專利名稱：一種生產(chǎn)重組人tPA的工程菌株及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種大腸桿菌工程菌株，同時(shí)涉及工程菌株的制備方法。該菌株可以產(chǎn)生重組突變tPA蛋白，可以用于臨床上治療急性心肌梗塞、腦血栓、肺栓塞等疾病，在醫(yī)學(xué)上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
人tPA是人的組織型纖溶酶原激活劑(tissue type plasminogen activator，tPA)，是一種絲氨酸蛋白酶。它含527個(gè)氨基酸，分子量68KD，能把無活性的纖溶酶原激活成為纖溶酶而發(fā)揮溶血栓作用，已在臨床上用于急性心肌梗塞、腦血栓中風(fēng)、肺栓塞等溶栓治療，是目前國際上優(yōu)良的溶栓藥物，具有溶栓快，安全性高，愈后致殘率低，對(duì)人無抗原性等優(yōu)點(diǎn)。
tPA主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分泌，血漿中濃度很低，約為5ng/ml，半衰期約5分鐘，因此從血漿或組織中直接提取tPA不可能用于生產(chǎn)，只能采用基因工程技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。1987年，美國率先批準(zhǔn)第一個(gè)基因工程技術(shù)生產(chǎn)的rtPA用于臨床治療急性心肌梗塞，商品名為阿克伐司(Activase)，該產(chǎn)品屬于全長的原始tPA，屬tPA第一代產(chǎn)品，顯著缺點(diǎn)是半衰期短(3-6分鐘)，活性低，對(duì)病人血漿中較高濃度的tPA抑制物PAI無抗性，因而使用劑量極大，每支針含tPA 150-200mg，每支針的價(jià)格也十分昂貴。
為了解決原始tPA存在的問題，在tPA結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)上，研究人員進(jìn)一步對(duì)tPA進(jìn)行氨基酸缺失和替換變異研究。tPA在結(jié)構(gòu)上可劃分為F區(qū)(手指區(qū)結(jié)構(gòu)域，4-49aa)、E區(qū)(生長因子功能域，50-86aa)、K1區(qū)(kringle 1，87-175aa)、K2區(qū)(kringle 2，176-261aa)和P區(qū)(蛋白酶區(qū)，262-527aa)五個(gè)獨(dú)立的功能結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域的命名和編號(hào)根據(jù)基因庫Genbank登錄號(hào)碼GI137119或文獻(xiàn)Pennica D.et al.Nature 301214，1983)。t-PA的各個(gè)特定結(jié)構(gòu)域與t-PA各種生物學(xué)活性之間的關(guān)系已闡明，F(xiàn)區(qū)和K2區(qū)均能特異性結(jié)合于纖維蛋白凝塊，K1區(qū)與肝臟受體結(jié)合有關(guān)，P區(qū)上含絲氨酸蛋白酶，負(fù)責(zé)將纖維酶原切割成纖維酶，其上含有tPA活性抑制物PAI的結(jié)合位點(diǎn)(aa296-299)。tPA中任何一個(gè)區(qū)的缺失或變異不影響其它區(qū)域的結(jié)構(gòu)和活性，這為tPA的重組、改造(稱之為tPA突變體)提供了基礎(chǔ)。美國、德國、日本、英國等國家都在研究通過重組和變異改善tPA的性能，并擁有各自的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，如德國寶麗曼(Boehringer Mannheim)公司開發(fā)的瑞替普酶(Reteplase，rPA)、美國基因泰克(Genentech)公司開發(fā)的TNK酶(Tenecteplase)、美國布里斯托爾-邁爾斯普博(Bristol-MyersSpuibb)公司開發(fā)的nPA酶(Lanoteplase)、日本衛(wèi)材(Eisai)筑波研究所開發(fā)的孟替普酶(Monteplase)等。瑞替普酶(Reteplase)是一種用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)的重組tPA產(chǎn)品，由K2P兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)組成，缺失F、E、K1三個(gè)區(qū)域，含355個(gè)氨基酸(Kohnert U，et al.Protein Engineering 593，1992，專利號(hào)EP 0 382 174 A1)。其性質(zhì)與天然tPA分子有了較大改變，穩(wěn)定性得到提高，半衰期提高為15-18分鐘，但是與纖維蛋白的親和力有較大下降，它與纖維蛋白的結(jié)合為可逆結(jié)合，結(jié)合能力大大低于天然tPA，并且瑞替普酶結(jié)構(gòu)中仍含有tPA活性抑制物PAI的結(jié)合位點(diǎn)，體外試驗(yàn)顯示5IU/ml的PAI-1就能使5ng/ml的瑞替普酶失活。其比活性為5×105IU/mg，使用劑量20-40mg，制劑在2℃保存有效期2年，溶解后穩(wěn)定性差，臨床上要求在4小時(shí)內(nèi)使用。TNK酶是一種用中國倉鼠細(xì)胞(CHO)生產(chǎn)的全長tPA，含527個(gè)氨基酸，在三個(gè)位置共6個(gè)氨基酸發(fā)生替換變異，即K1區(qū)的Thr103和Asn117分別被Asn和Glu取代，P區(qū)的Lys296-His-Arg-Arg299被4個(gè)Ala取代。和原始t-PA相比，TNK酶體外抗PAI的活性提高80倍，半衰期延長4倍，在體內(nèi)活性只有原始tPA的82％，結(jié)合纖維蛋白能力保留87％(Keyt.B.A.et al.PNAS、USA、913670，1994)。臨床上TNK酶使用劑量還是比較大，每針含量達(dá)50mg。孟替普酶是一種由田鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)的全長tPA，含527個(gè)氨基酸，將E區(qū)的Cys84置換為Ser，其作用效果與t-PA相似，激活纖溶酶原的能力在纖維蛋白存在時(shí)比纖維蛋白沒有時(shí)強(qiáng)14.9倍，但其與纖維蛋白結(jié)合率約為原始t-PA的1/3，使其對(duì)血栓部位特異性有所下降。以上三種tPA突變體均已上市，另外還有一種正待美國食品及藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的tPA突變體nPA酶(Lanoteplase)，缺失了F、E區(qū)，并修飾了K1區(qū)的糖基化位點(diǎn)，與原始t-PA相比，其半衰期延長37min，并改善了溶栓活性，但降低了對(duì)纖維蛋白的親和力，而且引起的顱內(nèi)出血率高于t-PA。盡管各種tPA突變體在不同的方面改善tPA的性能，但第二代重組tPA仍存在著熱穩(wěn)定性差，特異性不高、使用劑量大以及生產(chǎn)成本高的問題。
目前用于生產(chǎn)tPA的表達(dá)系統(tǒng)主要是動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。最先用于生產(chǎn)治療用tPA的細(xì)胞系統(tǒng)是黑色素瘤細(xì)胞(Griffiths，JB.et al.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.1987，34147-166)。在隨后一系列已經(jīng)上市和即將上市的tPA衍生物產(chǎn)品中，大多也是采用動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)，如美國基因泰克(Genentech)公司開發(fā)的TNK酶(Tenecteplase)、美國布里斯托爾-邁爾斯普博(Bristol-MyersSpuibb)公司開發(fā)的nPA酶(Lanoteplase)，是用中國倉鼠細(xì)胞(CHO)生產(chǎn)，日本衛(wèi)材(Eisai)筑波研究所開發(fā)的孟替普酶(Monteplase)是用田鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)。由于真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)存在細(xì)胞生長速度慢、生產(chǎn)tPA的產(chǎn)量低、培養(yǎng)基成分昂貴、培養(yǎng)條件要求高等特點(diǎn)，造成tPA生產(chǎn)成本很高，致使tPA產(chǎn)品價(jià)格居高不下，病人經(jīng)濟(jì)上難以承受。
大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)系統(tǒng)由于其操作簡便、生產(chǎn)成本低廉，成為大多數(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)研究和生產(chǎn)的首選宿主細(xì)胞。采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)治療用tPA在tPA藥物研究的早期即受到研究人員關(guān)注并獲得成功(Harris TJ et al.Mol.Biol.Med.1986，3279-292；Datar RV.et al.Biotechnology.1993，11349-357)，目前上市的tPA產(chǎn)品中，由德國寶麗曼(Boehringer Mannheim)公司開發(fā)的瑞替普酶(Reteplase，rPA)即是由大腸桿菌菌株K12生產(chǎn)，但需要共轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒來表達(dá)重組tPA。本發(fā)明利用大腸桿菌BL21(DE3)獲得一種大腸桿菌工程菌株BL21(DE3)/rtPAm-1，可以高效表達(dá)新型重組變異tPA蛋白(rtPAm-1)，且遺傳穩(wěn)定，傳代30次以上仍保持較高的tPA產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)重組人tPA的大腸桿菌菌株。該菌株產(chǎn)生的重組tPA具有分子量小、活性強(qiáng)、半衰期長、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，可以用于臨床上治療急性心肌梗塞、腦血栓、肺栓塞等疾病，在醫(yī)學(xué)上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備生產(chǎn)重組人tPA的大腸桿菌菌株的方法，方法簡便，易于操作。
該大腸桿菌工程菌株命名為BL21(DE3)/rtPAm-1，菌株已提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2005年10月09日，保藏編號(hào)為CCTCC M205112，分類命名Escherichia coli BL21(DE3)/rtPAm-1。其細(xì)胞中含有重組質(zhì)粒pETrtPAm-1，質(zhì)粒中含有SEQ ID NO.1.所述的重組突變?nèi)藅PA基因序列。大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1由以下步驟制備1.質(zhì)粒pETrtPAm-1的構(gòu)建(1)用PCR方法分別擴(kuò)增出tPA基因的FE片段和P片段。
(2)用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI切割FE片段，用內(nèi)切酶KpnI和HindIII切割P片段，用內(nèi)切酶BamHI和HindIII切割pQE30質(zhì)粒(pQE30質(zhì)粒購自QIAGEN公司)，用T4連接酶進(jìn)行三片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQErtPAm-1，其上含有重組tPA基因，由原始tPA基因的F、E、P區(qū)組成。
(3)設(shè)計(jì)兩條誘變引物，采用PCR定點(diǎn)突變法在重組tPA基因上把原始tPA分子R298、R299編碼處都突變?yōu)镋編碼。
(4)對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pET-His(質(zhì)粒pET-His購自基因動(dòng)力實(shí)驗(yàn)室有限公司)進(jìn)行改造。利用pET-His質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用BamHI和HindIII切割擴(kuò)增產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)生的1.1kb變異tPA基因用內(nèi)切酶BamHI和HindIII切割，用T4連接酶連接兩片段，獲得重組質(zhì)粒pETrtPAm-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得大腸桿菌菌株DH5αrtPAm-1。
(5)鑒定重組質(zhì)粒pETrtPAm-1用雙酶切、PCR方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行初步鑒定，再經(jīng)過DNA測序進(jìn)行最終確定。
2.培養(yǎng)大腸桿菌菌株DH5αrtPAm-1，提取重組質(zhì)粒pETrtPAm-1。
3.冷CaCl2法制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞4.將重組質(zhì)粒pETrtPAm-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選和鑒定獲得大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1。
本發(fā)明所得的大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1具有如下特點(diǎn)1.本發(fā)明所用大腸桿菌菌株BL21(DE3)，購自基因動(dòng)力實(shí)驗(yàn)室有限公司，其基因型為F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal(λcI 857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7genel)dcm(DE3)。BL21是表達(dá)蛋白質(zhì)應(yīng)用最廣的宿主細(xì)菌來源，它的優(yōu)點(diǎn)在于缺失lon和ompT蛋白酶，利于外源基因表達(dá)蛋白質(zhì)。BL21(DE3)是λDE3溶原菌，DE3上帶有T7 RNA聚合酶基因，T7 RNA聚合酶基因由lacUV5啟動(dòng)子控制，未誘導(dǎo)時(shí)便有一定程度轉(zhuǎn)錄，表達(dá)目標(biāo)蛋白，在有誘導(dǎo)物異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)存在的條件下，可以大量產(chǎn)生T7 RNA聚合酶，從而使目標(biāo)蛋白得到高水平表達(dá)。
2.對(duì)氨芐青霉素(Amp)有抗性，能在LB-Amp平板上生長，在平板上呈直徑大小1～2mm的典型大腸桿菌菌落。菌落呈圓形隆起，平均直徑為1.6mm，外表濕潤光滑、白色。光學(xué)顯微鏡下菌體為短桿狀，形態(tài)均勻一致。
3.在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的條件下，可以高效表達(dá)新型重組人tPA(rtPAm-1)。表達(dá)的rtPAm-1蛋白分子量約為38kD，在胞內(nèi)形成無活性的包涵體，表達(dá)水平達(dá)到細(xì)胞蛋白總量的30％以上。
4.傳代次數(shù)在30次以上，遺傳穩(wěn)定，產(chǎn)量穩(wěn)定。
5.其表達(dá)的重組tPA蛋白，不同于現(xiàn)有的其它重組人tPA(如rt-PA、TNK酶、瑞替普酶reteplase等)。該重組人tPA由天然tPA的F、E、P結(jié)構(gòu)區(qū)組成，去除了天然tPA的K1和K2兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)。此外，與天然tPA分子相比，還含有3個(gè)氨基酸編碼的替換突變，分別為S262G(TCC-GGT)、R298E(AGG-GAG)、R299E(AGG-GAG)(數(shù)字代表是天然tPA分子中的氨基酸位置)。
綜上所述，本發(fā)明提供的大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1，可以高水平地產(chǎn)生rtPAm-1蛋白，利用10升發(fā)酵罐進(jìn)行中試發(fā)酵生產(chǎn)，生產(chǎn)rtPAm-1的水平達(dá)到1100mg/L。rtPAm-1包涵體經(jīng)過復(fù)性和純化，用溶纖圈法檢測，具有激活溶纖酶原溶纖活性的作用，活性達(dá)到5-6×105IU/mg，達(dá)到或優(yōu)于國際同類產(chǎn)品水平。該菌株遺傳穩(wěn)定性高，連續(xù)傳代30代以上仍保持相同的生產(chǎn)能力。進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)表明rtPAm-1無毒性、無副作用，體內(nèi)半衰期達(dá)20-30分鐘，達(dá)到國際同類產(chǎn)品水平。本發(fā)明提供的大腸桿菌工程菌株BL21(DE3)/rtPAm-1，生產(chǎn)能力強(qiáng)，產(chǎn)量高，遺傳穩(wěn)定性高，生產(chǎn)的新型重組突變tPA分子量小、穩(wěn)定性高、活性強(qiáng)，在各項(xiàng)指標(biāo)上達(dá)到或超過國際同類產(chǎn)品水平，具備生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明之內(nèi)容具有可重復(fù)性，普通技術(shù)人員按照本發(fā)明所提供的步驟，可以得到該菌株以及利用該菌株產(chǎn)生重組突變tPA。


圖1質(zhì)粒pETrtPAm-1構(gòu)建示意圖1.重組tPA基因(rtPA基因)的獲得。
設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，引物1和引物2用于擴(kuò)增FE片段，引物3和4用于擴(kuò)增P片段。以tPA cDNA為模板，通過PCR方法獲得tPA基因的FE區(qū)、P區(qū)片段，兩片段經(jīng)過限制性內(nèi)切酶切割，和酶切的pQE30質(zhì)粒進(jìn)行三片段連接，獲得中間重組質(zhì)粒pQErtPA，上含重組tPA基因，由原始tPA基因的F、E、P區(qū)組成。
2.重組突變r(jià)tPAm-1基因(rtPAm-1基因)的獲得。
采用PCR定點(diǎn)突變法。設(shè)計(jì)兩條誘變引物引物5和引物6，以pQErtPA為模板，分別用引物1和5、引物4和6進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后再將兩種PCR產(chǎn)物混合，進(jìn)行第二次PCR，兩個(gè)片段可以互為模板——引物進(jìn)行延伸，產(chǎn)生1.1Kb的變異tPA基因(rtPAm-1)。圓點(diǎn)顯示設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)的位置。
3.對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pET-His進(jìn)行改造，去除其上6His的編碼區(qū)。
根據(jù)pET-His質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物7和引物8，用pET-His質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后用BamHI和HindIII切割擴(kuò)增產(chǎn)物，得到?jīng)]有6His編碼區(qū)的pET質(zhì)粒。
4.質(zhì)粒pETrtPAm-1的獲得。
將PCR產(chǎn)生的1.1kb的重組突變tPA基因(rtPAm-1基因)用內(nèi)切酶BamHI和HindIII切割，用T4連接酶連接改造的pETs質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pETrtPAm-1。圖2重組表達(dá)質(zhì)粒pETrtPAm-1的酶切鑒定和PCR鑒定(0.7％瓊脂糖凝膠電泳)1.經(jīng)過改造的pET載體。去除了6His編碼區(qū)，其大小2.6kb。
2.DNA分子量標(biāo)識(shí)(Marker)3、4.pETrtPAm-1質(zhì)粒經(jīng)KpnI和HindIII雙酶切產(chǎn)生的片段。其中0.8kb的帶是rtPAm-1基因中的P片段，而2.9kb的帶則是tPA的FE片段加上pET質(zhì)粒片段。
5、6.以pETrtPAm-1為模板的PCR產(chǎn)物。1.1kb的擴(kuò)增帶是rtPAm-1基因片段。
圖3.大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生rtPAm-1蛋白(10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測)
1.經(jīng)過LB、2YT液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)前的大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1的菌體蛋白，沒有出現(xiàn)rtPAm-1蛋白。
2.異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)6h，超聲波破碎大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1細(xì)胞，離心得到的上清中的蛋白。沒有rtPAm-1蛋白。
3.異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)6h，超聲波破碎大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1細(xì)胞，離心得到的沉淀中的蛋白。出現(xiàn)rtPAm-1蛋白，箭頭處顯示rtPAm-1蛋白。表達(dá)的rtPAm-1蛋白占到總細(xì)胞蛋白的30％以上，其大小在38kD左右。
4.將誘導(dǎo)獲得的rtPAm-1包涵體變性溶解于8M尿素，用pH8.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)過夜透析復(fù)性，再利用分子篩層析柱G50進(jìn)行純化的rtPAm-1蛋白。經(jīng)過上述處理，rtPAm-1蛋白的純度達(dá)到95％以上。
5.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)識(shí)(Marker)圖4.用溶纖圈法檢測rtPAm-1蛋白的激活纖溶酶原溶纖活性作用1.陰性對(duì)照生理氯化鈉溶液，點(diǎn)樣2μl。沒有出現(xiàn)溶纖圈。
2.標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣人tPA樣品，點(diǎn)樣10單位(10IU)。出現(xiàn)溶纖圈。
3.實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過復(fù)性和純化的rtPAm-1蛋白，點(diǎn)樣5μl。出現(xiàn)溶纖圈。
結(jié)果表明本發(fā)明之大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1表達(dá)的rtPAm-1蛋白具有激活纖溶酶原溶纖活性的作用。
圖5.大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1連續(xù)傳代30代的菌體蛋白(10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)M蛋白質(zhì)Marker1-7依次分別為出發(fā)菌株，第5、10、15、20、25、30代菌株的菌體蛋白。箭頭指示出發(fā)菌株和傳代菌株表達(dá)的rtPAm-1蛋白。
結(jié)果表明，在經(jīng)過30代傳代后，大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1產(chǎn)生rtPAm-1蛋白的能力沒有改變。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，按常規(guī)條件進(jìn)行，參考如薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版，1992年，科學(xué)出版社)中所述實(shí)驗(yàn)方法。
實(shí)施例1.質(zhì)粒pETrtPAm-1的構(gòu)建圖1顯示了重組突變tPA基因的構(gòu)建原理和過程。天然的成熟的人tPA含527個(gè)氨基酸，由5個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)區(qū)組成(F、E、K1、K2和P)，P區(qū)含tPA的抑制物PAI結(jié)合區(qū)和酶活性區(qū)，K2含PAI作用區(qū)和纖維蛋白結(jié)合區(qū)，K1與肝清除tPA有關(guān)，F(xiàn)區(qū)(指型結(jié)構(gòu)區(qū))與蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)，在K1K2缺失時(shí)，F(xiàn)區(qū)仍可以和纖維蛋白、纖溶酶原互相作用。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的重組突變r(jià)tPAm-1基因，是考慮到增加tPA的穩(wěn)定性、延長半衰期和增加對(duì)抑制物PAI的抗性。在設(shè)計(jì)基因重建和變異時(shí)，分兩步進(jìn)行，首先建構(gòu)出含F(xiàn)、E、P的tPA基因(缺失K1和K2)，然后再在PAI作用位點(diǎn)引入氨基酸編碼的替換突變，獲得如SEDID NO.1.所顯示的基因序列，最后將此基因連接到表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建成質(zhì)粒pETrtPAm-1。
具體實(shí)施方式
如下1.tPA基因FE片段和P片段的PCR擴(kuò)增首先合成兩對(duì)引物，用于兩個(gè)片段的擴(kuò)增引物1GAATTCGGATCCATGGGAAGATCTTACCAAGTGATC(下劃線處是BamHI切割序列GGATCC，后接起始密碼ATG，并含Kozak序列CCATGG)引物2GTCGACGGTACCCGTGGCCCTGGTATC(含KpnI切割序列GGTACC)引物3GTCGACGGTACCTGCGGCCTGAGACAG(含KpnI切割序列GGTACC)引物4AGATCTAAGCTTCTCGAGTCACGGTCGCATGTTGTC(含HindIII切割序列AAGCTT)用tPAcDNA為擴(kuò)增模板，一組反應(yīng)管中加入引物1和引物2，用于擴(kuò)增FE片段，另一組加引物3和4，用于擴(kuò)增P片段，兩組PCR反應(yīng)條件相同94℃5min，之后94℃1min，55℃1min，72℃1min共33個(gè)循環(huán)，最后72℃10min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酚抽提，1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收。
2.重組質(zhì)粒pQErtPA的構(gòu)建用內(nèi)切酶BamHI和KpnI切割FE片段，用KpnI和HindIII切割P片段，用BamH I和KpnI切割載體質(zhì)粒pQE30(pQE30質(zhì)粒購自QIAGEN公司)，利用T4連接酶進(jìn)行三片段連接，構(gòu)建pQErtPA克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素(Amp)-LB平板上篩選獲取陽性菌落。
3.在tPA基因上把原始tPA分子的R298、R299編碼都突變?yōu)镋編碼采用PCR定點(diǎn)突變法進(jìn)行突變。首先合成兩條誘變引物(下劃線處代表突變處)引物5CTCTCCGGGCGACTCCTCGTGCTTGGCAAAGATGGC引物6GCCATCTTTGCCAAGCACGAGGAGTCGCCCGGAGAG以pQErtPA質(zhì)粒為模板，分別用引物1和5，引物4和6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94℃5min，之后94℃1min，52℃1min，72℃1min共33個(gè)循環(huán)，最后72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酚抽提，1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收。然后將回收的兩種PCR產(chǎn)物混合，進(jìn)行第二次PCR，PCR反應(yīng)條件為94℃10min，之后94℃1min，53℃1min，72℃1min共33個(gè)循環(huán)，最后72℃10min。兩個(gè)片段可以互為模板——引物進(jìn)行延伸，產(chǎn)生1.1Kb的變異tPA基因(rtPAm-1)。
4.對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pET-His進(jìn)行改造表達(dá)質(zhì)粒pET-His購自基因動(dòng)力實(shí)驗(yàn)室有限公司。原始pET-His質(zhì)?？杀磉_(dá)出連續(xù)6個(gè)組氨酸以便于蛋白質(zhì)純化，但不符合生物制品制藥要求，而提純后再切割融合肽段則會(huì)增加工序和大幅提高生產(chǎn)成本。因此這一步驟的主要目的是除去pET-His質(zhì)粒上6個(gè)組氨酸的編碼區(qū)。圖1所示，根據(jù)pET質(zhì)粒的6His編碼區(qū)左右兩側(cè)的序列各設(shè)計(jì)一條引物引物7CG CTC CAG GGATCC GCA GAA TTC(正向)引物8CA TGA GCG GGA TCC TTC TTA AAG TTA AAC(反向)利用上述引物，以pET-His質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為94℃10min，之后94℃1min，53℃1min，72℃3min共33個(gè)循環(huán)，最后72℃10min。PCR可得到一條線性DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，一端含酶切位點(diǎn)BamH I，另一端含酶切位點(diǎn)BamHI和HindIII(圖1)。
5.重組表達(dá)質(zhì)粒pETrtPAm-1的構(gòu)建上一步PCR得到的線性DNA擴(kuò)增產(chǎn)物用BamHI和HindIII切割，并用0.7％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收，將第3步中PCR得到的rtPAm-1基因用BamHI和HindIII雙酶切后并回收。用T4連接酶連接兩片段，得到重組質(zhì)粒pETrtPAm-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存)，用氨芐青霉素(Amp)-LB平板篩選得到陽性菌落，經(jīng)過鑒定(見下一步驟)，命名為DH5αrtPAm-1。
6.質(zhì)粒pETrtPAm-1的鑒定采用堿裂解法，參照薩薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版，1992年，科學(xué)出版社)，從陽性菌落DH5αrtPAm-1培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒pETrtPAm-1，用KpnI和HindIII雙酶切，0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢查，結(jié)果產(chǎn)生0.8Kb和2.9Kb兩條帶(圖2)，與預(yù)期大小相符，其中0.8kb的帶代表rtPAm-1基因中的P片段，而2.9kb的帶則是FE片段加上pET質(zhì)粒片段。進(jìn)一步用PCR進(jìn)行鑒定，以重組質(zhì)粒為模板，用引物1和引物4進(jìn)行PCR，可以得到大小為1.1kb的擴(kuò)增帶(圖2)，與預(yù)期大小相符。
