專(zhuān)利名稱(chēng)：橈足類(lèi)單個(gè)卵的dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA提取技術(shù)，尤其是對(duì)橈足類(lèi)的單個(gè)卵，包括不同產(chǎn)卵方式、不 同生理狀態(tài)以及不同卵徑都實(shí)用且迅速有效的一種新型的DNA提取方法。
背景技術(shù)：
目前，世界上針對(duì)浮游動(dòng)物單個(gè)卵提取的方法主要有兩種，一種是Montero-Pau 等(Montero_Pau et al.Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extractionmethod for the molecular ecology of zooplanktonic di即ausing eggs. Limnology and Oceanography :Methods， 2008， 6 :218-222)提出的HotSH0T方法，該 方法主要針對(duì)的是浮游動(dòng)物滯育卵單個(gè)卵基因組DNA的提取，其操作步驟主要包括以下幾 個(gè)步驟加入一定量的裂解緩沖液；通過(guò)物理手段和工具把滯育卵搗破；最后通過(guò)一個(gè)熱 孵和冷擊的過(guò)程使基因組DNA得以釋放。另一種方法是Walsh等(Walsh et al. Chelex-100 as a medium for simple extraction of DNA forPCR—based typing from forensic material. BioTechniques, 1991， 10 :506-513)提出的Chelex-100方法，該方法的原理簡(jiǎn)
單，與第一種方法類(lèi)似，不同的是在這種方法提取的過(guò)程中首先加入裂解液，隨后加入由美 國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad)公司生產(chǎn)的Chelex樹(shù)脂，通過(guò)物理手段對(duì)卵進(jìn)行破碎，繼而通過(guò)一個(gè) 熱孵過(guò)程最后來(lái)得到基因組DNA。當(dāng)然，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，各種商業(yè)試劑盒針對(duì) 微小組織和個(gè)體基因組DNA提取應(yīng)運(yùn)而生，這些試劑盒包括有美國(guó)Promega公司生產(chǎn)的 Wiazard genomic DNA purification kit，德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的QiagenDNeasy tissue extraction kit等等。上述提到的各種商業(yè)的試劑盒的原理跟目前世界上普遍采用的兩 種方法提取單個(gè)卵基因組DNA的原理相似，只是商業(yè)試劑盒都通過(guò)膜的吸附和洗脫完成對(duì) DNA的收集和純化。值得一提的是目前普遍使用的兩種針對(duì)浮游動(dòng)物單個(gè)卵DNA提取的方 法和后來(lái)層出不窮的商業(yè)試劑盒都存在不少的問(wèn)題，歸納起來(lái)主要有以下幾點(diǎn)1、目前流 行的兩種方法都通過(guò)物理的手段和工具來(lái)對(duì)卵的結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，這個(gè)操作將會(huì)使得提取到 的DNA量比理論上要少，這些是由操作所帶來(lái)的人為的損失，并且對(duì)本身DNA含量不高的單 個(gè)卵來(lái)說(shuō)這個(gè)損失是巨大的；2、在Chelex-100這種方法中，本身加入的樹(shù)脂無(wú)形中增加了 污染的機(jī)會(huì)，同時(shí)實(shí)踐已證明了樹(shù)脂的加入對(duì)下游PCR實(shí)驗(yàn)具有很大的抑制作用；3、商業(yè) 試劑盒主要通過(guò)膜的吸附和洗脫等過(guò)程來(lái)完成DNA的收集和純化，DNA質(zhì)量得到提高的同 時(shí)洗脫效率直接影響到DNA的濃度，這也將直接影響到下游的PCR實(shí)驗(yàn)。
