專利名稱：一種無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
可溶性重組蛋白通過細(xì)菌類發(fā)酵方法高效表達(dá)已經(jīng)成為現(xiàn)代生物工程技術(shù)中生產(chǎn)生物蛋白的重要手段。在現(xiàn)代生物醫(yī)藥合成工業(yè)中，細(xì)菌類發(fā)酵法表達(dá)蛋白類生物醫(yī)藥分子，比如人源化治療性抗體片段，已經(jīng)在實際工業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。運用細(xì)菌類發(fā)酵方法生產(chǎn)可溶性蛋白的生產(chǎn)工藝中，在發(fā)酵結(jié)束后需要將細(xì)菌類產(chǎn)生的產(chǎn)物蛋白從發(fā)酵菌液中分離提純出來，形成產(chǎn)品。在分離提純產(chǎn)物蛋白的過程中，很大比例的產(chǎn)物蛋白會滯留于細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)空間中。有效釋放細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)空間中的外源可溶性蛋白，提高細(xì)菌類發(fā)酵法表達(dá)出來的可溶性蛋白的收集效率，成為提高相關(guān)生產(chǎn)工藝水平以及提高發(fā)酵生產(chǎn)效率的重要挑戰(zhàn)。世界范圍內(nèi)，研究人員對細(xì)菌類發(fā)酵制備重組蛋白工藝有著廣泛的嘗試，但在重組蛋白的生產(chǎn)效率的提高上遇到諸多困難。相關(guān)研究中，就有效釋放發(fā)酵細(xì)菌胞質(zhì)空間中的外源可溶性蛋白的問題有大量嘗試。例如運用超聲波震蕩方法；運用去污劑裂解的方法；以及在培養(yǎng)液中加入添加劑增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的方法等等?，F(xiàn)有技術(shù)中的這些方法的共同特點是將發(fā)酵菌的細(xì)胞破壞，從而釋放滯留于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的產(chǎn)物蛋白。破壞了的發(fā)酵菌在釋放產(chǎn)物蛋白的同時，也會釋放如核酸，糖類，脂類，膜蛋白等其他生物大分子，造成菌液粘度增加，影響產(chǎn)物蛋白的純化效率和純度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單，綜合生產(chǎn)成本較低的無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法，該方法可以在保持細(xì)菌細(xì)胞完整性，不對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行裂解操作的前提下，高效率的提取細(xì)菌發(fā)酵工藝過程中所表達(dá)的、滯留于細(xì)菌胞質(zhì)空間中的外源蛋白。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是一種無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法，包括如下步驟
I)制備緩沖液將乙二胺四乙酸鈉I. Ommol- 500mmol、尿素I. Omol- lO.Omol、鹿糖
0.Immol- 5mmol、Tris喊10-100mmol/L,均勻混合。加入蒸懼水至950ml,室溫下攬拌30min至液體澄清，使用Tris-Base或Tris-HCl緩沖體系調(diào)整溶液的pH值到5_8，繼續(xù)加入蒸餾水至1L, 12CTC高壓滅菌20min;
(2)將發(fā)酵細(xì)菌菌液高速離心10 - 60min，離心速度為6000- IOOOOg,離心溫度為4°C，留取上清液，用于下游純化；
