專利名稱：一種卡介苗表達載體及其構建的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及表達載體，特征是涉及卡介苗表達載體。
背景技術：
卡介苗(Mycobacterium bovis bacilli Calmette Geurin，BCG)是世界衛(wèi)生組織推薦的結核病預防用減毒活疫苗，其生產、制備和在臨床應用的技術已相當成熟。從1921年發(fā)明到目前，全世界已有35億人接種卡介苗，并證明是安全的。卡介苗免疫機體后，既刺激機體產生體液免疫應答，又可以誘導以CD4T淋巴細胞為主的細胞免疫應答。已有上100種的外源蛋白質或細胞因子在卡介苗中得以表達(Ohara N，et al.Vaccine，2001，194089-4098)，并將表達外源基因的重組卡介苗用于多種類型感染性疾病、腫瘤、變態(tài)反應性疾病等的預防和治療，具有極為廣闊的應用前景。
卡介苗表達系統(tǒng)包括胞內表達、胞膜表達和分泌表達三種方式。由于卡介苗是胞內寄生菌，其被巨噬細胞吞噬后，形成吞噬體，并在其中生長繁殖。卡介苗分泌產生的蛋白質抗原，被認為是經MHCI類分子途徑，遞呈給CD8T淋巴細胞，誘導產生CD8T淋巴細胞免疫反應；卡介苗胞膜或胞內的抗原，是經MHCII類分子途徑，遞呈給CD4T淋巴細胞，誘導產生CD4T淋巴細胞免疫反應。因此將外源基因在卡介苗中分泌表達建立的重組卡介苗菌株，既可刺激機體產生體液免疫應答，更重要的是，可同時產生CD4和CD8T淋巴細胞介導的細胞免疫反應，可特異性用于針對需要上述保護性免疫反應的傳染病如結核病、AIDS(Aldovini A，etal.Nature(London)1991，351479-482)以及腫瘤(Yamada H，et al.J.Urol.2000，16452-531)等的防治，具有重要的實際應用價值。蛋白質的分泌需要有信號肽的參與。分枝桿菌種屬特異性的限制，僅分枝桿菌自身蛋白的信號肽才能被卡介苗識別，已有M.kansasii或卡介苗α抗原(Lagranderie M，et al.J.Virol.1997，712303-2309；Gheorghiu M，et al.InfectImmun.1994，624287-4295.)、結核分枝桿菌抗原85A(Kremer L，et al.InfectImmun.1998，665669-5676.)、M.fortuitum β-lactamse(Langermann S，et al.Nature(London)1994，372552-555)、結核分枝桿菌抗原19kDa(Edelmana R，et al.Vaccine 1999，171272-1281)等成功用于引導外源基因的分泌表達。由于結核分枝桿菌在體外培養(yǎng)過程中產生的培養(yǎng)濾液蛋白，其主要的成分是抗原85B(Ag85B)(Belisle JT，et al.Science 1997，2761420-1422；)，并且Ag85B的信號肽序列已被克隆和證實(Harth G，etal.Infect Immun.1997，652321-2328)，相對于其他基因的信號肽具有明顯優(yōu)勢，更能正確引導外源基因的分泌。分枝桿菌表達載體的種類很多，其中pSMT3是國內外廣泛使用并被證實可靠的一種大腸桿菌-分枝桿菌穿梭細胞內表達載體(Harth G，etal.InfectImmun.1997，652321-2328；Golanska E，et al.Acta Microbiol Pol.1998；47335-343；He A，et al.Protein Expr.Purif.2004，35171-180)，其篩選標志為潮霉素(Hygromycin)抗性，可避免通常使用的氨芐青霉素或卡那霉素抗性在人體應用時可能出現(xiàn)的副作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠使外源基因在卡介苗中正確分泌表達的卡介苗表達載體，它是以大腸桿菌-分枝桿菌穿梭細胞內表達載體pSMT3為基礎，利用結核分枝桿菌主要分泌抗原Ag85B的信號肽序列引導外源基因的分泌表達。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達載體，本專利申請將其稱為pDAF。
pDAF包括大腸桿菌復制起始點(Col E1 origin)、潮霉素(Hygromycin)抗性基因、分枝桿菌復制起始點(pAL5000 origin)、多克隆位點區(qū)(MCS)、結核分枝桿菌主要分泌抗原Ag85B的信號肽和卡介苗熱休克蛋白Hsp60的啟動子。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達載體，含有大腸桿菌復制起始點(Col E1origin)、分枝桿菌復制起始點(pAL5000origin，來源于M.fortuitum)和潮霉素(Hygromycin)抗性基因(來源于Streptomyces hygroscopicus)。Col E1 origin可使載體在大腸桿菌中復制、增殖、表達載體構建和保存；pAL5000origin可使載體在卡介苗中復制、增殖，以及外源基因在卡介苗中表達；潮霉素抗性基因可使該載體轉化的大腸桿菌或卡介苗對潮霉素產生抗性，用于重組轉化菌的篩選。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達載體，以卡介苗熱休克蛋白Hsp60的啟動子為誘導型啟動子，受溫度控制，溫度在37℃或42到45℃誘導后才開始轉錄，翻譯。37℃非常適合于外源基因在體內的表達；42-45℃適合于外源基因在體外的表達。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達載體的多克隆位點區(qū)(MCS)包括BamHI、PstI、EcoRV、HindIII和ClaI酶切位點。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達載體包含有序列表中序列1的核苷酸序列，該核苷酸序列為本發(fā)明卡介苗表達載體在構建中插入的片段，該插入片段包括Hsp60啟動子(pHsp60)、抗原85B的信號肽序列(ag85B sp)和多克隆位點區(qū)，該該插入片段的核苷酸序列如下TCT AGA CGG TGA CCA CAA CGC GCC CGC TTT GAT CGG GGA CGT CTG CGG CCGACC ATT TAC GGG TCT TGT TGT CGT TGG CGG TCA TGG GCC GAA CAT ACT CACCCG GAT CGG AGG GCC GAG GAC AAG GTC GAA CGA GGG GCA TGA CCC GGT GCG
GGG CTT CTT GCA CTC GGC ATA GGC GAG TGC TAA GAA TAA CGT TGG CAC TCGCGA CCG GTG AGT GCT AGG TCG GGA CGG TGA GGC CAG GCC CGT CGT CGC AGCGAG TGG CAG CGA GGA CAA CTT GAG CCG TCC GTC GCG GGC ACT GCG CCC GGCCAG CGT AAG TAG CGG GGT TGC CGT CAC CCG GTG ACC CCC GTT TCA TCC CCGATC CGG AGG AAT CAC TTC GCA ATG GCC ACA GAC GTG AGC CGA AAG ATT CGA GCT TGGGGA CGC CGA TTG ATG ATC GGC ACG GCA GCG GCT GTA GTC CTT CCG GGC CTG GTG GGG CTTGCC GGC GGA GCG GCA ACT GCG GGC GCG GGA TCC CCC GGG CTG CAG GAT TCG ATA TCA AGCTTA以上序列中加粗的黑體區(qū)域表示Ag85sp所在區(qū)域，從379位A起始，到501位G，全長123bp，可引導外源基因的分泌表達。在表達的過程中，該信號肽段被從表達產物的N端切除。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達載體的構建一、材料和方法載體pUC19和大腸桿菌DH5α，按標準常規(guī)方法保存。
大腸桿菌分枝桿菌穿梭表達質粒pSMT3由英國Imperial College School ofMedicine，Dr.Young DB提供，按標準方法轉化大腸桿菌DH5α后，常規(guī)方法保存。
人工合成結核分枝桿菌H37Rv的抗原Ag85B的信號肽序列以及酶切位點讀框并克隆于載體pMD18-T-85Bsp由上海生物工程公司合成。
結核分枝桿菌H37Rv菌株購自北京中國生物制品檢定所，保存于改良羅氏培養(yǎng)基。
分泌表達外源基因人細胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白的卡介苗表達質粒pDIE由發(fā)明人構建(Fan X，et al.Chin.Med.J(Engl.).2005，118762-765)。
膠回收和質粒純化試劑盒、限制性內切酶和DNAMarker等購自大連寶生物公司。
7H9、7H10和ADC營養(yǎng)基質購自Difico公司。
潮霉素購自Invitrogen公司。BCG購自成都生物制品所產品。
其余試劑為國產分析純。
序列測定由上海基康公司完成。
載體的構建和表達證實等具體操作方法采用標準方法，參見《分子克隆實驗指南第三版》(2002，科學出版社出版)，具體方法如下。
二、本發(fā)明載體構建包括以下步驟(1)人工合成結核分枝桿菌H37Rv的主要分泌抗原Ag85B的信號肽序列以及酶切位點讀框并克隆于載體pMD18-T(即pMD18-T-85Bsp)。由上海生物工程公司合成。
(2)HindIII和BalI酶切消化pMD18-T-85Bsp后，用膠回收試劑盒按照說明書回收約150bp的小片段(見圖1第2電泳道)，與同樣酶切消化后的載體pSMT3的膠回收，按3∶1分子比，16度連接12-16h，低溫CaCl2法轉化大腸桿菌DH5α，涂布普通LB瓊脂平板(含潮霉素50μg/ml)，篩選陽性克隆，提取質粒，大小在5.8kb，陽性命名為pDAF(見圖4)。
驗證以XbaI和HindIII酶切pDAF，酶切產生約5.1kb和540bp的小片段，酶切鑒定正確(見圖4)?；厥占s540bp的小片段(見圖4)，與同樣酶切的載體pUC19連接，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并命名為pUCXH。pUCXH用XbaI和HindIII酶切，酶切鑒定正確(見圖1第1電泳道)后，由上?；倒緶y序，序列測定也表明序列是正確的。序列測定圖見圖2和圖3，圖2為正向測序圖，圖3為反向測序圖。
所構建的表達載體pDAF的結構示意圖見圖5。
本發(fā)明載體分泌表達外源基因人細胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白采用標準的基因工程技術，利用本發(fā)明的載體，將IL-2和ESAT-6融合蛋白編碼克隆入pDAF對應的讀框，建立表達載體pDIE。將卡介苗在7H9中大量培養(yǎng)2w后，按1∶100的比例轉接，培養(yǎng)至21d時，加入2M的甘氨酸(V/V＝10％)，繼續(xù)培養(yǎng)2d，冰浴1h，10,000轉離心5min，收集細菌，用10％的甘油洗滌三次后，分裝置-70℃保存作為卡介苗感受態(tài)。將pDIE電穿孔法導入用冰冷的10％(v/v)甘油制備的5×106個卡介苗感受態(tài)細胞，卡介苗中進行分泌表達，電穿參數(shù)為0.4cm的電穿孔杯，電壓2.5KV，電容25μF，電阻1000Ω。37℃培養(yǎng)24h后涂布于含ADC和潮霉素的7H10平板中，設空白質粒作為對照，37℃培養(yǎng)28～30d。結果在培養(yǎng)上清中利用SDS-PAGE和Western blotting證實有融合蛋白的表達，見圖6。


圖1為本發(fā)明涉及的載體pMD18-T-85Bsp和pUCXH的酶切鑒定，圖中數(shù)字1對應的部分為質粒pUCXH用XbaI+HindIII酶切產生預期大約3000bp和540bp的兩個片段；圖中數(shù)字2對應的部分為質粒pMD18-T-85Bsp用BalI+HindIII酶切產生預期大約2500bp和150bp的兩個片段。
圖2為本發(fā)明的表達載體特征區(qū)的正向測序圖。
圖3為本發(fā)明的表達載體特征區(qū)的反向測序圖。
圖4為本發(fā)明的表達載體pDAF的酶切鑒定圖，圖中M表示的是DNA分子量標準，泳道1表示的本發(fā)明表達載體pDAF，泳道2表示的是本發(fā)明表達載體pDAF用XbaI和HindIII酶切后，產生預期大小為5.1kbp和540bp兩個片段。
圖5為本發(fā)明的表達載體pDAF的結構示意圖。
圖6為建立在本發(fā)明表達載體pDAF的外源基因IL-2和ESAT-6的表達質粒pDIE在卡介苗中分泌表達融合蛋白的鑒定，證實了表達的融合蛋白并分泌，主要存在于卡介苗的培養(yǎng)上清中。圖中A所示部分表示融合蛋白在BCG中表達，42度誘導2小時，收集培養(yǎng)濾液蛋白的上清，進行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，結果為泳道1表示的pDIE轉化的BCG的表達上清，泳道2表示的是原始BCG的上清，M表示蛋白質分子量標準，箭頭表示泳道1出現(xiàn)了預期的21kDa融合蛋白的表達。圖中B部分表示融合蛋白在BCG中表達，收集培養(yǎng)濾液蛋白的上清，進行SDS-PAGE后，用ESAT-6或抗人IL-2抗體進行免疫印跡實驗(Western blotting)。泳道3表示pDIE轉化的BCG的表達上清，在相應21kDa部位出現(xiàn)了條帶，見箭頭所示；泳道4表示原始BCG的上清，在相應部位未見該條帶。
具體實施例方式
實施例1構建本發(fā)明表達載體材料和方法載體pUC19和大腸桿菌DH5α，按標準常規(guī)方法保存。大腸桿菌分枝桿菌穿梭表達質粒pSMT3由英國Imperial College School of Medicine，Dr.YoungDB提供，按標準方法轉化大腸桿菌DH5α后，常規(guī)方法保存。人工合成結核分枝桿菌H37Rv的抗原Ag85B的信號肽序列以及酶切位點讀框并克隆于載體pMD18-T-85Bsp由上海生物工程公司合成。結核分枝桿菌H37Rv菌株購自北京中國生物制品檢定所，保存于改良羅氏培養(yǎng)基。分泌表達外源基因人細胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白的卡介苗表達質粒pDIE由發(fā)明人構建(Fan X，et al.Chin.Med.J(Engl.).2005，118762-765)。膠回收和質粒純化試劑盒、限制性內切酶和DNA Marker等購自大連寶生物公司。7H9、7H10和ADC營養(yǎng)基質購自Difico公司。潮霉素購自Invitrogen公司。BCG購自成都生物制品所產品。其余試劑為國產分析純。序列測定由上?；倒就瓿?。載體的構建和表達證實等具體操作方法采用標準方法，參見《分子克隆實驗指南第三版》(2002，科學出版社出版)。具體方法和實施例如下構建步驟(1)人工合成結核分枝桿菌H37Rv的主要分泌抗原Ag85B的信號肽序列以及酶切位點讀框并克隆于載體pMD18-T，即pMD18-T-85Bsp。由由上海生物工程公司合成。
(2)HindIII和BalI酶切消化pMD18-T-85Bsp后，用膠回收試劑盒按照說明書回收約150bp的小片段，見圖1第2電泳道，與同樣酶切消化后的載體pSMT3的膠回收，按3∶1分子比，16度連接12-16h，低溫CaCl2法轉化大腸桿菌DH5α，涂布普通LB瓊脂平板，含潮霉素50μg/ml，篩選陽性克隆，提取質粒，大小在5.8kb，陽性命名為pDAF，見圖4。
(3)以XbaI和HindIII酶切pDAF，酶切產生約5.1kb和540bp的小片段，酶切鑒定正確(見圖3)。回收約540bp的小片段，見圖4，與同樣酶切的載體pUC19連接，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并命名為pUCXH。
(4)pUCXH用XbaI和HindIII酶切，酶切鑒定正確(見圖1第1電泳道)后，由上?；倒緶y序，序列測定也表明序列是正確的。序列測定圖見圖2和圖3，圖2為正向測序圖，圖3為反向測序圖。
所構建的表達載體pDAF的結構示意圖如圖5所示。
實施例2本發(fā)明載體分泌表達外源基因人細胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白采用標準的基因工程技術，利用本發(fā)明的載體，將IL-2和ESAT-6融合蛋白編碼克隆入pDAF對應的讀框，建立表達載體pDIE。將卡介苗在7H9中大量培養(yǎng)2w后，按1∶100的比例轉接，培養(yǎng)至21d時，加入2M的甘氨酸(V/V＝10％)，繼續(xù)培養(yǎng)2d，冰浴1h，10,000轉離心5min，收集細菌，用10％的甘油洗滌三次后，分裝置-70℃保存作為卡介苗感受態(tài)。將pDIE電穿孔法導入用冰冷的10％(v/v)甘油制備的5×106個卡介苗感受態(tài)細胞，卡介苗中進行分泌表達，電穿參數(shù)為0.4cm的電穿孔杯，電壓2.5KV，電容25μF，電阻1000Ω。37℃培養(yǎng)24h后涂布于含ADC和潮霉素的7H10平板中，設空白質粒作為對照，37℃培養(yǎng)28～30d。結果在培養(yǎng)上清中利用SDS-PAGE和Western blotting證實有融合蛋白的表達，見圖6。
以下為序列表。
序列表<110>華中科技大學<120>一種卡介苗表達載體及其構建<130>1<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>537<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(379)..(501)<223>
<400>1tctagacggt gaccacaacg cgcccgcttt gatcggggac gtctgcggcc gaccatttac60gggtcttgtt gtcgttggcg gtcatgggcc gaacatactc acccggatcg gagggccgag120gacaaggtcg aacgaggggc atgacccggt gcggggcttc ttgcactcgg cataggcgag180tgctaagaat aacgttggca ctcgcgaccg gtgagtgcta ggtcgggacg gtgaggccag240gcccgtcgtc gcagcgagtg gcagcgagga caacttgagc cgtccgtcgc gggcactgcg300cccggccagc gtaagtagcg gggttgccgt cacccggtga cccccgtttc atccccgatc360cggaggaatc acttcgca atg gcc aca gac gtg agc cga aag att cga gct 411Met Ala Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala1 5 10tgg gga cgc cga ttg atg atc ggc acg gca gcg gct gta gtc ctt ccg 459Trp Gly Arg Arg Leu Met Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro15 20 25ggc ctg gtg ggg ctt gcc ggc gga gcg gca act gcg ggc gcg 501Gly Leu Val Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala30 35 40ggatcccccg ggctgcagga ttcgatatca agctta 537<210>2<211>41<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Ala Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu1 5 10 15
Met Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu20 25 30Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala35 40
權利要求
1.一種卡介苗表達載體，包括宿主復制起始點、抗性基因和分枝桿菌復制起始點pAL5000 origin，其特征在于包含有由卡介苗熱休克蛋白Hsp60啟動子、結核分枝桿菌抗原Ag85B的信號肽和多克隆位點區(qū)MCS組成的卡介苗內表達區(qū)，該卡介苗內表達區(qū)具有序列表中序列1的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的卡介苗表達載體，其特征在于所述的宿主復制起點為大腸桿菌復制起始點Col E1 origin。
3.根據權利要求1所述的卡介苗表達載體，其特征在于所述的抗性基因為潮霉素Hygromycin抗性基因。
4.根據權利要求1所述的卡介苗表達載體，其特征在于多克隆位點區(qū)MCS包括BamHI、PstI、EcoRV、HindIII和/或ClaI酶切位點。
5.一種卡介苗表達載體的構建方法，包括以下步驟a.人工合成結核分枝桿菌H37Rv的主要分泌抗原Ag85B的信號肽序列以及酶切位點讀框并克隆于載體pMD18-T，得pMD18-T-85Bsp；b.HindIII和BalI酶切消化pMD18-T-85Bsp后，用膠回收試劑盒按照說明書回收約150bp的小片段，與同樣酶切消化后的載體pSMT3的膠回收，按3∶1分子比，16度連接12-16h，低溫CaCl2法轉化大腸桿菌DH5α，涂布普通LB瓊脂平板，含潮霉素50μg/ml，篩選陽性克隆，提取質粒，大小在5.8kb，得本發(fā)明卡介苗表達載體pDAF。
6.權利要求1所述的卡介苗表達載體在生產重組蛋白質中的應用。
7.權利要求1所述的卡介苗表達載體在制藥中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種卡介苗表達載體，由大腸桿菌復制起始點Col E1 origin、潮霉素Hygromycin抗性基因和分枝桿菌復制起始點pAL5000 origin、卡介苗熱休克蛋白Hsp60啟動子、結核分枝桿菌抗原Ag85B的信號肽和多克隆位點區(qū)MCS構成，它能夠使外源基因在卡介苗中正確分泌表達，利用本發(fā)明載體，能夠將外源基因導入卡介苗中分泌表達，用于生產制備重組卡介苗或表達外源蛋白質。
文檔編號C12N15/09GK1966689SQ20051001980
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月15日 優(yōu)先權日2005年11月15日
發(fā)明者范雄林, 高倩 申請人:華中科技大學