上述的均為國(guó)外在這方面的研究進(jìn)展，至今，未見(jiàn)國(guó)內(nèi)對(duì)橈足類(lèi)單個(gè)卵基因組DNA 的提取工作的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)單個(gè)浮游動(dòng)物單個(gè)卵基因組DNA提取時(shí) 的不足，提供一種橈足類(lèi)單個(gè)卵的DNA提取方法。包括不同卵徑和不同產(chǎn)卵方式所產(chǎn)生的 單個(gè)卵。此方法不僅能夠盡量保證DNA的提取的效率同時(shí)提取到的DNA可以直接應(yīng)用到下
3游PCR實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明包括以下步驟 1)將橈足類(lèi)單個(gè)卵置于1XTE緩沖液中，加入蛋白酶K，使蛋白酶K的終濃度達(dá) 2. 5 5. 5mg/mL，得混合提取液； 2)將得到的混合提取液通過(guò)一個(gè)熱孵程序，得單個(gè)卵DNA的粗提液； 3)對(duì)單個(gè)卵DNA的粗提液由核酸共沉劑(DNA Mate)進(jìn)行沉淀，得DNA沉淀。可將
沉淀物溶于滅菌水中，存于冰箱中備用。 在步驟l)中，所述lXTE緩沖液的pH最好為7.5 8.5，加入蛋白酶K的目的主 要是通過(guò)蛋白酶K的作用來(lái)破壞卵的外部結(jié)構(gòu)使得內(nèi)部的DNA能夠被順利釋放出來(lái)，同時(shí) 也避免了物理破壞給DNA帶來(lái)的損失。 在步驟2)中，所述熱孵程序的具體程序如下37 6(TC放置25 120min，然后 在95。C溫度下放置5min。 在步驟3)中，所述核酸共沉劑(DNA Mate)可采用大連寶生物有限公司(Takara) 生產(chǎn)的核酸共沉劑(DNA Mate)。 所述沉淀的具體步驟如下在單個(gè)卵DNA的粗提液中加入醋酸鈉溶液和核酸共沉 劑(DNA Mate)，繼續(xù)加入-2(TC預(yù)冷的無(wú)水乙醇，10000 14000rpm離心10 30min之后 棄上清，用乙醇清洗并干燥，即得DNA沉淀。所述醋酸鈉溶液和核酸共沉劑的加入量按體積 比可為單個(gè)卵DNA的粗提液的10% 。所述無(wú)水乙醇的加入量按體積比可為單個(gè)卵DNA的粗 提液、醋酸鈉溶液和核酸共沉劑三部分總體積的2. 5倍。 本發(fā)明首先利用蛋白酶K在55t: 30min和95t: 5min這樣一個(gè)熱敷程序下對(duì)單個(gè) 卵外部結(jié)構(gòu)進(jìn)行裂解，使得DNA得以充分釋放，然后通過(guò)DNA Mate對(duì)DNA溶液進(jìn)行濃縮和 沉淀能夠有效地從橈足類(lèi)不同卵徑以及不同產(chǎn)卵方式所產(chǎn)的單個(gè)卵中提取到基因組DNA。
核酸共沉劑(DNA Mate)是被實(shí)踐所證明的能對(duì)微量DNA具有很強(qiáng)的沉淀和濃縮 的作用。在本發(fā)明中，在提取的整個(gè)過(guò)程中盡量減少使用離心管， 一方面能夠減少提取過(guò)程 中DNA的損失，同時(shí)也能大大減少外源DNA的污染的機(jī)會(huì)。本發(fā)明中采用了核酸共沉劑對(duì) DNA進(jìn)行最后的沉淀和濃縮，實(shí)驗(yàn)證明核酸共沉劑的使用大大提高了 DNA濃度且所提取到 的DNA能夠直接被應(yīng)用到下游的PCR實(shí)驗(yàn)。


圖1為3種橈足類(lèi)單個(gè)卵基因組DNA的PCR結(jié)果。在圖1中，M是GenRuler lOObpruler ;1 2分別為中華哲水蚤單個(gè)卵基因組DNA的PCR結(jié)果以及平行組PCR的結(jié) 果；3 4分別為瘦尾胸剌水蚤單個(gè)卵基因組DNA的PCR結(jié)果以及平行組PCR的結(jié)果；5 6分別為婆羅異劍水蚤單個(gè)卵基因組DNA的PCR結(jié)果以及平行組PCR的結(jié)果；7為空白樣的 PCR結(jié)果(用超純水代替單個(gè)卵進(jìn)行實(shí)驗(yàn))。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 將橈足類(lèi)單個(gè)卵置于5 10iiL的1XTE緩沖液(pH 8)中；加入蛋白酶K，使蛋 白酶K的終濃度達(dá)4mg/mL(加入蛋白酶K的目的主要是通過(guò)蛋白酶K的作用來(lái)破壞卵的外部結(jié)構(gòu)使得內(nèi)部的DNA能夠被順利釋放出來(lái)，同時(shí)也避免了物理破壞給DNA帶來(lái)的損 失)；加入蛋白酶K之后便可得到混合提取液，隨即將得到的混的提取液通過(guò)一個(gè)熱孵程 序，具體程序如下55t:放置30min，然后在95t:溫度下放置5min。