質(zhì)粒上rtPAm-1基因的測序由英俊(invitrogen)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。測序引物是利用pET質(zhì)粒上的T7RNA聚合酶序列通用引物，測序結(jié)果表明獲得的rtPAm-1基因序列與預(yù)期設(shè)計(jì)完全一致，rtPAm-1基因全長1083nt(包括終止密碼TGA)，編碼360個(gè)氨基酸的蛋白。將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pETrPAm。
實(shí)施例2工程菌株BL21(DE3)/rtPAm-1的制備1.重組質(zhì)粒pETrtPAm-1的提取將DH5αrtPAm-1接種到LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒pETrtPAm-1。
2.BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備用冷CaCl2法制備BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將BL21(DE3)菌種接種到20mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3-5小時(shí)，培養(yǎng)物冰浴10min，4000rpm離心收集細(xì)胞，加入預(yù)冷0.1M CaCl2重懸細(xì)胞，冰浴30min，4000rpm離心收集細(xì)胞，加入500μl0.1M CaCl2(按初始培養(yǎng)體積20ml計(jì))懸浮細(xì)胞，置于4℃。
3.重組質(zhì)粒pETrtPAm-1轉(zhuǎn)化BL21(DE3)
將pETrtPAm-1質(zhì)粒與BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞混合，42℃熱激90s，冰浴1-2min，加入LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)45min，涂布氨芐青霉素(Amp)-LB平板，37℃培養(yǎng)12-16h，可出現(xiàn)陽性菌落。經(jīng)過實(shí)施例3鑒定，將能產(chǎn)生rtPAm-1蛋白的菌株命名為BL21(DE3)/rtPAm-1。
實(shí)施例3大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)產(chǎn)生rtPAm-1蛋白從上一步驟的氨芐青霉素(Amp)-LB平板中挑選單菌落，接種到5ml含100μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)14h，然后按1∶40轉(zhuǎn)種到2YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2～3h，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6h。離心收集菌體，懸浮于緩沖液A(20mMTris，0.5M NaCl，pH8.0)，超聲波破碎細(xì)胞，離心收集沉淀，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析蛋白質(zhì)表達(dá)情況。
圖3是10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，經(jīng)過異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后，大腸桿菌菌株高效表達(dá)出rtPAm-1。表達(dá)蛋白分子量約為38kD，與預(yù)期大小相符。表達(dá)蛋白呈包涵體形式，在細(xì)胞破碎后，全部出現(xiàn)在沉淀中，表達(dá)量占到細(xì)胞總蛋白的30％以上。
實(shí)施例410升發(fā)酵罐中大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1的發(fā)酵生產(chǎn)水平1.斜面種子培養(yǎng)。LB斜面固體培養(yǎng)基，含氨芐青霉素(Amp)100μg/ml，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。
2.搖瓶種子培養(yǎng)2YT液體培養(yǎng)基，含氨芐青霉素(Amp)100μg/ml，每瓶100ml培養(yǎng)基，接種一環(huán)，37℃振蕩培養(yǎng)12-14小時(shí)。
3.發(fā)酵培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨20g/L，酵母抽提物8g/L，NaCl2g/L，MgSO40.2g/L，泡敵20μl/L，純凈水配制，培養(yǎng)基體積10升。消毒前調(diào)節(jié)pH值至7.0。蒸汽消毒，缸壓0.1mpa(120℃)20分鐘。
發(fā)酵培養(yǎng)的控制條件和參數(shù)培養(yǎng)基體積10升，pH6.8-7.0接種量5％-10％
攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速40Hz溫度控制范圍35-37℃罐壓0.05-0.07MPa通氣量3-5升/min(1∶0.3-1∶0.5)按上述條件和參數(shù)，培養(yǎng)至菌量6-8克/升、pH值上升到7.2、DO下降至20％以下時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度1mM，35-37℃繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)6-8小時(shí)。發(fā)酵全程為10-12小時(shí)。
發(fā)酵可得到重組tPA的包涵體。用10升全自動(dòng)發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)10批次，菌體產(chǎn)量(離心沉淀濕重)穩(wěn)定在8.0-10.0g/L，tPA晶體(純化后，濕重)穩(wěn)定在900-1200mg/L，平均產(chǎn)量達(dá)到1100mg/L。tPA晶體經(jīng)10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢查，tPA蛋白含量約為90％。
實(shí)施例5 rtPAm-1蛋白質(zhì)的復(fù)性和純化1.將經(jīng)過異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1離心收集，懸浮于緩沖液A(20mM Tris，0.5M NaCl，pH8.0)。
2.超聲波破碎細(xì)胞，離心收集沉淀，洗滌3次后，溶解于8M尿素，在4℃條件下，用pH8.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)過夜透析復(fù)性。
