80h ；6)6000rpm離心lOmin，得到含有脂肪酶的上清液。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GBT23535-2009，測定本實施例生產(chǎn)的脂肪酶酶活。測試結(jié)果為80h發(fā)酵上清中脂肪酶酶活為9300U/ml。實施例4本實施例重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，具體步驟如下I)挑取重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母GS115單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，280C 200rpm培養(yǎng)20h，再接種于滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基BSM中，接種量為10% ；2)通氣攪拌發(fā)酵，發(fā)酵過程中溶氧控制在30%，自動流加25%工業(yè)氨水控制pH5，溫度控制在28 °C ；3)待發(fā)酵培養(yǎng)基甘油耗盡，補加含12ml/L PTM1的50%甘油，繼續(xù)維持溶氧在30% ；4)待細(xì)胞濕重達(dá)到350g/L以上，停止補加甘油，維持饑餓狀態(tài)；5)待甘油耗盡，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培養(yǎng)溫度為26°C，流加量l-6h為lml/L. h，6h后增加至2ml/L. h，30h后甲醇流加速度增加至3ml/L. h，25%工業(yè)氨水調(diào)節(jié)pH6，誘導(dǎo)培養(yǎng)80h ；
6)6000rpm離心lOmin，得到含有脂肪酶的上清液。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GBT23535-2009，測定本實施例生產(chǎn)的脂肪酶酶活。測試結(jié)果為80h發(fā)酵上清中脂肪酶酶活為9500U/ml。實施例5本實施例重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，具體步驟如下I)挑取重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母GS115單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，280C 200rpm培養(yǎng)20h，再接種于滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基BSM中，接種量為10% ；2)通氣攪拌發(fā)酵，發(fā)酵過程中溶氧控制在30%，自動流加25%工業(yè)氨水控制pH5，溫度控制在28 °C ；3)待發(fā)酵培養(yǎng)基甘油耗盡，補加含12ml/L PTM1的50%甘油，繼續(xù)維持溶氧在30% ；4)待細(xì)胞濕重達(dá)到350g/L以上，停止補加甘油，維持饑餓狀態(tài)；
5)待甘油耗盡，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培養(yǎng)溫度為26°C，流加量
l-6h為lml/L. h, 6h后增加至2ml/L. h, 30h后甲醇流加速度增加至3ml/L. h, 50h后甲醇流加速度降低至2ml/L. h，25%工業(yè)氨水調(diào)節(jié)pH6，誘導(dǎo)培養(yǎng)80h ；6)6000rpm離心lOmin，得到含有脂肪酶的上清液。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GBT23535-2009，測定本實施例生產(chǎn)的脂肪酶酶活。測試結(jié)果為80h發(fā)酵上清中脂肪酶酶活為10700U/ml。
權(quán)利要求
1.一種重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于，具體步驟如下 1)重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母GS115接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基BSM中； 2)通氣攪拌發(fā)酵，發(fā)酵過程中溶氧控制在20-40%，加入氨水調(diào)節(jié)pH5-6； 3)發(fā)酵培養(yǎng)基甘油耗盡，補加補料培養(yǎng)液，維持溶氧20-35%； 4)細(xì)胞濕重達(dá)到350g/L以上，停止補加補料培養(yǎng)液； 5)待甘油耗盡，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)液，流加量為l_3ml/L.h，控制培養(yǎng)溫度為22-26°C，氨水調(diào)節(jié)pH6，誘導(dǎo)培養(yǎng)； 6)6000rpm離心IOmin,得到含有脂肪酶的上清液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于，所述的補料生長液為含UmVLPTM1的50%甘油。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)液為含UmVLPTM1的100%甲醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶的方法，具體步驟如下重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母GS115接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基BSM中發(fā)酵；待發(fā)酵培養(yǎng)基甘油耗盡，補加補料培養(yǎng)液；當(dāng)細(xì)胞濕重達(dá)到350g/L以上，停止補加補料培養(yǎng)液；待甘油耗盡，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)液，流加量為1-3ml/L.h，控制培養(yǎng)溫度為22-26℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)；離心，得到含有脂肪酶的上清液。本發(fā)明通過采用缺失了AOX1基因的重組Muts型甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母生產(chǎn)脂肪酶，該菌株對甲醇的消耗和溶氧的需求較小，能夠減輕動力負(fù)荷，能耗少，節(jié)省原材料成本，便于控制，利于工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/84GK102776163SQ20121030201
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者司富強, 蔡翔 申請人:鄭州慧澤生化科技有限公司