上述程序結(jié)束之后便可 得到單個(gè)卵DNA的粗提液，接下來(lái)通過(guò)由大連寶生物有限公司(Takara)生產(chǎn)的核酸共沉 劑(DNA Mate)進(jìn)行沉淀。沉淀的具體步驟如下加入DNA粗提液十分之一體積的3M的醋 酸鈉溶液和4ii LDNA Mate ;繼續(xù)加入上述溶液總體積的2. 5倍體積的-2(rC預(yù)冷的無(wú)水乙 醇，12000rpm離心20min之后棄上清；用體積比為70%的乙醇清洗并干燥；干燥之后得到 DNA沉淀，最后將此DNA沉淀溶于5 20 L的滅菌水中存于_201:冰箱中備用。核酸共沉 劑(DNA Mate)是被實(shí)踐所證明的能對(duì)微量DNA具有很強(qiáng)的沉淀和濃縮的作用。在本發(fā)明 中，在提取的整個(gè)過(guò)程中盡量減少使用離心管，一方面能夠減少提取過(guò)程中DNA的損失，同 時(shí)也能大大減少外源DNA的污染的機(jī)會(huì)。本發(fā)明中采用了核酸共沉劑對(duì)DNA進(jìn)行最后的沉 淀和濃縮，實(shí)驗(yàn)證明核酸共沉劑的使用大大提高了 DNA濃度且所提取到的DNA能夠直接被 應(yīng)用到下游的PCR實(shí)驗(yàn)。 運(yùn)用本發(fā)明對(duì)3種不同種類(lèi)的橈足類(lèi)，分別是瘦尾胸剌水蚤(Thompson&Scott， 1903)、中華哲水蚤(Brodsky， 1962)和婆羅異劍水蚤(Lindberg， 1954)進(jìn)行了單個(gè)卵基因 組DNA的提取，其中瘦尾胸剌水蚤和中華哲水蚤屬于自由產(chǎn)卵型的橈足類(lèi)，而婆羅異劍水 蚤則屬于帶卵囊型。每種橈足類(lèi)設(shè)置兩組平行，最后將提取到的單個(gè)卵基因組DNA直接用 于PCR實(shí)驗(yàn)，引物CopF2和CopRl能擴(kuò)增出橈足類(lèi)28S rDNA的特異性片段( 300bp)。 PCR結(jié)果見(jiàn)附圖，其中M是GenRulerTM 100bp ruler ;1 2分別為中華哲水蚤單個(gè)卵基因 組DNA的PCR結(jié)果以及平行組PCR的結(jié)果；3 4分別為瘦尾胸剌水蚤單個(gè)卵基因組DNA的 PCR結(jié)果以及平行組PCR的結(jié)果；5 6分別為婆羅異劍水蚤單個(gè)卵基因組DNA的PCR結(jié)果 以及平行組PCR的結(jié)果；7為空白樣的PCR結(jié)果(用超純水代替單個(gè)卵進(jìn)行實(shí)驗(yàn))。結(jié)果顯 示運(yùn)用本發(fā)明對(duì)不同種類(lèi)橈足類(lèi)單個(gè)卵基因組DNA的提取，包括對(duì)不同產(chǎn)卵的方式和不同 卵徑大小的單個(gè)卵基因組的提取。所得到的單個(gè)卵基因組DNA能直接運(yùn)用于下游的PCR反 應(yīng)，且實(shí)驗(yàn)中無(wú)外源DNA污染的情況出現(xiàn)，整個(gè)操作簡(jiǎn)單易行且高效迅速。
實(shí)施例2 與實(shí)施例1類(lèi)似，將橈足類(lèi)單個(gè)卵置于5 10 ii L的1 X TE緩沖液(pH 7. 5)中； 加入蛋白酶K，使蛋白酶K的終濃度達(dá)2. 5mg/mL (加入蛋白酶K的目的主要是通過(guò)蛋白酶K 的作用來(lái)破壞卵的外部結(jié)構(gòu)使得內(nèi)部的DNA能夠被順利釋放出來(lái)，同時(shí)也避免了物理破壞 給DNA帶來(lái)的損失)；加入蛋白酶K之后便可得到混合提取液，隨即將得到的混的提取液通 過(guò)一個(gè)熱孵程序，具體程序如下6(TC放置25min，然后在95。C溫度下放置5min。上述程序 結(jié)束之后便可得到單個(gè)卵DNA的粗提液，接下來(lái)通過(guò)由大連寶生物有限公司(Takara)生產(chǎn) 的核酸共沉劑(DNA Mate)進(jìn)行沉淀。沉淀的具體步驟如下加入DNA粗提液十分之一體積 的3M的醋酸鈉溶液和4ii L DNA Mate ;繼續(xù)加入上述溶液總體積的2. 5倍體積的-2(TC預(yù) 冷的無(wú)水乙醇，10000rpm離心30min之后棄上清；用體積比為70%的乙醇清洗并干燥；干 燥之后得到DNA沉淀，最后將此DNA沉淀溶于5 20 ii L的滅菌水中存于_201:冰箱中備 用。 實(shí)施例3 與實(shí)施例1類(lèi)似，將橈足類(lèi)單個(gè)卵置于5 10 ii L的1 X TE緩沖液(pH 8. 5)中；