(3)將離心沉積物，懸浮于緩沖液中形成混合液，將混合液在4-25°C下溫和攪拌5-60min, 24小時后，在4-20°C下，靜置I- 24h，備用；(4)將步驟(3)的發(fā)酵細(xì)菌菌液高速離心10-60min，離心速度為6000g - IOOOOg,4°C ;留取上清液體，合并步驟(2)中的上清液，作為合成蛋白產(chǎn)物進(jìn)行下游純化。在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述的緩沖液的組成為乙二胺四乙酸鈉I. Ommol-500mmol、尿素 I. Omol- 10. Omol、鹿糖 0. Immol- 5mmol、Tris 喊 IO-IOOmmol 和水 0. 9-1L。在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述的步驟(3 )中，沉積物與緩沖液的混合比例為1:5 -5:1。在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述的細(xì)菌為外源蛋白表達(dá)的革蘭氏陰性菌。在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述的細(xì)菌為大腸桿菌及其亞種。
本發(fā)明的有益效果是
I、本發(fā)明在保持細(xì)菌細(xì)胞完整性，不對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行裂解操作的前提下，高效率的提取細(xì)菌發(fā)酵工藝過程中所表達(dá)的、滯留于細(xì)菌胞質(zhì)空間中的外源蛋白，提高細(xì)菌類發(fā)酵制備重組蛋白的生產(chǎn)效率，同時降低單位外援蛋白生產(chǎn)過程中的原材料和時間成本，整個過程操作簡單易行，綜合成本低廉。2、使用本發(fā)明所提取的蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物能夠保持高度的生物活性和分子結(jié)構(gòu)的完整性，從而有利于產(chǎn)物被進(jìn)一步用于蛋白質(zhì)藥物、實驗室用試劑與試劑原料、以及醫(yī)療診斷用試劑與試劑原料。在重組蛋白微生物表達(dá)的工業(yè)化生產(chǎn)過程中有極其廣泛的應(yīng)用前
旦
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圖I是本發(fā)明提取的人蛋白激酶PKB酶活性檢測 圖2是本發(fā)明提取的人蛋白激酶PKB與裂解法提取人蛋白激酶PKB酶活性檢測對比
圖3是本發(fā)明提取的重組人源抗6-His多肽Fab抗體與裂解法提取的Fab抗體比濁度測試對比 圖4是本發(fā)明提取的重組人源抗6-His多肽Fab抗體與裂解法提取的Fab抗體比濁度測試對比圖。
具體實施例方式一種無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法，包括如下步驟
(1)制備緩沖液將乙二胺四乙酸鈉I.Ommol- 500mmol、尿素I. Omol- lO.Omol、鹿糖0. Immol- 5mmol、Tris喊10-100mmol/L,均勻混合。加入蒸懼水至950ml,室溫下攬拌30min至液體澄清，使用Tris-Base或Tris-HCl緩沖體系調(diào)整溶液的pH值到5_8，繼續(xù)加入蒸餾水至1L, 12CTC高壓滅菌20min;
(2)將發(fā)酵細(xì)菌菌液高速離心10- 60min，離心速度為6000- IOOOOg,離心溫度為4°C，留取上清液，用于下游純化；
(3)將離心沉積物，懸浮于緩沖液中形成混合液，將混合液在4-25°C下溫和攪拌5-60min, 24小時后，在4-20°C下，靜置I- 24h，備用；
(4)將步驟(3)的發(fā)酵細(xì)菌菌液高速離心10-60min，離心速度為6000g- IOOOOg,4°C ;留取上清液體，合并步驟(2)中的上清液，作為合成蛋白產(chǎn)物進(jìn)行下游純化。
在本發(fā)明中，所述的緩沖液的組成為乙二胺四乙酸鈉I. Ommol- 500mmol、尿素
1.Omol- 10. Omol、鹿糖 0. Immol- 5mmol、Tris 喊 IO-IOOmmol 和水 0. 9-1L ;所述的步驟
(3)中，沉積物與緩沖液的混合比例為1:5 -5:1 ;所述的細(xì)菌為外源蛋白表達(dá)的革蘭氏陰性菌，優(yōu)選為大腸桿菌及其亞種。實施例I重組人蛋白激酶PKB從發(fā)酵大腸桿菌中的高效提取。(I)制備緩沖液
配制含有乙二胺四乙酸鈉450mmol,尿素4mol,乳酸2. Ommol,朽1檬酸2. Ommol和鹿糖2. Ommol的蒸餾水溶液0. 95L，在室溫下攪拌30分鐘至液體澄清。使用Tris-Base或Tris-HCl緩沖體系調(diào)整pH值至7. 6后，加蒸餾水至I. OL, 120°C高壓滅菌20min此為緩沖液。(2)從菌液中獲得外源表達(dá)蛋白
