專利名稱：：用棒狀細(xì)菌發(fā)酵制備l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了通過用其中accBC基因被擴增的棒狀細(xì)菌發(fā)酵制備L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸的方法。L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸用于動物飼料，人的內(nèi)服藥及制藥工業(yè)。已知那些氨基酸由棒狀細(xì)菌，尤其是谷氨酸棒桿菌的菌株發(fā)酵生產(chǎn)。由于這些產(chǎn)物非常之重要性，一直嘗試改進(jìn)制備方法。改進(jìn)的方法可涉及與發(fā)酵過程相關(guān)的措施，如攪拌及氧補給，或營養(yǎng)培養(yǎng)基基的組分如發(fā)酵期糖的濃度，或如經(jīng)離子交換層析加工產(chǎn)物形式，或微生物自身的內(nèi)在性質(zhì)。為改進(jìn)這些微生物的性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇方法。以這種方式可獲得對抗代謝物如賴氨酸同源物S-[2-氨乙基]-半胱氨酸有抗性的菌株，或在調(diào)節(jié)方面重要氨基酸的營養(yǎng)缺陷體，并產(chǎn)生L-氨基酸。幾年來，通過擴增氨基酸生物合成的各個基因，并研究對L-氨基酸生產(chǎn)的影響，重組DNA技術(shù)已被用于改進(jìn)谷氨酸棒桿菌的L-氨基酸生產(chǎn)菌株。此方面的文章見于Kinoshita(“谷氨酸細(xì)菌”，見《工業(yè)微生物學(xué)》，Demain和Solomon編輯，BenjaminCummings，英國倫敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6，261-272(1994))，Jetten和Sinskey(CriticalReviewsinBiotechnology15，73-103(1995))和Sahmetal.(紐約科學(xué)院年報782，25-39(1996))。本發(fā)明的目的是提供一種新的通過發(fā)酵制備L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸的改良方法。L-氨基酸尤其L-賴氨酸用于動物的飼料，人內(nèi)服藥及制藥工業(yè)。因而提供新改進(jìn)的制備這些化合物的方法通常是令人感興趣的。應(yīng)了解后文提及的任何L-賴氨酸或賴氨酸不只意味著其本體，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。本發(fā)明提供了用棒狀細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸特別是L-賴氨酸的方法，所述棒狀細(xì)菌尤其是已產(chǎn)生所需L-氨基酸，且其中編碼乙酰輔酶A羧化酶的攜帶生物素—羧基載體蛋白結(jié)構(gòu)域和生物素羧化酶結(jié)構(gòu)域的亞基的核苷酸序列(accBC基因)是擴增的，尤其是過量表達(dá)的。優(yōu)選的實施方案見權(quán)利要求書。在此，術(shù)語“擴增”指通過增加基因的拷貝數(shù)、應(yīng)用強啟動子或應(yīng)用編碼具有高活性的相應(yīng)酶的基因或任選的這些措施的結(jié)合，從而增加微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶的細(xì)胞內(nèi)活性。本發(fā)明提供的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素中，或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸特別是L—賴氨酸。這些微生物是棒狀細(xì)菌成員、特別是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中，特別提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。適當(dāng)?shù)陌魲U菌屬尤其谷氨酸棒桿菌的菌株是下列的已知野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATTC13032醋谷氨酸棒桿菌ATTC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATTC13870CorynebacteriumthermoaminogenesFERMBP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴展短桿菌ATCC14020及產(chǎn)生L-氨基酸的突變株以及由其產(chǎn)生的菌株如谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712黃色短桿菌FERM-P6463及黃色短桿菌FERM-P6464。accBC基因編碼乙酰輔酶A羧化酶的攜帶生物素—羧基載體蛋白結(jié)構(gòu)域和生物素—羧化酶結(jié)構(gòu)域的亞基。谷氨酸棒桿菌的accBC基因的核苷酸序列已由Jager等測定(ArchivesofMicrobiology166，76-82(1996))，且通?？蓮臍W洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL，Heidelberg，德國)的數(shù)據(jù)庫獲得，登記號為U35023。Jager等(ArchivesofMicrobiology166，76-82(1996))所述的谷氨酸棒桿菌的accBC基因可用于本發(fā)明。另外由于遺傳密碼的簡并性或功能—中性有義突變產(chǎn)生的accBC基因的等位基因也可使用。為達(dá)到過量表達(dá)，可以增加相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或者可以突變位于編碼序列上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點。摻入編碼序列上游的表達(dá)盒以相同的方式起作用。在發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸期間，通過以誘導(dǎo)型啟動子的方式增加表達(dá)也是可能的。也可以通過延長mRNA壽命的方法改善表達(dá)。另外也可通過阻止酶蛋白質(zhì)的降解增加酶活性。基因或者基因構(gòu)建體可以以可變拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中或者整合進(jìn)染色體，并擴增。另外，基因的過量表達(dá)也可以通過改變營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成與培養(yǎng)技術(shù)來完成。在這一點上，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會從以下文獻(xiàn)中得到指導(dǎo)Martin等(生物/技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利EPSO472869，美國專利4,601,893，Schwarzer和Piihler(生物/技術(shù)9，84-87(1991)，Reinscheid等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，專利申請WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)和生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物學(xué)回顧60512-538(1996))和已知的遺傳學(xué)與分子生物學(xué)教科書。能過量表達(dá)accBC基因的質(zhì)粒的一實例是pZlaccBC(圖1)，其包含在菌株MH20-22B/pZlaccBC中。質(zhì)粒pZlaccBC是E.coli-谷氨酸棒桿菌穿梭載體，其攜帶accBC基因并基于質(zhì)粒pZl(Menkeletal.，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)55(3)，684-688(1989))。另外，對L-氨基酸生產(chǎn)有利的是不僅accBC基因而且一或多種生物合成途徑的酶的過量表達(dá)，這樣，例如對于L-賴氨酸的制備，·可以同時過量表達(dá)編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B0197335)，或·可以同時擴增賦予S-(2-氨乙基)—半胱氨酸抗性的DNA片段(EP-A0088166)。另外，為產(chǎn)生L-氨基酸，除了過量表達(dá)accBC基因，切斷非所需副反應(yīng)也是有利的(Nakayama＂生產(chǎn)氨基酸的微生物的培育＂，見《微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生》，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編者)，學(xué)院出版社，倫敦，英國，1982)。為生產(chǎn)L-氨基酸，根據(jù)本發(fā)明制備的微生物可采用分批或流加方法或重復(fù)流加方法連續(xù)培養(yǎng)或不連續(xù)培養(yǎng)。已知培養(yǎng)方法總結(jié)在以下教科書中Chmiel(Bioprozesstechnik1.EinfhrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag，Stuttgart，1991))或Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。所使用的培養(yǎng)基必須完全滿足特定菌株的需要。各種微生物的培養(yǎng)基在美國細(xì)菌學(xué)會的“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊”(華盛頓D.C.，美國)中有描述?？梢岳玫奶荚窗ㄌ呛吞妓衔?，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素；油和脂肪，如大豆油，向日葵油，花生油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸；醇，如甘油和乙醇，以及有機酸，如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨使用或者混合使用?？梢岳玫牡窗ê袡C化合物，如蛋白胨，酵母膏，肉膏，麥芽汁，玉米漿，大豆粉和尿素；或者無機化合物，如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨使用或者混合使用。可以利用的磷源是磷酸二氫鉀或者磷酸氫二鉀或者相應(yīng)的含鈉鹽。培養(yǎng)基必須還含有生長必需的金屬鹽，如硫酸鎂或者硫酸鐵。最后，除了以上所述的物質(zhì)外，對促生長必需的物質(zhì)如氨基酸和維生素也可以使用。合適的前體也可以添加至培養(yǎng)基中。所述的營養(yǎng)物質(zhì)可以以單批或者在培養(yǎng)期間適當(dāng)流加至培養(yǎng)基中。堿性化合物，如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨或氨水，或者酸性化合物，如磷酸或者硫酸，用來適當(dāng)?shù)乜刂婆囵B(yǎng)物的pH值。消泡劑，如脂肪酸聚乙二醇酯，可以用來控制起泡。合適的選擇性作用物質(zhì)，如抗生素，可以添加至培養(yǎng)基中，以保持質(zhì)粒穩(wěn)定性。氧氣或含氧的氣體混合物，如空氣，引入培養(yǎng)基，以保持需氧條件。培養(yǎng)溫度通常從20℃至45℃，優(yōu)選地為25℃至40℃。培養(yǎng)繼續(xù)至形成最大量的所需L-氨基酸。這一目標(biāo)通常在10小時至160小時之內(nèi)實現(xiàn)。L-氨基酸可以采用陰離子交換層析和隨后的茚三酮衍生化分析，如Spackman等所描述的(分析化學(xué)，30，1190(1958))。谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pZlaccBC已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國)，保藏號為DSM12786。本發(fā)明的方法可用于經(jīng)發(fā)酵棒狀細(xì)菌制備L-氨基酸，尤其是L-天冬氨酸，L-天冬酰胺、L-高絲氨酸，L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸。其尤其用于制備L-賴氨酸。實施例通過以下實施例，對本發(fā)明進(jìn)一步詳加例證。為此，用L-賴氨酸生產(chǎn)菌株DSM5715(EP-B-0435132)進(jìn)行實驗，由此證實了本發(fā)明方法的優(yōu)越性。實施例1構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pZlaccBC和菌株DSM5715/pZlaccBC為了構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pZlaccBC，包含accBC基因的pWJ71質(zhì)粒(Jager等，微生物學(xué)報(1996)16676-82)用限制性內(nèi)切酶PvuI和NaeI消化，Klenow聚合酶補平，堿性磷酸酶處理，瓊脂糖凝膠法回收2.1kb的accBC基因，上述操作方法參照Sambrook等(分子克隆實驗手冊(1989)，冷泉港實驗室)。在制備accBC基因的同時，將質(zhì)粒pZ1(Menkel等，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)55(3)，684-688(1989))用SacI酶切，Klenow聚合酶補平，堿性磷酸酶處理。然后將上述方法處理的所制備的accBC基因和載體pZl連接，并用連接混合物轉(zhuǎn)化菌株DSM5715，連接方法參見Libel等(FEMS微生物學(xué)通訊65，299-304(1989))。轉(zhuǎn)化子使用Merck公司(Darmstadt，德國)的腦/心瓊脂篩選，瓊脂內(nèi)預(yù)先加有50mg/l的卡那霉素，將鑒定為陽性的一個轉(zhuǎn)化子命名為DSM5715/pZlaccBC。表達(dá)質(zhì)粒pZlaccBC的限制性酶切圖譜見圖1。實施例2L-賴氨酸的制備菌株DSM5715/pZlaccBC首先在含有50μg/ml卡那霉素的CgIII完全培養(yǎng)基(Kase和Nakayama，農(nóng)業(yè)和生物化學(xué)36(9)1611-1621(1972))上預(yù)培養(yǎng)。為達(dá)到此目的，將10mlCgIII完全培養(yǎng)基加入100ml的有4個擋板的錐形瓶，接種種菌，30℃，每分鐘240轉(zhuǎn)培養(yǎng)16小時。測定預(yù)培養(yǎng)物660nm下的OD值(光密度)后用以接種含10ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的有4個擋板的100ml錐形瓶，接種后含有生產(chǎn)培養(yǎng)基的主培養(yǎng)物的OD值為0.1。Keilhauer等(微生物雜志1755595-5603(1993))描述的CgXII培養(yǎng)基被用作生產(chǎn)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中需加入4％的葡萄糖和50mg/l的卡那霉素硫酸鹽。接種后細(xì)胞的培養(yǎng)條件是33℃，80％的濕度，每分鐘250轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時。在僅僅使用菌株DSM5715的方法中，培養(yǎng)基中不含卡那霉素。最后，在660nm下測定光密度，使用Eppendorf-BioTronik公司(Hamburg，德國)的氨基酸分析儀通過離子交換層析，過柱后用水合茚三酮檢測的方法來確定產(chǎn)生的L-賴氨酸的濃度。實驗結(jié)果見表1。表1</tables>本說明書有以下附圖圖1質(zhì)粒pZlaccBC的圖譜。權(quán)利要求1.一種利用棒狀細(xì)菌發(fā)酵制備L-氨基酸的方法，其中所使用的細(xì)菌中編碼accBC基因的核苷酸序列或攜帶該基因的核苷酸序列被擴增，特別是過量表達(dá)。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所使用的細(xì)菌中所需L-氨基酸生物合成途徑中的其它基因也被擴增。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所使用的細(xì)菌中降低所需L-氨基酸的產(chǎn)生的代謝途徑至少被部分關(guān)閉。4.如前述權(quán)利要求的一項或幾項所述的方法，其中使用用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，該質(zhì)粒載體攜帶編碼accBC基因的核苷酸序列。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中使用用圖1所示的質(zhì)粒載體pZlaccBC轉(zhuǎn)化的、保藏于德意志微生物保藏中心的保藏號為DSM12786的谷氨酸棒桿菌。6.如前述權(quán)利要求的一項或幾項所述的方法，其中使用產(chǎn)生L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-高絲氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸的棒狀細(xì)菌。7.如權(quán)利要求1至5的一或多項所述的方法，其中使用產(chǎn)生L-賴氨酸的棒狀細(xì)菌。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因被同時過量表達(dá)。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中賦予S-(2-氨乙基)半胱氨酸抗性的DNA片段同時被擴增。10.如前述一或多項權(quán)利要求所述的發(fā)酵制備L-氨基酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L-氨基酸的細(xì)菌，該細(xì)菌中至少accBC基因被擴增，b)在培養(yǎng)基中或在細(xì)菌的細(xì)胞中富集所需L-氨基酸，c)分離所產(chǎn)生的氨基酸。全文摘要本發(fā)明提供了一種利用棒狀細(xì)菌發(fā)酵制備L－氨基酸的方法,在所使用的棒狀細(xì)菌中,編碼乙酰輔酶A羧化酶的攜帶生物素—羧基載體蛋白結(jié)構(gòu)域和生物素—羧化酶結(jié)構(gòu)域的亞基的核苷酸序列(accBC基因)被擴增,特別是過量表達(dá)。文檔編號C12N15/77GK1275622SQ0010931公開日2000年12月6日申請日期2000年5月19日優(yōu)先權(quán)日1999年5月27日發(fā)明者伊馮娜·蒂爾格,貝恩德·艾克曼斯,洛塔爾·埃格林,赫爾曼·扎姆,貝蒂娜·默克爾,瓦爾特·普費弗勒申請人:德古薩－于爾斯股份公司,于利希研究中心有限公司