3.利用分子篩層析柱G50-Sephadex(購自安瑪西亞公司)進(jìn)行純化，柱子用10mMTris-Cl(pH7.5)平衡，上柱量為柱床體積20％，用10mMTris-Cl，0.15-0.5MNaCl(pH7.5)梯度洗脫，用核酸蛋白質(zhì)檢測儀(波長280nm)監(jiān)視收集，tPA最先直接從柱中流出(帶紅茶色)，后為分子量30KD以下的蛋白(無色)。
圖3泳道4顯示經(jīng)過變性溶解、復(fù)性和純化后的rtPAm-1蛋白，經(jīng)過G50-Sephadex分子篩層析純化后，rtPAm-1蛋白的純度可達(dá)95％以上。
實(shí)施例6大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1表達(dá)的rtPAm-1蛋白的活性檢測采用溶圈法進(jìn)行，步驟如下1.tPA標(biāo)準(zhǔn)品購自衛(wèi)生部北京藥品生物制品檢定所，每瓶含tPA30000IU，用3ml生理氯化鈉溶液溶解，使tPA濃度為10IU/ul。
2.人凝血酶用生理氯化鈉溶液配成100IU/ml，于-20℃保存。
3.纖溶酶原購自北京藥品生物制品檢定所，用生理氯化鈉溶液配成0.5mg/ml。
4.人纖維蛋白原30mg/支，中國藥品生物制品檢定所制備標(biāo)準(zhǔn)試劑。實(shí)驗(yàn)前配置，配置前先在37℃水浴預(yù)熱15min，生理氯化鈉溶液也同時(shí)預(yù)熱，然后每支加5ml生理氯化鈉溶液，37℃水浴靜置保溫30min使其完全溶解，配置成6mg/ml溶液。
5.纖維蛋白平板制備稱取125mg瓊脂糖，加入23ml生理氯化鈉溶液，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加入280ul纖維蛋白(0.5mg/ml)，加入14ul凝血酶(100IU/ml)，不停搖勻，混濁后倒平板，水平放置，室溫凝固。
6.活性檢測用打孔器在纖維蛋白平板上打孔，直徑2mm，將tPA樣品和標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)入孔中，37℃8小時(shí)，測量透明圈直徑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)tPA和rtPAm-1樣品的透明圈直徑大小，計(jì)算出樣品活性。
結(jié)果見圖4，經(jīng)過變性、復(fù)性及純化后的rtPAm-1蛋白能夠激活纖溶酶原產(chǎn)生溶纖圈，經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)tPA的換算，活性達(dá)到5-6×105IU/mg，達(dá)到國際同類產(chǎn)品的水平。
實(shí)施例7大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1的遺傳穩(wěn)定性研究在氨芐青霉素(Amp)-LB固體平板培養(yǎng)基上劃線接種菌株，37℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落繼續(xù)劃線培養(yǎng)，每傳一次記為一代。傳代中每隔5代挑取單菌落接種5ml LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)，37℃培養(yǎng)14h，然后按1∶40轉(zhuǎn)種到2YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2～3h，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6h。離心收集菌體，懸浮于緩沖液A(20mMTris，0.5MNaCl，pH8.0)，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白質(zhì)表達(dá)情況。
圖5顯示，在經(jīng)過30次傳代后，大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后仍能穩(wěn)定高效地表達(dá)rtPAm-1蛋白，表明大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
實(shí)施例8 rtPAm-1蛋白的動(dòng)物試驗(yàn)1.rtPAm-1蛋白的體內(nèi)半衰期取家兔三只，按10萬單位/公斤的劑量從耳靜脈注射，注射結(jié)束后5分鐘第一次采血樣，加到有抗凝劑的小管中，離心1500轉(zhuǎn)/分沉淀細(xì)胞，取5μl上清測tPA活性，以后每5分鐘采一次血樣測tPA活性，計(jì)算tPA活性下降50％的平均時(shí)間。經(jīng)過測定rtPAm-1在家兔體內(nèi)的半衰期20-30分鐘。
2.異常毒性試驗(yàn)按尾靜脈注射和腹腔注射兩個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行，按5萬單位/公斤的劑量注射，每個(gè)樣品注射20只，另用20只注射無菌生理鹽水為對(duì)照租，連續(xù)觀察7天。結(jié)果兩個(gè)試驗(yàn)組的小鼠在7天內(nèi)全部健存，無異常反應(yīng)，體重增長，活動(dòng)和進(jìn)食正常。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)武漢陸地生物工程有限公司<120>一種生產(chǎn)重組人tPA的大腸桿菌菌株及制備方法<130>一種生產(chǎn)重組人tPA的大腸桿菌菌株及制備方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1083<212>DNA<213>Artificial<400>1atgggaagat cttaccaagt gatctgcaga gatgaaaaaa cgcagatgat ataccagcaa 60catcagtcat ggctgcgccc tgtgctcaga agcaaccggg tggaatattg ctggtgcaac120agtggcaggg cacagtgcca ctcagtgcct gtcaaaagtt gcagcgagcc aaggtgtttc180aacgggggca cctgccagca ggccctgtac ttctcagatt tcgtgtgcca gtgccccgaa240ggatttgctg ggaagtgctg tgaaatagat accagggcca cgggtacctg cggcctgaga300cagtacagcc agcctcagtt tcgcatcaaa ggagggctct tcgccgacat cgcctcccac360ccctggcagg ctgccatctt tgccaagcac gaggagtcgc ccggagagcg gttcctgtgc420gggggcatac tcatcagctc ctgctggatt ctctctgccg cccactgctt ccaggagagg480tttccgcccc accacctgac ggtgatcttg ggcagaacat accgggtggt ccctggcgag540gaggagcaga aatttgaagt cgaaaaatac attgtccata aggaattcga tgatgacact600tacgacaatg acattgcgct gctgcagctg aaatcggatt cgtcccgctg tgcccaggag660agcagcgtgg tccgcactgt gtgccttccc ccggcggacc tgcagctgcc ggactggacg720gagtgtgagc tctccggcta cggcaagcat gaggccttgt ctcctttcta ttcggagcgg780ctgaaggagg ctcatgtcag actgtaccca tccagccgct gcacatcaca acatttactt840aacagaacag tcaccgacaa catgctgtgt gctggagaca ctcggagcgg cgggccccag900gcaaacttgc acgacgcctg ccagggcgat tcgggaggcc ccctggtgtg tctgaacgat960ggccgcatga ctttggtggg catcatcagc tggggcctgg gctgtggaca gaaggatgtc 1020ccgggtgtgt acaccaaggt taccaactac ctagactgga ttcgtgacaa catgcgaccg 1080tga 108權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)重組人tPA的大腸桿菌菌株，其特征在于大腸桿菌菌株Escherichia coil.BL21(DE3)/rtPAm-1，其保藏編號(hào)為CCTCC M205112。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1，其特征在于大腸桿菌細(xì)胞中含有重組質(zhì)粒pETrtPAm-1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1中的重組質(zhì)粒pETrtPAm-1，其特征在于含有一種重組突變?nèi)藅PA基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.一種用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種大腸桿菌工程菌株的制備方法，它包括以下步驟A、用PCR方法分別擴(kuò)增出tPA基因的FE片段和P片段；B、用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI切割FE片段，用內(nèi)切酶KpnI和HindIII切割P片段，用內(nèi)切酶BamHI和HindIII切割pQE30質(zhì)粒，用T4連接酶進(jìn)行三片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQErtPAm-1，其上含有重組tPA基因，由原始tPA基因的F、E、P區(qū)組成；C、設(shè)計(jì)兩條誘變引物，采用PCR定點(diǎn)突變法在重組tPA基因上把原始tPA分子R298、R299編碼處都突變?yōu)镋編碼；D、對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pET-His進(jìn)行改造，利用pET-His質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用BamHI和HindIII切割擴(kuò)增產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)生的1.1kb變異tPA基因用內(nèi)切酶BamHI和HindIII切割，用T4連接酶連接兩片段，獲得重組質(zhì)粒pETrtPAm-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得大腸桿菌菌株DH5αrtPAm-1；E、鑒定重組質(zhì)粒pETrtPAm-1用雙酶切、PCR方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定；F、培養(yǎng)大腸桿菌菌株DH5αrtPAm-1，提取重組質(zhì)粒pETrtPAm-1；G、冷CaCl2法制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞；H、將重組質(zhì)粒pETrtPAm-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選和鑒定獲得大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm-1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)重組人tPA的大腸桿菌菌株及制備方法。本發(fā)明提供的大腸桿菌菌株BL21(DE3)/rtPAm－1，CCTCC M205112。大腸桿菌菌株細(xì)胞中含有一種重組質(zhì)粒pETrtPAm－1，質(zhì)粒上克隆有一種重組突變?nèi)藅PA基因，該基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，在基因上游含T7啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合序列和KozaK序列。BL21(DE3)/rtPAm－1菌株經(jīng)過誘導(dǎo)，可以高效表達(dá)重組突變tPA蛋白，表達(dá)量可占到細(xì)胞蛋白總量的30％以上。產(chǎn)生的重組tPA分子，不同于現(xiàn)有其它重組人tPA，具有分子量小、活性強(qiáng)、半衰期長、穩(wěn)定性高。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1786152SQ200510019708
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月1日
發(fā)明者葉林柏, 吳正輝, 佘應(yīng)龍, 葉力, 郜金榮 申請(qǐng)人:武漢大學(xué), 武漢陸地生物工程有限公司