5加入蛋白酶K，使蛋白酶K的終濃度達(dá)5. 5mg/mL(加入蛋白酶K的目的主要是通過(guò)蛋白酶K 的作用來(lái)破壞卵的外部結(jié)構(gòu)使得內(nèi)部的DNA能夠被順利釋放出來(lái)，同時(shí)也避免了物理破壞 給DNA帶來(lái)的損失)；加入蛋白酶K之后便可得到混合提取液，隨即將得到的混的提取液通 過(guò)一個(gè)熱孵程序，具體程序如下37t:放置120min，然后在95。C溫度下放置5min。上述程 序結(jié)束之后便可得到單個(gè)卵DNA的粗提液，接下來(lái)通過(guò)由大連寶生物有限公司(Takara)生 產(chǎn)的核酸共沉劑(DNA Mate)進(jìn)行沉淀。沉淀的具體步驟如下加入DNA粗提液十分之一體 積的3M的醋酸鈉溶液和4ii L DNA Mate ;繼續(xù)加入上述溶液總體積的2. 5倍體積的_20°C 預(yù)冷的無(wú)水乙醇，14000rpm離心10min之后棄上清；用體積比為70%的乙醇清洗并干燥； 干燥之后得到DNA沉淀，最后將此DNA沉淀溶于5 20 ii L的滅菌水中存于_201:冰箱中備 用。
權(quán)利要求
橈足類(lèi)單個(gè)卵的DNA提取方法，其特征在于包括以下步驟1)將橈足類(lèi)單個(gè)卵置于1×TE緩沖液中，加入蛋白酶K，使蛋白酶K的終濃度達(dá)2.5～5.5mg/mL，得混合提取液；2)將得到的混合提取液通過(guò)一個(gè)熱孵程序，得單個(gè)卵DNA的粗提液；3)對(duì)單個(gè)卵DNA的粗提液由核酸共沉劑進(jìn)行沉淀，得DNA沉淀。
2. 如權(quán)利要求1所述的橈足類(lèi)單個(gè)卵的DNA提取方法，其特征在于在步驟1)中，所述 lXTE緩沖液的pH為7. 5 8. 5。
3. 如權(quán)利要求1所述的橈足類(lèi)單個(gè)卵的DNA提取方法，其特征在于在步驟2)中，所述 熱孵程序的具體程序如下37 6(TC放置25 120min，然后在95。C溫度下放置5min。
4. 如權(quán)利要求1所述的橈足類(lèi)單個(gè)卵的DNA提取方法，其特征在于在步驟3)中，所 述沉淀的具體步驟如下在單個(gè)卵DNA的粗提液中加入醋酸鈉溶液和核酸共沉劑，繼續(xù)加 入-2(TC預(yù)冷的無(wú)水乙醇，10000 14000rpm離心10 30min之后棄上清，用乙醇清洗并 干燥，即得DNA沉淀。
5. 如權(quán)利要求4所述的橈足類(lèi)單個(gè)卵的DNA提取方法，其特征在于所述醋酸鈉溶液和 核酸共沉劑的加入量按體積比為單個(gè)卵DNA的粗提液的10%。
6. 如權(quán)利要求4所述的橈足類(lèi)單個(gè)卵的DNA提取方法，其特征在于所述無(wú)水乙醇的加 入量按體積比為單個(gè)卵DNA的粗提液、醋酸鈉溶液和核酸共沉劑三部分總體積的2. 5倍。
全文摘要
橈足類(lèi)單個(gè)卵的DNA提取方法，涉及一種DNA提取技術(shù)。提供一種橈足類(lèi)單個(gè)卵的DNA提取方法。包括不同卵徑和不同產(chǎn)卵方式所產(chǎn)生的單個(gè)卵。此方法不僅能夠盡量保證DNA的提取的效率同時(shí)提取到的DNA可以直接應(yīng)用到下游PCR實(shí)驗(yàn)。將橈足類(lèi)單個(gè)卵置于1×TE緩沖液中，加入蛋白酶K，使蛋白酶K的終濃度達(dá)2.5～5.5mg/mL，得混合提取液；將得到的混合提取液通過(guò)一個(gè)熱孵程序，得單個(gè)卵DNA的粗提液；對(duì)單個(gè)卵DNA的粗提液由核酸共沉劑進(jìn)行沉淀，得DNA沉淀?？蓪⒊恋砦锶苡跍缇?，存于冰箱中備用。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101696408SQ200910112700
公開(kāi)日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者吳荔生, 徐智煥, 王桂忠, 王超, 蔣潔蘭, 陳丹 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué);