專利名稱：一種種子特異型表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種種子特異型表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別是涉及一種種子 特異型表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和利用該載體在油葵中制備阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的 方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病是全球范圍導(dǎo)致人類死亡最主要的原因，預(yù)計(jì)到2015年，約有2000萬 人死于心血管疾病。諸多的心血管疾病(如心肌梗塞和中風(fēng))為動(dòng)脈粥樣硬化的主要合并 癥。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，血脂代謝異常是造成該疾病的主要危險(xiǎn) 因素之一，其中高水平的低密度脂蛋白(low density lipoproteins，LDL)和低水平的高 密度脂蛋白(highdensity lipoproteins, HDL)是兩個(gè)最重要的危險(xiǎn)因素。傳統(tǒng)的治療策 略是降低血漿中總膽固醇(total cholesterol,TC)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoproteins cholesterol,LDL-C)的含量，他汀類是目前首選的降脂藥物，但該類藥物不 能清除已沉積在動(dòng)脈壁上的斑塊，也不能達(dá)到根本治療動(dòng)脈粥樣硬化癥的目的。各國學(xué)者 越來越多地把目光轉(zhuǎn)向另一個(gè)危險(xiǎn)因素-低水平的高密度脂蛋白，流行病學(xué)研究表明血 漿中高密度脂蛋白的水平與冠心病的發(fā)病率成負(fù)相關(guān)，認(rèn)為高密度脂蛋白能起到防止動(dòng)脈 粥樣硬化形成的作用。通過提升高密度脂蛋白的水平來治療動(dòng)脈粥樣硬化癥-這是世界醫(yī) 藥行業(yè)正在浮現(xiàn)的一種新的針對(duì)急性冠狀動(dòng)脈粥樣硬化疾病治療的新方法，被稱為高密度 脂蛋白靶向治療。阿樸脂蛋白A-KapolipoproteinA-LapoA-I)是高密度脂蛋白主要的蛋 白成分。阿樸脂蛋白A-I在肝臟和小腸內(nèi)合成，其原始翻譯產(chǎn)物是含有267個(gè)氨基酸殘基 的前原蛋白形式(preproapoA-I)。前原蛋白被信號(hào)肽酶加工切除18肽前片段轉(zhuǎn)變成原阿 樸脂蛋白形式(ProapoA-I)，原阿樸脂蛋白分泌出胞外后，在細(xì)胞外特異性轉(zhuǎn)化酶作用下切 除6肽原片段(Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln)，轉(zhuǎn)變成血漿成熟阿樸脂蛋白A-I。阿樸脂蛋白 A-I的作用機(jī)理主要是促進(jìn)膽固醇的外溢、抗氧化和抗血小板聚合等。阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體(apolipoproteinA-IM，apoA-IM)是阿樸脂蛋白A-I 的自然突變體(Argl73--Cys)，與阿樸脂蛋白A-I相比，173位精氨酸的丟失導(dǎo)致其α螺 旋含量降低，加大了與脂質(zhì)結(jié)合的能力。阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體易形成二聚體(Α-ΙΜ/ Α-ΙΜ)，此二聚體激發(fā)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的效率要比阿樸脂蛋白A-I高，從而更高效地加速膽 固醇的排出；同時(shí)阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體比阿樸脂蛋白A-I能更好地削弱低密度脂蛋 白的氧化。目前，阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體是世界上唯一被證實(shí)的能夠清除已經(jīng)沉積在 動(dòng)脈壁上血栓的藥用蛋白，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。最近《美國醫(yī)學(xué)會(huì)雜志》報(bào)道阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體對(duì)動(dòng)脈粥樣病變改變的 速度和幅度前所未有，并且?guī)缀鯖]有副作用，應(yīng)用前景十分廣闊，已成為世界醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域 工作的重點(diǎn)和競(jìng)爭的焦點(diǎn)。全球最大的醫(yī)藥公司輝瑞(Pfizer)預(yù)測(cè)任何能夠逆轉(zhuǎn)冠狀動(dòng) 脈斑塊的藥物都有可能取得10億美元的銷售業(yè)績，所以阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的開發(fā) 必然可以帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，同時(shí)也會(huì)增強(qiáng)我國在心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化疾病藥物開發(fā)領(lǐng)域的世界影響力。此外，基于小樣本臨床結(jié)果顯示阿樸脂蛋白A-I的臨床需要量是每個(gè)療程 5_6g，阿樸脂蛋白A-I的高治療劑量以及動(dòng)脈粥樣硬化的高患病率均預(yù)示了一個(gè)強(qiáng)大的 市場(chǎng)需求，這也為阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的開發(fā)提供了一個(gè)契機(jī)。目前，美國愛普隆 (Esperion)公司生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)試劑用途的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，但其采用的是生物合成 的方法，生產(chǎn)的成本高，產(chǎn)量小，不適合規(guī)?；a(chǎn)。細(xì)菌系統(tǒng)內(nèi)蛋白質(zhì)的重組體表達(dá)一般 具有吸引力，但是此方法產(chǎn)率低，并且大腸桿菌內(nèi)毒素與阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體易形 成強(qiáng)的復(fù)合體，蛋白純化方法昂貴且安全性較差。因此，開發(fā)高產(chǎn)、高效生產(chǎn)阿樸脂蛋白A-I 米蘭突變體的方法勢(shì)在必行。植物生物反應(yīng)器(plant bioreactor)也被稱為分子藥田(Molecular medicine farming)是指利用植物生物系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)具有重要應(yīng)用和商業(yè)價(jià)值的外源蛋白質(zhì)，特別 是用于醫(yī)療和診斷的藥用蛋白。1989年哺乳動(dòng)物抗體在轉(zhuǎn)基因植物中首次獲得成功表達(dá)， 其重鏈和輕鏈在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)并正確組裝，首次證實(shí)了植物作為生物反應(yīng)器的可行 性。此后，轉(zhuǎn)基因植物研究逐漸興起。許多其它的藥用蛋白陸續(xù)在各種不同的植物中實(shí)現(xiàn) 了表達(dá)，如水蛭素、干擾素、人血清蛋白、功能抗體，已用于植物生物反應(yīng)器研究的植物有 煙草、擬南芥、大豆、小麥、水稻、玉米、油菜、馬鈴薯和番茄等。目前，加拿大針對(duì)代謝及心血管疾病研制蛋白質(zhì)藥物組合的生物科技公司 SemBioSysGenetics公司在中國申請(qǐng)了轉(zhuǎn)基因紅花和擬南芥生產(chǎn)阿樸脂蛋白A-I和阿樸脂 蛋白A-I米蘭突變體方法的專利(CN1906^6A)，把嵌合核酸構(gòu)建體導(dǎo)入擬南芥或紅花中， 結(jié)籽后在種子中表達(dá)阿樸脂蛋白A-I及阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。擬南芥是一年生或 兩年生草本植物，其基因組是目前已知植物基因組中最小的，并且因?yàn)槠浠蚋叨燃兒?，?理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型，成為了遺傳學(xué)研究的好材料， 被科學(xué)家譽(yù)為“植物中的果蠅”。但是，擬南芥目前廣泛被用于實(shí)驗(yàn)途徑，并未有大規(guī)模的 普遍種植形成。紅花屬一年生草本植物，種子可以榨油，是一種重要的油料作物，分布在溫 帶，我國多產(chǎn)于西北，尤以新疆、西藏為多，其次是華北和東北地區(qū)。但紅花畝產(chǎn)量比較低 (120-150kg)，瘦果含油率不是很高(34 55% )，導(dǎo)致最終產(chǎn)物蛋白的量少，成本較高。因此，現(xiàn)有技術(shù)仍然需要一種方法穩(wěn)定、產(chǎn)率高、成本低、步驟簡單的制備阿樸脂 蛋白A-I和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的申請(qǐng)人通過長期研究，付出大量的創(chuàng)造性勞動(dòng)，通過構(gòu)建一種特異型的 表達(dá)載體，并選擇油葵作為生物反應(yīng)器，穩(wěn)定、高效地生產(chǎn)出阿樸脂蛋白A-I和阿樸脂蛋白 A-I米蘭突變體，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)阿樸脂蛋白A-I或阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的 方法，特別涉及以油葵作為宿主生產(chǎn)阿樸脂蛋白A-I或阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的方法。 具體的說，本發(fā)明涉及利用花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I或阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體 的融合蛋白基因在油葵油體中表達(dá)從而可以大量生產(chǎn)制備治療動(dòng)脈粥樣硬化極其所造成 的心血管疾病的重要藥物阿樸脂蛋白A-I和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，優(yōu)選制備阿樸脂 蛋白A-I米蘭突變體。
首先，本發(fā)明提供了一種種子特異型表達(dá)載體，含有阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體 與花生油體蛋白融合基因或含有阿樸脂蛋白A-I與花生油體蛋白融合基因，優(yōu)選含有阿樸 脂蛋白A-I米蘭突變體與花生油體蛋白融合基因，其中，該載體的啟動(dòng)子為油菜油體蛋白 基因啟動(dòng)子。以上載體用以在油葵中制備阿樸脂蛋白A-I或阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體， 優(yōu)選阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。另外，本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建上述高效種子特異型表達(dá)載體的方法，包括如下 步驟1)分離克隆油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子和花生油體蛋白基因；2)按照植物偏愛的密碼子設(shè)計(jì)合成阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因或阿樸脂蛋 白A-I基因；3)構(gòu)建以油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體或阿樸脂蛋白A-I基因融合表達(dá)的植物表達(dá)載體。具體步驟包括1)躺雄舊艦口靴艦艦用PCR方法自油菜 (Brassica campestris)基因組DNA中擴(kuò)增20kD油體蛋白基因的啟動(dòng)子，并將該啟動(dòng)子克 隆到pUC19 (購自MBI公司)上得到重組質(zhì)粒pUCN，以花生基因組DNA為模板PCR方法擴(kuò)增 終止密碼子缺失的花生油體蛋白基因。其中，油菜品種可以是目前現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開或 使用的油菜品種，例如，可以是青油14品種、互豐101、耐寒高油王、早油100天和秦油2號(hào) 等，優(yōu)選青油14品種。以上油菜油體蛋白啟動(dòng)子可以克隆到PUC19的適合位點(diǎn)之間，優(yōu)選 克隆到pUC19的HindIII和BamHI位點(diǎn)之間。所述的花生品種可以是目前現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng) 公開或使用的花生品種，例如，可以是冀花4號(hào)、冀油7號(hào)、白沙、魯花11、?；ê拓S花1號(hào) 等，優(yōu)選冀花4號(hào)。2)勿偏愛的密石馬子設(shè)i十合成阿樸)^ 白A-I或阿樸)^ 白A-I米蘭突變 體基因桉照油葵密碼子使用頻率優(yōu)化阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I基因， 優(yōu)選優(yōu)化的基因?yàn)榘阒鞍譇-I米蘭突變體基因。頻率小于10%的密碼子一律認(rèn)為 是稀有密碼子被排除，其余的各密碼子按油葵密碼子使用頻率優(yōu)化，優(yōu)化前基因的分子量 為451. 4，優(yōu)化前后序列的一致性為大于60%，優(yōu)選大于65%，最優(yōu)選為72%，優(yōu)化后基因 的分子量優(yōu)選為451. 3。油葵密碼子使用頻率可參考http://VWW. kazusa. or. jp/codon/ cgi-bin/showcodon. cgi ？ species = 42323)豐射聿似油菜油體蛋白基因啟云力子gR云力的花牛油體蛋白與阿樸)^ 白A-I米蘭 突變體基因或阿樸脂蛋白A-I基因融合表汰的棺物表汰載體利用重眷PCR技術(shù)將花生油體 蛋白基因和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因或阿樸脂蛋白A-I基因構(gòu)建成融合基因，優(yōu)選 將花生油體蛋白基因和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因構(gòu)建成融合基因01e/apOA-IM，將 該融合基因連入PUCN得到重組質(zhì)粒pUCNOA，優(yōu)選連入的位點(diǎn)為pUCN的BamHI和^icI酶 切位點(diǎn)之間，雙酶切重組質(zhì)粒pUCNOA，優(yōu)選HindIII和Sac工雙酶切重組質(zhì)粒pUCNOA，回收 2202bp的外源片段，并將該外源片段連入植物表達(dá)載體pBI 121 (植物轉(zhuǎn)基因工程中常用的 植物雙元表達(dá)載體)的HindIII和McI位點(diǎn)之間獲得pBINOA，即油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體融合基因的植物表達(dá)載體或油菜油體 蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I融合基因的植物表達(dá)載體。
最后，本發(fā)明還提供了利用以上種子特異型植物表達(dá)載體制備阿樸脂蛋白A-I米 蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I的方法，包括如下步驟1)將上述構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入受體植物外植體內(nèi)；2)將上述受體植物材料培養(yǎng)為完整的植株，得到種子；3)從上述種子中分離純化得到阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I0其中，所述的受體植物優(yōu)選為油葵，優(yōu)選分離純化得到的是阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體。具體步驟包括1)將攜帶阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因或阿樸脂蛋白A-I基因的種子特異型植 物表達(dá)載體導(dǎo)入油葵恢復(fù)系外植體。將種子特異型植物表達(dá)載體導(dǎo)入油葵恢復(fù)系的方法可 以是本領(lǐng)域常規(guī)的導(dǎo)入方法，包括但不限于基因槍法、花粉管通道法、子房注射法和農(nóng)桿 菌介導(dǎo)法，優(yōu)選的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中，將攜帶阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基 因或阿樸脂蛋白A-I基因的種子特異型植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化油葵 恢復(fù)系外植體。所述外植體包括無菌苗莖尖、子葉、子葉節(jié)、去掉一片子葉的實(shí)生株四種形 式，其中優(yōu)選去掉一片子葉的實(shí)生株；2)轉(zhuǎn)基因后獲得的再生植株經(jīng)抗性篩選得到抗性苗，待抗性苗生根后移栽入溫室 進(jìn)行培養(yǎng)，直至成熟收獲種子。其中，抗性苗生根后移栽入溫室進(jìn)行蛭石和營養(yǎng)土混合物培 養(yǎng)，在幼苗期進(jìn)行PCR檢測(cè)和Southern blotting檢測(cè)，收獲籽粒后進(jìn)行油體蛋白和阿樸脂 蛋白A-I米蘭突變體融合蛋白的Wfestern blotting檢測(cè)；3)將含阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I的種子在緩沖液中研磨，離 心將油體和種子的其他成分分離，洗滌油體，通過酶切反應(yīng)將阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體 或阿樸脂蛋白A-I自油體表面釋放，經(jīng)HPLC純化獲得阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，并對(duì)其 進(jìn)行鑒定。在本發(fā)明的載體和方法中，選擇了油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明， 該啟動(dòng)子可大大提高阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因的表達(dá)效率。優(yōu)選地，在油體蛋白基 因起始密碼子周圍還可以設(shè)計(jì)Kozak序列表達(dá)控制元件，可以更加進(jìn)一步提高基因表達(dá)效率。在本發(fā)明的載體和方法中，還選擇了油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿 樸脂蛋白A-I的融合表達(dá)。目的蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中是以融合蛋白的形式與油體蛋白共同 在油體中特異表達(dá)，利用油體親脂疏水的特性，將轉(zhuǎn)基因植物種子粉碎，液體抽提，離心處 理，回收上層油相即可將融合蛋白與細(xì)胞內(nèi)其它組分分開，可去除90%以上的種子蛋白。優(yōu) 選地，在油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I之間設(shè)計(jì)了凝血酶識(shí)別 位點(diǎn)，用以從油體上釋放阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，簡化了表達(dá)產(chǎn)物的純化工藝，提高了 純化效率。其中，優(yōu)選的油體蛋白為花生油體蛋白?；ㄉ腕w蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體或阿樸脂蛋白A-I的融合表達(dá)，表達(dá)效率高，效果好。在本發(fā)明公開的載體和方法中，為了提高阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因或阿樸 脂蛋白A-I基因的表達(dá)效率，根據(jù)阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因序列或阿樸脂蛋白A-I 基因序列和油葵偏愛的密碼子、GC含量對(duì)阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因或阿樸脂蛋白 A-I基因的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化和全基因的人工合成。
在本發(fā)明公開的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I的生產(chǎn)方法中，優(yōu) 選的植物生物反應(yīng)器為油葵。油葵作為我國一種重要的油料作物，在我國具有悠久的種植 歷史，具有其它作物不可替代的優(yōu)勢(shì)。油葵產(chǎn)量高，作為耐旱作物，可以在鹽堿地、干旱地區(qū) 甚至沙漠等惡劣環(huán)境下種植，因此適于大面積推廣種植，不僅不會(huì)與糧食“爭地”，而且還 有利于提高我國山嶺薄地、干旱貧瘠之地的利用率，緩解國家耕地緊張的壓力。因此，選擇 油葵作為生物反應(yīng)器，大規(guī)模地生產(chǎn)阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體是適合我國國情的生產(chǎn)藥 用蛋白的方式。最有優(yōu)勢(shì)的是，采用油葵作為生物反應(yīng)器，與目前已作為阿樸脂蛋白A-I米 蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I生產(chǎn)反應(yīng)器的紅花相比，具有顯著的生產(chǎn)效率提高，產(chǎn)率增加 的效果。采用此發(fā)明方法生產(chǎn)人阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體具有以下優(yōu)點(diǎn)1、植物表達(dá)的外源蛋白，類似于哺乳動(dòng)物表達(dá)的蛋白，能進(jìn)行正確的折疊，這對(duì)于 必須具有體內(nèi)活性的藥用蛋白的生產(chǎn)尤為重要。2、采用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體更安全，因?yàn)楸苊饬舜?腸桿菌中的內(nèi)毒素和動(dòng)物病原菌的的污染。3、利用轉(zhuǎn)基因植物的油體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，大大簡化了 純化工藝，降低了成本，有利于將來的產(chǎn)業(yè)化。較之已經(jīng)被kmBioSys Genetics公司采用 的擬南芥以及紅花具有很大的優(yōu)勢(shì)。4、采用本發(fā)明的種子特異型植物表達(dá)載體和制備方法，大大提高了阿樸脂蛋白 A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I的表達(dá)量，能達(dá)到種子總蛋白含量的1. 5%。5、采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物，不僅可以降低成本、提高轉(zhuǎn)化效率，還提高了轉(zhuǎn)基 因植株的遺傳穩(wěn)定性。本發(fā)明是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)開發(fā)高效表達(dá)的植物生物反應(yīng)器，所生產(chǎn)阿樸脂蛋白 A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I是治療心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化疾病的特效藥物。術(shù)語及解釋除有特殊說明，在本發(fā)明中出現(xiàn)術(shù)語均具有本領(lǐng)域通常的含義，其中的縮寫代表 的內(nèi)容如下LDL:low density lipoproteins,低密度月旨蛋白HDL :high density lipoproteins,高密度月旨蛋白TC :total cholesterol，血漿中總膽固醇LDL-C:low density lipoproteins cholesterol，低密度月旨蛋白膽固醇apoA-I :apolipoprotein A-I 阿樸月旨蛋白 A-IapoA-IM :apolipoprotein A-I Milano 阿樸脂蛋白 A-I 米蘭突變體A-IM/A-IM 阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體二聚體pUC19 常用的大腸桿菌克隆載體，購自MBI公司pBI121 植物轉(zhuǎn)基因工程中常用的植物表達(dá)載體pUCN:攜帶油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子(NOP)的pUC19載體，插入位點(diǎn)為HindIII和 BamHI01eosin/apoA-IM 花生油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的融合基因pUCNOA 攜帶油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子(NOP)、花生油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體融合基因的PUC19載體，插入位點(diǎn)為HindIII和McIpBINOA 攜帶油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子(NOP)、花生油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米 蘭突變體融合基因的PBI121載體，插入位點(diǎn)為HindIII和McI


圖1種子特異型植物表達(dá)載體pBINOA結(jié)構(gòu)示意圖；圖2種子特異型植物表達(dá)載體pBINOA構(gòu)建流程示意圖；圖3pUCN載體的酶切鑒定及PCR檢測(cè)；圖401eosin/apoA_IM融合基因的構(gòu)建；圖5pUCN0A載體的酶切鑒定；圖6種子特異型植物表達(dá)載體pBINOA的酶切鑒定；圖7轉(zhuǎn)基因油葵nptll基因的PCR檢測(cè)；圖8轉(zhuǎn)基因油葵的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因的PCR檢測(cè)；圖9轉(zhuǎn)基因油葵PCR-Southern雜交結(jié)果；圖10轉(zhuǎn)基因油葵籽粒油體中油體蛋白-阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體融合蛋白的 Western 檢測(cè)；圖11油葵作為生物反應(yīng)器和紅花作為生物反應(yīng)器制備阿樸脂蛋白A-I米蘭突變 體的比較。
具體實(shí)施例方式以下具體實(shí)施方式
僅是對(duì)于本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，并不用于限定本發(fā)明的范 圍。在了解本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明精神的前提下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行 改變，這些技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。除有特殊說明外，下列實(shí)施例中所述的方法均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實(shí)施例1 種子特異型植物表達(dá)載體本發(fā)明中首先采用PCR方法擴(kuò)增了油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子(Ν0Ρ)，將該啟動(dòng)子 插入pUC19的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)之間得到pUCN。同時(shí)依據(jù)阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體基因序列和油葵偏愛的密碼子設(shè)計(jì)并人工合成了阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因， 并將該合成的基因插入花生油體蛋白基因(Ole)的3’末端，獲得花生油體蛋白和阿樸脂蛋 白A-I米蘭突變體融合基因，同時(shí)在花生油體蛋白基因和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因 之間添加了凝血酶酶切位點(diǎn)。進(jìn)而將該融合基因插入PUCN的BamHI和McI酶切位點(diǎn)之間 得到pUCNOA，HindIII和McI雙酶切pUCNOA，瓊脂糖凝膠回收2202bp的外源片段，并將該 外源片段插入植物雙元表達(dá)載體PBI121的HindIII和McI酶切位點(diǎn)之間，獲得本發(fā)明提 供的植物表達(dá)載體pBINOA，pBINOA的表達(dá)盒為以油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子(NOP)驅(qū)動(dòng)的 01e/apOA-IM融合基因，pBINOA結(jié)構(gòu)如圖1所示，1 油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子，2 花生油體 蛋白基因，3 凝血酶酶切位點(diǎn)，4 阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因。將pBINOA進(jìn)行測(cè)序獲 得表達(dá)盒的序列如SEQ ID NO 15所示，長度為2202bp。實(shí)施例2 種子特異型植物表達(dá)載體pBINOA的構(gòu)建 植物表達(dá)載體pBINOA構(gòu)建流程如圖2所示，具體步驟如下 油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子的克隆，油菜是重要的油料作物，含油量高02 45% )，而且油菜油體中20kD油體蛋白的量為MkD油體蛋白量的10倍。根據(jù)油菜油體蛋白 基因啟動(dòng)子核苷酸序列(Genbank No. AF134411)設(shè)計(jì)正向引物pBINOA-1 =CCC AAG CTT TTC AACGTG GTC GGA TCA TGA CG (SEQ ID NO 1)和反向引物 pBINOA-2 CGC-GGA TCC GAATTG AGA GAG ATC GAA GAG (SEQ ID NO :2)，用于PCR擴(kuò)增油菜20kD油體蛋白基因的啟動(dòng)子，在 引物上分別引入了 HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)(下劃線表示酶切位點(diǎn))。以油菜(Brassica campestris)青油14品種基因組DNA為模板，ρΒΙΝΟΑ-l和pBINOA-2為引物，PCR的條件 為:94°C lmin、63-73°C lmin、68°C lmin，30個(gè)循環(huán)后，68°C延伸lOmin，擴(kuò)增油菜油體蛋白 基因啟動(dòng)子。瓊脂糖凝膠電泳并回收擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)而用HindIII和BamHI雙酶切回收所得 產(chǎn)物，并將其與HindIII和BamHI雙酶切的pUC19連接，將連接產(chǎn)物與200 μ LDH5 α感受 態(tài)細(xì)胞(購自天根生化科技(北京)有限公司)混勻，冰浴30min，42°C熱激1.5min，冰浴 3min，加入800 μ L LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)45min，涂布含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板，37 °C 培養(yǎng)過夜。PCR方法篩選轉(zhuǎn)化子，ρΒΙΝΟΑ-l和pBINOA-2為引物，PCR的條件為94°C lmin、 60-73°C lmin、72°C lmin，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè) 篩選結(jié)果，將陽性轉(zhuǎn)化子命名為PUCN，將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì) 粒，將質(zhì)粒進(jìn)行HindIII單酶切鑒定和Hindlll、BamHI雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示 鑒定結(jié)果如圖 3 所示，M =DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT14I, Ll =HindIII 酶切 pUCN質(zhì)粒的產(chǎn)物為3565bp的片段，L2 =HindIII和BamHI雙酶切pUCN質(zhì)粒的產(chǎn)物為^62bp 的載體片段和90;3bp的啟動(dòng)子，L3 =PCR檢測(cè)pUCN質(zhì)粒得到90!3bp的啟動(dòng)子。將pUCN質(zhì)粒 進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序步驟如下⑴以PUCN為模板，pUC19通用測(cè)序引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR 產(chǎn)物；(2)純化PCR產(chǎn)物，以去除酶、熒光染料、引物和其他離子；(3)純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng) 變性和冰浴處理后上3730測(cè)序儀(ABI公司)進(jìn)行測(cè)序；(4)儀器自動(dòng)分析并打印出彩色 測(cè)序圖譜和DNA序列。pUCN中外源片段長度為90!3bp，序列如SEQ ID NO :3所示，分子量 為556.7kDa。酶切結(jié)果和測(cè)序結(jié)果表明已將油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子成功克隆到pUC19 上。阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因的人工合成，依據(jù)阿樸脂蛋白A-I基因序列 (SEQ IDNO :4，NM000039)，氨基酸序列如SEQ ID NO :5所示，同時(shí)參照油葵密碼子使用頻率 (http://www. kazusa. or. jp/codon/cgi-bin/showcodon. cgi ？ species = 4232)禾口油葵基 因組中的GC含量重新設(shè)計(jì)并合成了阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因，同時(shí)第517為的堿基 C突變?yōu)閴A基T，并在基因的5’端添加了凝血酶酶切位點(diǎn)，核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示 CTGGTCCCAAGGGGTAGC，氨基酸序列為SEQ ID N0:7所示L VPRG S，人工合成后的阿樸脂 蛋白A-I米蘭突變體基因750bp，分子量為462.4kDa，序列如SEQ ID N0:8所示。該基因編 碼的蛋白由249個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為28. 585kDa。01e/apoA-IM融合蛋白基因的擴(kuò)增，依據(jù)花生油體蛋白基因序列(Genbank No. AF325917)和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因序列SEQ ID NO 8設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引 物 pBIN0A-3/pBIN0A-4 和 pBIN0A-5/pBIN0A-6(序列分別如 SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12)pBIN0A_3 和 pBINOA-6 中分別引入 BamHI 和 SacI 酶切位點(diǎn) (帶下劃線的堿基為酶切位點(diǎn))，且pBINOA-3引物中在油體蛋白基因起始密碼子周圍設(shè)計(jì) 了 Kozak序列(序列中加粗部分，功能是提高轉(zhuǎn)錄和表達(dá)效率)；pBINOA-4和pBIN0A_5互 為反向互補(bǔ)序列。
pBINOA-3 CGC-GGA TCC AGC AAA GCC GCC ACC ATG GCT ACT GCT ACT GAT CGpBINOA-4 :GCT ACC CCT TGG GAC CAG TGA TGA TGA CCT CTT AACpBINOA-5 :GTT AAG AGG TCA TCA TCA CTG GTC CCA AGG GGT AGCpBINOA-6 :C GAG CTC TTA TTG TGT GTT AAG TTT CTT TG以pBIN0A-3/pBIN0A_4為引物，花生(品種冀花4號(hào))基因組DNA為模板擴(kuò)增終 止密碼子缺失的花生油體蛋白基因，PCR的條件為94°C lmin、50-55°C lmin、68°C lmin， 30個(gè)循環(huán)后，68 °C延伸IOmin ；以pBIN0A-5/pBIN0A-6為引物，優(yōu)化后的阿樸脂蛋白A-I 米蘭突變體基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因，PCR的條件為94°C lmin、 63-73°C lmin、68°C lmin, 30個(gè)循環(huán)后，68°C延伸IOmin ；瓊脂糖凝膠電泳并回收兩種PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物，將兩種產(chǎn)物摩爾比1 1混合作為模板，以pBIN0A-3/pBIN0A-6為引物進(jìn)行重疊 PCR, PCR 的條件為94°C lmin,50-55°C lmin,68°C 2min,30 個(gè)循環(huán)后，68°C延伸 IOminJlC 脂糖凝膠電泳并回收擴(kuò)增產(chǎn)物獲得01e/apOA-IM融合基因。01e/apOA-IM融合基因的構(gòu)建 如圖 4 所示，M =DNA Molecular Weight Marker DL2000, Ll :pBIN0A-3/pBIN0A_4 為引物， 花生(品種冀花4號(hào))基因組DNA為模板擴(kuò)增終止密碼子缺失的花生油體蛋白基因
的片段，L2 以pBIN0A-5/pBIN0A-6為引物，優(yōu)化后的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因?yàn)槟?板擴(kuò)增阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因750bp (含編碼凝血酶酶切位點(diǎn)的核苷酸序列)， L3 以pBIN0A-3/pBIN0A-6為引物進(jìn)行重疊PCR，獲得的01e/apoA_IM融合基因。將Ole/ apoA-IM融合基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示01e/apOA-IM融合基因序列如SEQ ID NO 13所 示，長1278bp，分子量787. 9kDa。預(yù)測(cè)的氨基酸殘基序列如SEQ ID NO 14所示，由425個(gè) 氨基酸殘基組成，分子量46.994kDa。0le0Sin-ap0A-IM融合基因的構(gòu)建結(jié)果和測(cè)序結(jié)果表 明我們已得到0le0Sin-ap0A-IM融合基因。中間載體pUCNOA的構(gòu)建，將01e/apoA_IM融合基因進(jìn)行BamHI和McI雙酶切后 與同樣雙酶切的PUCN連接，將連接產(chǎn)物與200 μ L DH5a感受態(tài)細(xì)胞(購自天根生化科技 (北京)有限公司)混勻，冰浴30min，42°C熱激1. 5min,冰浴3min，加入800 μ L LB培養(yǎng)基 37°C培養(yǎng)45min，涂布含100 μ g/mL氨芐霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜。PCR方法篩選轉(zhuǎn)化 子，pBINOA-3 和 pBINOA-6 為引物，PCR 的條件為-MV lmin、60_73°C lmin、72°C 1.5min，30 個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)篩選結(jié)果，將陽性轉(zhuǎn)化子 命名為pUCNOA，將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行HindIII 單酶切鑒定、HindIII和BamHI雙酶切鑒定以及BamHI和McI雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠 電泳顯示鑒定結(jié)果如圖 5 所示，M :DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT 141, Ll HindIII單酶切pUCNOA質(zhì)粒的產(chǎn)物為4849bp的片段，L2 =HindIII和SacI雙酶切pUCNOA 質(zhì)粒的產(chǎn)物為2647bp的載體片段和2202bp的外源片段(包含油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子和 oleosin-apoA-IM融合基因)L3 =BamHI和SacI雙酶切pUCNOA質(zhì)粒的產(chǎn)物為3571bp的載 體片段和1278bp的外源片段(oleosin-apoA-IM融合基因)。將pUCNOA質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè) 序結(jié)果SEQ ID N0:15，全長2202bp，分子量為1357. 5kDa，包括油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子和 0le0Sin-ap0A-IM融合基因。酶切結(jié)果(如圖5所示)和測(cè)序結(jié)果(如序列表中)SEQ ID N0 15表明已獲得了油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I米 蘭突變體融合基因的表達(dá)盒，并已將該表達(dá)盒成功克隆到載體PUC19上。
種子特異型植物表達(dá)載體pBINOA的構(gòu)建，堿裂解法提取pUCNOA質(zhì)粒DNA，用 HindIII和SacI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收2202bp的外源片段，將其與經(jīng)HindIII和 SacI雙酶切的pBI121連接，將連接產(chǎn)物與200 μ L DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(購自天根生化科技 (北京)有限公司)混勻，冰浴30min，42°C熱激1. 5min,冰浴3min，加入800 μ L LB培養(yǎng)基 37°C培養(yǎng)45min，涂布含100 μ g/mL卡那霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜。PCR方法篩選轉(zhuǎn)化 子，pBINOA-1 和 pBINOA-6 為引物，PCR 的條件為-MV lmin,60-73°C Imin,72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)篩選結(jié)果，將陽性轉(zhuǎn)化子 命名為pBINOA，將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行HindIII 單酶切鑒定以及HindIII和McI雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示鑒定結(jié)果如圖6所示， M =DNA Molecularffeight Marker λ DNA/EcoT 141，Ll :HindIII 酶切 pBINOA 質(zhì)粒的產(chǎn)物為 14205bp的片段，L2 =HindIII和SacI雙酶切pBINOA質(zhì)粒的產(chǎn)物為12003bp的載體片段 和2202bp的外源片段(包含油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子和oleosin-apoA-lM融合基因)。 將pBINOA質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果SEQ ID NO 15，載體的全長核苷酸序列如SEQ ID N0: 16所示。整個(gè)表達(dá)盒長2202bp，分子量為1357. 5kDa，包括油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子和 0le0Sin-ap0A-IM融合基因。油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子是種子特異型的強(qiáng)啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因 植物的種子中驅(qū)動(dòng)阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體以融合蛋白的形式與花生油體蛋白共同在 油體中特異表達(dá)，花生油體蛋白攜帶阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體錨定在油體表面。利用油 體親脂疏水的特性，將轉(zhuǎn)基因植物種子粉碎，液體抽提，離心處理，回收上層油相即可將融 合蛋白與細(xì)胞內(nèi)其它組分分開，可去除90%以上的種子蛋白。并在花生油體蛋白和阿樸脂 蛋白A-I米蘭突變體之間設(shè)計(jì)了凝血酶識(shí)別位點(diǎn)，用以從油體上釋放阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體。實(shí)施例3利用該載體制備阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體3. 1上述構(gòu)建的種子特異型表達(dá)載體導(dǎo)入受體植物外植體內(nèi)；3. 1. 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3mL的YEB液體培養(yǎng)基(含鏈霉素 Sml25yg/mL)中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；(2)取過夜培養(yǎng)菌液500 μ L接種于50mL YEB (Sm 125 μ g/mL)液體培養(yǎng)基中，28 °C 振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5 ；(3) 5，OOOrpm,離心 5min ；(4)加 IOmL 0. 15M NaCl 懸浮農(nóng)桿菌細(xì)胞，5，OOOrpm,離心 5min ；(5) ImL預(yù)冷的20mM CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴，Mh內(nèi)使用，或分裝成每管200 μ L，液 氮中速凍Imin，置_70°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 2種子特異型植物表達(dá)載體向農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化取200 μ L感受態(tài)細(xì)胞，加入Iyg構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，液氮中速凍lmin，37°C水浴 5min,然后加入ImLYEB培養(yǎng)基，慢速振蕩培養(yǎng)4h ；1, OOOrpm離心30sec，棄上清，加入 0. ImLYEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，涂布于含有100 μ g/mL Kan和125 μ g/mL Sm的YEB平板 上，28 °C培養(yǎng)約48h。陽性克隆的鑒定挑取平板上長出的單菌落，接種于YEB液體培養(yǎng)液(含有100μ g/mL Kan和125μ g/mL Sm)中振蕩培養(yǎng)過夜；堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板， pBINOA-1 和 pBINOA-6 為引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增鑒定，PCR 的條件為94°C lmin、60_73°C lmin、 72°C 2min,30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)篩選結(jié)果獲得陽
性轉(zhuǎn)化子。用于轉(zhuǎn)化油葵的農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備從平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種到5mL YEB液體培養(yǎng)基中(含有100 μ g/mL Kan和125 μ g/mL Sm)，振蕩培養(yǎng)過夜，取ImL菌液接種到100_200mL YEB液體培養(yǎng)基(含 有100 μ g/mL Kan和125 μ g/mLSm)中，劇烈振蕩培養(yǎng)至0D_為0. 4 0. 8，3500rpm離心 IOmin,菌體用MS (不含植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素)液體培養(yǎng)基重懸，使0D_為0. 6左右， 以進(jìn)行侵染。3. 1. 3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油葵外植體的遺傳轉(zhuǎn)化將發(fā)芽3 4d的油葵種子實(shí)生幼苗的莖尖、子葉、子葉節(jié)和去掉一片子葉的實(shí)生 株四種形式的外植體，在上述農(nóng)桿菌菌液中浸泡6 8min，轉(zhuǎn)至MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng) 3d(25°C黑暗)。其中優(yōu)選的方式是去掉一片子葉的實(shí)生株。3. 2將上述受體植物材料培養(yǎng)為完整的植株，得到種子并進(jìn)行目的基因和蛋白的 檢測(cè)；3. 2. 1受體植物材料培養(yǎng)為完整的植株，得到種子將上述轉(zhuǎn)化過的外植體轉(zhuǎn)到含頭孢霉素300mg/L的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)， 約7d后，轉(zhuǎn)至MS抗性篩選培養(yǎng)基上(含頭孢霉素300mg/L和卡那霉素70mg/L的)選擇培 養(yǎng)，每15 20d更換培養(yǎng)基，篩選三次后獲得抗性芽，將2 3厘米抗性芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基 MS2 (MS+IBAO. lmg/L+Kan 70mg/L+cef 300mg/L)，待抗性苗生根后移栽入溫室進(jìn)行蛭石和 營養(yǎng)土混合物培養(yǎng)，直至成熟收獲種子。3.2.2目的基因和蛋白的檢測(cè)在幼苗期對(duì)阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，收獲籽粒后對(duì)花生油 體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體融合蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因油葵幼苗的PCR檢測(cè)和PCR-Southern blotting檢測(cè)采用SDS法提取抗性油葵幼苗幼嫩真葉的基因組DNA作為模板，以nptllF/nptllR 和pBIN0A-5/pBIN0A-6兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，引物序列分別為nptIIF =ATG AAC TGCAGG ACG AGG(SEQ ID NO :17)nptIIR :GCG ATA CCG TMAGC ACG(SEQ ID NO :18)nptIIF/ nptIIR和 pBIN0A-5/pBIN0A-6 的 PCR 擴(kuò)增的條件均為為94°C lmin、60°C lmin、72°C lmin, 30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin，分別擴(kuò)增出預(yù)期為567bp的片段(部分nptll基因)和750bp 的apoA-IM基因片段，結(jié)果如圖7和圖8所示。圖7中，M:DNA Molecular WeightMarker DL2000, L1-L4 mptllF/nptnR為引物，以自卡那抗性的油葵所提基因組DNA為模板擴(kuò) 增出567bp的片段，即為陽性植株，L5 非抗性油葵做對(duì)照。圖8中，M =DNA Molecular WeightMarkerDL2000, L1-L4 :pBIN0A-5/pBIN0A-6為引物，以自卡那抗性的油葵所提基因 組DNA為模板擴(kuò)增出750bp的片段，即為陽性植株，L5 非抗性油葵對(duì)照。PCR-Southern blottinR 檢測(cè)1)采用SDS法提取nptll和ap0A_IM均為陽性的轉(zhuǎn)基因油葵幼苗真葉的基因組 DNA,以pBIN0A-l/pBIN0A-6為引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94°C lmin、600C lmin、72°C 2. 5min，30 個(gè)循環(huán)后，72°C延伸 IOmin02)將DNA從凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜，電泳完畢，進(jìn)行變性、中和后，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜，將膜 晾干，真空80°C干烤1. 2hrs。3) DNA探針標(biāo)記回收pBINOA質(zhì)粒的BamH I+Sac I雙酶切片，取3 μ g DNA用于標(biāo)記4)雜交63°C預(yù)雜交膜30mins，63°C雜交過夜，用充足的2XSSC，0. SDS洗膜2次；用預(yù) 熱到65°C的0. 5 X SSC, 0. 1% SDS 63°C條件下洗膜2次。5)檢測(cè)雜交和洗過的膜用沖洗緩沖液沖洗，簡單淋洗一次；在IOOmL封閉液中浸泡 30min ；在20mL抗體溶液中浸泡30min ；用IOOmL沖洗緩沖液沖洗2次，各15min ；在20mL檢 測(cè)緩沖液中平衡2-5min ；將膜的DNA面向上放到雜交袋中，加入ImL CSPD ；37°C溫浴濕潤的 膜lOmin，以使化學(xué)熒光充分反應(yīng)；在X光片上室溫曝光。結(jié)果如圖9所示，M =DNA Molecular WeightMarker λ DNA/EcoT 141，L1-L4 以 PCR 檢測(cè)陽性植株基因組為模板以 pBINOA-1/ pBINOA-6為引物擴(kuò)增產(chǎn)物的Southern blotting結(jié)果，2. 2kb處顯示雜交信號(hào)，與預(yù)期結(jié)果 一致，表明oleosin-apoA-lM融合基因已經(jīng)整合到油葵基因組中，L5 非轉(zhuǎn)基因油葵對(duì)照。轉(zhuǎn)某籽粒Φ花牛油體蛋白禾口阿樸脂^SA-I米S突奪體融合蛋白的 Westernblotting 檢泖丨將轉(zhuǎn)基因油葵籽粒于5V研磨緩沖液(50mM Tris-HCl pH 7. 5,0. 4M sucrose, 0.5M NaCl)中研磨，離心IOXg 30min，分為三部分，取油相，重新懸浮于等體積的研磨緩 沖液中，混勻，輕輕加入5V預(yù)冷的50mM Tris-HCl pH 7. 5緩沖液，離心10 X g 30min，取油 相。將上述過程重復(fù)2次，用以進(jìn)一步去除剩余的水溶性成分和不溶性成分，得到純凈的油 體(油體的成分包括中性脂類磷脂、油體蛋白)。在油體中加入2V乙醚，離心，中性脂類 留在了上層乙醚相中，磷脂在下層的水相中，取中間的蛋白層，以0. IM的蔗糖緩沖液重懸， 加入氯仿甲醇O 1)混合物，抽提兩次，取中間蛋白層，乙醚抽提一次，溶于無菌水中。進(jìn) 行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后用山羊抗兔阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的多克隆抗 體進(jìn)行Wfestern blotting分析，結(jié)果如圖10所示，M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，Ll和L2 為自轉(zhuǎn)基 因油葵的種子中提取的油體蛋白，有阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大小約 為48kDa，與預(yù)期的大小一致(花生油體蛋白18. 4kDa+凝血酶酶切位點(diǎn)0. 6kDa+阿樸脂蛋 白A-I米蘭突變體28. 9kDa)。表達(dá)量占種子總蛋白的1. 1 %，超過了重組藥物蛋白在植物 中表達(dá)的最低商業(yè)化要求(1% )，因此利用植物油體表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體的產(chǎn)業(yè)化，具有可行性和廣闊的應(yīng)用前景。3. 3從上述種子中分離純化獲得阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。第一步將油體與種子中的其它成分分開將種仁于5V研磨緩沖液(50mMTris-HCl pH 7. 5，0. 4M蔗糖，0. 5M NaCl)中研磨， 離心(10Xg)30min，分為三部分最底部是不可溶沉淀(籽殼、纖維質(zhì)材料、不溶糖、蛋白質(zhì) 和其它不溶性污物)，中間是水相，內(nèi)含可溶的細(xì)胞成分(儲(chǔ)藏蛋白)，最上層是油體和與之 結(jié)合的油體蛋白。第二步洗滌油體
取第一步所得油相，重新懸浮于等體積的研磨緩沖液中，混勻，加入5V預(yù)冷的 50mMTri s-HCl pH 7. 5緩沖液，離心(10 X g) 30min，取油相。將上述過程重復(fù)2次，用以 進(jìn)一步去除剩余的水溶性成分和不溶性成分，洗滌過的油體重懸于等體積預(yù)冷的50mM Tris-HCl pH7. 5中，這樣所得的油體是基本純凈的油體制品，僅存的蛋白質(zhì)是油體蛋白。第三步酶切反應(yīng)釋放阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體蛋白用凝血酶酶切緩沖液(20mM Tris-HCl ρΗ8· 4、150m M NaCl、2. 5m M CaCl2)洗滌 油體兩次，加入適量的凝血酶，37°C過夜，離心，阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體蛋白存在于水 相中。第四步HPLC純化阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體蛋白上反相色譜柱C4(5y，0. 24*25cm)，紫外波長214nm，緩沖液々(10%乙腈0. 1%H 氟乙酸)2mL/min平衡柱子，將上一步所得水相上樣，對(duì)柱子施以0_60 %緩沖液B (95 %乙腈 0. 三氟乙酸)線性梯度洗脫，得到純的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體蛋白，純度達(dá)99. 5% 以上。^mm 4 M^^m^m.mm^m^^m^m.^m^mmm^ a-I 米 蘭突變體的比較取相同質(zhì)量QSOmg)的轉(zhuǎn)阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因的油葵種子和紅花種 子，依據(jù)實(shí)施例3分離純化獲得阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體蛋白，上樣量為所得總量的十分 之一，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果如圖11所示，M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，Ll 自轉(zhuǎn)基因紅 花純化的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，大小為28. 9kDa，與預(yù)期大小一致，定量為50ng，L2 白轉(zhuǎn)基因油葵純化的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，大小為28. 9kDa，與預(yù)期大小一致，定量 為80ng。由此推算Ikg轉(zhuǎn)基因油葵種子可獲得2. 85g阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，同等條 件下Ikg轉(zhuǎn)基因紅花種子可獲得1. 78g阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。而且油葵的畝產(chǎn)量約 250kg.紅花的畝產(chǎn)量約200公斤，無論是從種子阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體產(chǎn)率還是單位 面積種植作物的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體產(chǎn)量來看，油葵都要優(yōu)先于紅花。
1權(quán)利要求
1.一種表達(dá)載體，含有阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I與花生油體蛋白 融合基因，其中啟動(dòng)子為油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其具有SEQID N0:15所示序列。
3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體的方法，其包括如下步驟1)分離克隆油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子和花生油體蛋白基因。2)按照植物偏愛的密碼子設(shè)計(jì)合成阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I基 因，其特征是按照油葵偏愛的密碼子優(yōu)化阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因。3)構(gòu)建以油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I米蘭突變 體或阿樸脂蛋白A-I融合基因植物表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，包括如下步驟1)分離克隆油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子和花生油體蛋白基因。2)按照植物偏愛的密碼子設(shè)計(jì)合成阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因，其特征是按照油 葵偏愛的密碼子優(yōu)化阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因。3)構(gòu)建以油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I米蘭突變 體融合基因植物表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中的油菜油體蛋白啟動(dòng)子可以克隆到pUC19的HindIII 和BamHI位點(diǎn)之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，在步驟( 中將頻率小于10%的密碼子一律認(rèn)為是稀有密 碼子被排除，其余的各密碼子按油葵密碼子使用頻率優(yōu)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，優(yōu)化前后的一致性大于60%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，優(yōu)化前后的一致性為72%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，在步驟(3)中利用重疊PCR技術(shù)將花生油體蛋白基因和阿 樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因基因構(gòu)建成融合基因01e/apOA-IM，將該融合基因連入pUCN 得到重組質(zhì)粒pUCNOA，優(yōu)選連入的位點(diǎn)為pUCN的BamHI和McI酶切位點(diǎn)之間，雙酶切重組 質(zhì)粒pUCNOA，優(yōu)選HindIII和&icl雙酶切重組質(zhì)粒pUCNOA，回收2202bp的外源片段，并將 該外源片段連入植物表達(dá)載體的HindIII和McI位點(diǎn)之間。
10.一種制備阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I的方法，其包括如下步驟1)將權(quán)利要求1或2所述表達(dá)載體導(dǎo)入受體植物外植體內(nèi)；2)將上述受體植物材料培養(yǎng)為完整的植株，得到種子；3)從上述種子中分離純化得到阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I0
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中受體植物為油葵。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，所制備的是阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其中步驟1)中的導(dǎo)入方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述方法，其中所述油葵種子為卡那霉素抗性表型。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其中所述純化方法為高效液相色譜法。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其中的分離純化方法包括將含阿樸脂蛋白A-I米蘭突 變體或阿樸脂蛋白A-I的種子在緩沖液中研磨，離心將油體和種子的其他成分分離，洗滌 油體，通過酶切反應(yīng)將阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I自油體表面釋放，經(jīng) HPLC純化獲得阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種種子特異型表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，主要是在植物雙元表達(dá)載體pBI121的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)HindIII和SacI的之間插入以油菜油體蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的花生油體蛋白基因-阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因組成的融合蛋白表達(dá)盒，得到發(fā)明中所述的植物表達(dá)載體pBINOA。另外，提供了一種利用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化油葵構(gòu)建植物生物反應(yīng)器制備阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的方法，該方法不僅可以提高阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的產(chǎn)率，而且大大降低生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102127562SQ20101058001
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者于成鋼, 劉培, 盧海剛, 安勝軍, 李雪, 柴錫慶, 溫昕, 焦展, 王崑聲, 胡良元, 許海民, 邵鐵梅, 陳云雨 申請(qǐng)人:安勝軍, 柴錫慶, 王崑聲