專利名稱：：前體流加發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及L-色氨酸，尤其是涉及一種前體流加發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法。
背景技術(shù)：
：L-色氨酸(L-Trp)是一種含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，是人和動物生命活動中不可缺少的必需氨基酸之一。由于L-色氨酸及其代謝產(chǎn)物對機(jī)體的廣泛作用，其在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途一度成為醫(yī)學(xué)界的研究熱門，到目前為止，L-色氨酸作為治療癩皮病、精神分裂癥、營養(yǎng)藥劑、人工膳食和必需氨基酸片的用途已經(jīng)得到了廣泛的承認(rèn)(李劍欣，張緒梅，徐琪壽.色氨酸的生理生化作用及其應(yīng)用[J]氨基酸和生物資源，2005，27(3):58-62)。L-色氨酸在食品工業(yè)的應(yīng)用價值主要在于它被廣泛地用作食品添加劑、調(diào)味劑和抗氧化防腐劑。近年來，由于在配合飼料中大量使用合成的蛋氨酸和賴氨酸，使得L-色氨酸成為飼料中主要的限制性氨基酸，是繼蛋氨酸和賴氨酸之后的第三大飼料添加劑(張炳榮.氨基酸工業(yè)大全[M].北京輕工業(yè)出版社，1991)。早期的L-色氨酸的生產(chǎn)方法主要依靠化學(xué)合成法和蛋白質(zhì)水解法，但是由于這些方法存在著材料來源有限、周期長、工藝復(fù)雜、產(chǎn)品成分復(fù)雜等缺點，因而在上世紀(jì)90年代逐漸被淘汰，隨著對微生物法生產(chǎn)L-色氨酸研究的不斷深入，微生物法已經(jīng)走向?qū)嵱貌⑶姨幱谥鲗?dǎo)地位。微生物法大體上又可以分為酶法、微生物轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法(張克旭.氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)[M].北京中國輕工業(yè)出版社.1992:712-722)。酶法和微生物轉(zhuǎn)化法的高成本已困擾研究工作者多年，進(jìn)展不大，難以實現(xiàn)大規(guī)模低成本生產(chǎn)L-色氨酸。而微生物發(fā)酵法具有產(chǎn)酸高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)勢，將是未來大規(guī)模生產(chǎn)L-色氨酸的首選技術(shù)。目前，微生物發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸主要使用到的菌種為谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌°在谷氨酸棒桿菌方面，Katsumata等(KatsumataR,IkedaM.HyperproductiionoftryptophaninCorynebacteriumglutamicumbypathwayengineering.NatureBioechnology,1993，11921-925)將帶有7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸(DAHP)合成酶和色氨酸合成酶的質(zhì)粒引入產(chǎn)色氨酸的谷氨酸棒桿菌KY10894，發(fā)酵80h使得L-色氨酸的產(chǎn)量比原始菌株提高了54%，達(dá)到43g/L;Ikeda等(IkedaM，NakanishiK,KinoK,etal.FermentativeproductionoftryptophanbyastablerecombinantstrainofCorynebacteriumglutamicumwithamodifiedserine-biosyntheticpathway[J]BiosciBiotechnolBiochem，1994，58(4):674_678)又將絲氨酸代謝途徑中的磷酸甘油酸脫氫酶的基因克隆島表達(dá)aroG基因與色氨酸合成酶基因的質(zhì)粒pWK99中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒PWK9901，并將后者轉(zhuǎn)入色氨酸生產(chǎn)菌KY10894，解決了發(fā)酵過程中絲氨酸供給量較少而積累副產(chǎn)物吲哚等問題，發(fā)酵80h后，產(chǎn)量達(dá)50g/L。Ikeda等(IkedaM,KatsumataR.HyperproductionoftryptophanbyCorynebacteriumglutamicumwiththemodifiedpentosephosphatepathway[J]Appliedandenvironmentalmicrobiology,1999,51(2)201-206)通過代謝途徑分析，發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)色氨酸的谷氨酸棒桿菌PIK9960中過表達(dá)tktA可增加磷酸戊糖途徑中E4P的量，從而提高芳香族氨基酸生物合成產(chǎn)率，最終發(fā)酵80h色氨酸的產(chǎn)量可達(dá)到58g/L。在大腸桿菌方面，日本三樂公司從大腸桿菌K12中取出色氨酸操縱子，組合于載體質(zhì)粒后，導(dǎo)入大腸桿菌3110，轉(zhuǎn)化株經(jīng)NTG誘變，得到質(zhì)粒穩(wěn)定的6-FT抗性株，再附加8-氮鳥嘌呤抗性，成功選育出L-色氨酸高產(chǎn)株，菌體以葡萄糖和鄰氨基苯甲酸為原料進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)120h后，產(chǎn)量可達(dá)40.3g/L；Berry(BerryA.ImprovingproductionofaromaticcompoundsinEscherichiacolibymetabolicengineering[J]TrendsBiotechnol，1996，14(7)250-256)克隆了編碼DAHP合成酶的aroG基因以及整個色氨酸操縱子，并對aroG和trpE基因進(jìn)一步改構(gòu)，在大腸桿菌中進(jìn)行高表達(dá)，發(fā)酵50h后，產(chǎn)量達(dá)45g/L;Park等(ParkYH,LimSJ,KimBH,etal.Ε.colimutantcontainingmutantgenesrelatedwithtryptophanbiosynthesisandproductionmethodoftryptophanbyusingthesame[P].U.S.2008:N0.0299644)通過誘變色氨酸合成途徑中的多個基因，成功選育出L-色氨酸的高產(chǎn)株CJ285，發(fā)酵61h后，L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)28.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為11.6%。