將發(fā)酵細(xì)菌菌液高速離心10 - 60min，離心速度為6000- lOOOOg，離心溫度為4°C，留取上清液，用于下游純化；將離心沉積物，懸浮于緩沖液中形成菌液體積緩沖液體積=1. 1的混合液。，將混合液在4-25°C下溫和攪拌5- 60min, 24小時后，在4_20°C下，靜置I- 24h，在高速離心10-60min，離心速度為6000g - lOOOOg, 4°C ;留取上清液體，合并上清液，作為合成蛋白產(chǎn)物進(jìn)行下游純化。(2)外源表達(dá)蛋白的純化
采用陽離子交換預(yù)裝柱進(jìn)行純化。以IOOOOg的速度高速離心蛋白提取產(chǎn)物30分鐘，取上清對0. 02mM的PB柱透析過夜，隨后對蛋白溶液以12000rpm的速度在4°C離心30分鐘，再經(jīng)0. 22 ii m的濾膜過濾。每個CMM預(yù)裝離子交換柱使用0. OlmM PB緩沖液平衡，采用10倍體積0. 02mM的PB平衡柱子洗脫雜蛋白至A280檢測線與基線平行。使用精氨酸鹽緩沖液分步洗脫。同時檢測洗脫蛋白量(A280)收集各部分蛋白并在濃縮后通過激酶活性檢測，檢測顯示人蛋白激酶PKB催化活性良好(實驗結(jié)果見圖I)，與裂解法提取產(chǎn)物蛋白方法相比較，本方法提取的產(chǎn)物蛋白實測活性有較明顯提高(實驗結(jié)果見圖2)。
實施例2重組人源抗6 His多肽Fab抗體發(fā)酵大腸桿菌中的高效提取。(I)制備緩沖液
配制含有乙二胺四乙酸鈉500mmol/L,尿素4. 5mol/L,乳酸2. 0mmol/L,朽1檬酸
2.OmmoI/L和蔗糖2. OmmoI/L的蒸餾水溶液0. 95L，在室溫下攪拌30分鐘至液體澄清，使用Tris-Base或Tris-HCl緩沖體系pH值至7. 0后,加蒸懼水至1L。120°C高壓滅菌20min此為緩沖液。(2)從菌液中獲得外源表達(dá)蛋白
將發(fā)酵細(xì)菌菌液高速離心10 - 60min，離心速度為6000- lOOOOg, 4°C，留取上清液，用于下游純化；將離心沉積物，懸浮于緩沖液中形成菌液體積緩沖液體積=1. 1的混合液。，將混合液在4-25°C下溫和攪拌5- 60min, 24小時后，在4_20°C下，靜置l_24h，在高速離心10-60min，離心速度為6000g - lOOOOg, 4°C ;留取上清液體，合并上清液，作為合成蛋白產(chǎn)物進(jìn)行下游純化。(2)外源表達(dá)蛋白的純化
采用陽離子交換預(yù)裝柱進(jìn)行純化。以IOOOOg的速度高速離心蛋白提取產(chǎn)物30分鐘，取上清對0. 02mM的PB柱透析過夜，隨后對蛋白溶液以12000rpm的速度在4°C離心30分鐘，再經(jīng)0. 22 ii m的濾膜過濾。每個CMM預(yù)裝離子交換柱使用0. OlmM PB緩沖液平衡，采用10倍體積0. 02mM的PB平衡柱子洗脫雜蛋白至A280檢測線與基線平行。使用精氨酸鹽緩沖液分步洗脫。同時檢測洗脫蛋白量(A280)收集各部分蛋白并在濃縮后通過激酶活性檢測，檢測顯示人源抗6 His多肽Fab抗體活性良好(實驗結(jié)果見圖3)。與傳統(tǒng)細(xì)胞裂解液裂解提取產(chǎn)物蛋白方法相比較，本方法提取的產(chǎn)物蛋白實測抗體活性有提高(實驗結(jié)果見圖3)。實施例3重組抗GAPDH蛋白dAb抗體片段發(fā)酵大腸桿菌中的高效提取(I)制備緩沖液
配制含有乙二胺四乙酸鈉500mmol/L,尿素5mol/L,乳酸2. Ommol/L,朽1檬酸2. Ommol/L和蔗糖2. Ommol/L的蒸餾水溶液0. 95L，在室溫下攪拌30分鐘至液體澄清，使用Tris-Base或Tris-HCl緩沖體系調(diào)整pH值至6. 5后，加蒸餾水至1L。120°C高壓滅菌20min此為緩沖液。(2)從菌液中獲得外源表達(dá)蛋白
將發(fā)酵細(xì)菌菌液高速離心10 - 60min，離心速度為6000- lOOOOg, 4°C，留取上清液，用于下游純化；將離心沉積物，懸浮于緩沖液中形成菌液體積緩沖液體積=1. 1的混合液。，將混合液在4-25°C下溫和攪拌5- 60min, 24小時后，在4_20°C下，靜置24h，在高速離心10-60min，離心速度為6000g - lOOOOg, 4°C ;留取上清液體，合并上清液，作為合成蛋白產(chǎn)物進(jìn)行下游純化。(2)外源表達(dá)蛋白的純化
采用陽離子交換預(yù)裝柱進(jìn)行純化。以IOOOOg的速度高速離心蛋白提取產(chǎn)物30分鐘，取上清對0. 02mM的PB柱透析過夜，隨后對蛋白溶液以12000rpm的速度在4°C離心30分鐘，再經(jīng)0. 22 ii m的濾膜過濾。每個CMM預(yù)裝離子交換柱使用0. OlmM PB緩沖液平衡，采用10倍體積0. 02mM的PB平衡柱子洗脫雜蛋白至A280檢測線與基線平行。使用精氨酸鹽緩沖液分步洗脫。同時檢測洗脫蛋白量(A280)收集各部分蛋白并在濃縮后通過激酶活性檢測，檢測顯示抗GAPDH蛋白dAb抗體片段活性良好(實驗結(jié)果見圖4)。與傳統(tǒng)細(xì)胞裂解液裂解提取產(chǎn)物蛋白方法相比較，本方法提取的產(chǎn)物蛋白實測抗體活性有提高(實驗結(jié)果見圖4)。以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)制備緩沖液將乙二胺四乙酸鈉I.Ommol- 500mmol、尿素I. Omol- lO.Omol、鹿糖0.Immol- 5mmol、Tris 喊 10-100mmol/L,均勻混合。
2.加入蒸懼水至950ml,室溫下攪拌30min至液體澄清,使用Tris-Base或Tris-HCl緩沖體系調(diào)整溶液的PH值到5-8，繼續(xù)加入蒸餾水至1L，120°C高壓滅菌20min; (2)將發(fā)酵細(xì)菌菌液高速離心10- 60min，離心速度為6000- IOOOOg,離心溫度為4°C，留取上清液，用于下游純化； (3)將離心沉積物，懸浮于緩沖液中形成混合液，將混合液在4-25°C下溫和攪拌5-60min, 24小時后，在4-20°C下，靜置I- 24h，備用； (4)將步驟(3)的發(fā)酵細(xì)菌菌液高速離心10-60min，離心速度為6000g- IOOOOg,4°C ;留取上清液體，合并步驟(2)中的上清液，作為合成蛋白產(chǎn)物進(jìn)行下游純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法，其特征在于，所述的緩沖液的組成為乙二胺四乙酸鈉I. Ommol- 500mmol、尿素I. Omol-10.0!1101、鹿糖0. Immol- 5mmol、Tris 喊 IO-IOOmmol 和水 0. 9-1L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中，沉積物與緩沖液的混合比例為1:5 -5:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法，其特征在于，所述的細(xì)菌為外源蛋白表達(dá)的革蘭氏陰性菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法，其特征在于，所述的細(xì)菌為大腸桿菌及其亞種。
全文摘要
本發(fā)明公開一種無需裂解高效提取發(fā)酵細(xì)菌中外源表達(dá)蛋白的方法，將發(fā)酵細(xì)菌菌液離心10-60min，離心速度為6000-10000g，離心溫度為4℃，留取上清液；將離心沉積物懸浮于緩沖液中形成混合液，將混合液在4-25℃下溫和攪拌5-60min, 24小時后，在4-20℃下，靜置1-24h；最后將得到發(fā)酵細(xì)菌菌液離心10-60min，離心速度為6000g-10000g，離心溫度為4℃；留取上清液體，合并上清液，作為合成蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明在不對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行裂解操作的前提下，高效提取細(xì)菌發(fā)酵工藝過程中所表達(dá)、滯留于細(xì)菌胞質(zhì)空間中的外源蛋白，使用材料成分簡單，操作過程簡潔，綜合生產(chǎn)成本低。
文檔編號C07K1/14GK102617703SQ20121007044
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月14日
發(fā)明者劉冰, 張芃芃, 楊冬, 楊艷坤, 龍泉 申請人:拜明(蘇州)生物技術(shù)有限公司