盡管在前人的研究基礎(chǔ)上L-色氨酸的產(chǎn)量已有所提高，但還存在發(fā)酵周期長、糖酸轉(zhuǎn)化率低等問題，若要滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，還需要進(jìn)一步提高L-色氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，縮短發(fā)酵時間，從而降低生產(chǎn)成本。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種前體流加發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟1)菌種篩選取大腸桿菌基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325菌液(可購自美國菌種保藏中心)，用已滅過菌的pH為68的磷酸鹽緩沖液稀釋IO3IO6倍后涂布于LB平板，于3537°C培養(yǎng)1830h；從LB平板中挑選單菌落涂布于新的LB平板，于3537°C再培養(yǎng)1830h，將得到的單菌落用pH為68的磷酸鹽緩沖液振蕩稀釋，然后涂布于新的LB平板，于3537°C培養(yǎng)1830h后得到菌層，用LB培養(yǎng)基洗下菌層，然后將菌液加入到無菌保種管，按11比例加入40%的無菌甘油后于-20°C保存?zhèn)溆茫?)一級搖瓶種子將步驟1)得到的菌液以0.的接種量接種于裝有一級種子培養(yǎng)基的搖瓶中，于3537°C，以150250rpm培養(yǎng)1020h；3)二級發(fā)酵罐種子將步驟2)得到的一級搖瓶種子以10%的接種量接種于裝有二級種子培養(yǎng)基的種子罐中，控制風(fēng)量612L/min，轉(zhuǎn)速300500rpm，溫度35370C，罐壓0.050.08MPa,pH值通過氨水控制在6.57.0，培養(yǎng)1020h；4)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟3)得到的二級發(fā)酵罐種子以10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，控制風(fēng)量1530L/min，轉(zhuǎn)速300700rpm，溫度3537°C，罐壓0.050.08MPa,pH值通過氨水控制在6.57.0；流加葡萄糖濃度為500600g/L，采用低糖補料的方法，維持溶氧在10%30%，同時在菌體進(jìn)入對數(shù)期時開始流加濃度為200300g/L的鄰氨基苯甲酸，初始流加速度為0.10.3g/L/h，之后逐漸增大，至發(fā)酵結(jié)束時流加速度為0.60.8g/L/h，發(fā)酵周期3040h，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸產(chǎn)量4050g/L，鄰氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化量68g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率20%22%。在步驟1)中，所述LB培養(yǎng)基的組成可為酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂1520g/L,鹽酸四環(huán)素10100mg/L,滅菌前pH值7.27.5。在步驟2)中，所述一級種子培養(yǎng)基的組成可為磷酸氫二鉀1530g/L，酵母粉1020g/L，磷酸二氫鉀618g/L，硫酸銨210g/L，七水硫酸鎂15g/L，葡萄糖2040g/L，鹽酸四環(huán)素10100mg/L，滅菌前pH值7.27.5。在步驟3)中，所述二級種子培養(yǎng)基的組成可為磷酸氫二鉀28g/L，酵母粉15g/L，七水硫酸鎂15g/L，硫酸銨15g/L，檸檬酸三鈉二水物15g/L，葡萄糖2050g/L。在步驟4)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可為磷酸氫二鉀515g/L，酵母粉15g/L，七水硫酸鎂15g/L，硫酸銨15g/L，檸檬酸15g/L，硫酸亞鐵50200mg/L，葡萄糖1030g/L。本發(fā)明通過大腸桿菌基因工程菌(Ε.coliK12W3110)ATCC27325發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸，采用前體流加的發(fā)酵工藝，有效地提高了L-色氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，能夠在較短發(fā)酵周期內(nèi)實現(xiàn)L-色氨酸的高產(chǎn)量積累，最終L-色氨酸產(chǎn)量可達(dá)4050g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率20%22%(接近理論轉(zhuǎn)化值22.7%)，同時發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)工藝簡單，可滿足工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸的要求，具有很大的應(yīng)用前景。圖1為實施例1中L-色氨酸基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325在發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)L-色氨酸的過程曲線。在圖1中，橫坐標(biāo)為時間Cultivationtime(h)，左縱坐標(biāo)為菌體OD值OD66tl(〇)和L-色氨酸產(chǎn)量L-Trp(g/L)(★)，第一右縱坐標(biāo)為殘?zhí)橇縍G(g/L)()，第二右縱坐標(biāo)為溶氧DO(%)(-)。圖2為實施例2中L-色氨酸基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325在發(fā)酵培養(yǎng)基中流加前體生產(chǎn)L-色氨酸的過程曲線。在圖2中，橫坐標(biāo)為時間Cultivationtime(h)，左縱坐標(biāo)為菌體OD值OD66tl(〇)和L-色氨酸產(chǎn)量L-Trp(g/L)(★)，第一右縱坐標(biāo)為殘?zhí)橇縍G(g/L)()，第二右縱坐標(biāo)為溶氧DO(%)(-)。圖3為實施例3中L-色氨酸基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325在發(fā)酵培養(yǎng)基中流加前體生產(chǎn)L-色氨酸的過程曲線。在圖3中，橫坐標(biāo)為時間Cultivationtime(h)，左縱坐標(biāo)為菌體OD值OD66tl(〇)和L-色氨酸產(chǎn)量L-Trp(g/L)(★)，第一右縱坐標(biāo)為殘?zhí)橇縍G(g/L)()，第二右縱坐標(biāo)為溶氧DO(%)(-)。具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例11)菌種篩選打開冷凍甘油管，取15yL的大腸桿菌基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325菌液，用已滅過菌的pH為7的磷酸鹽緩沖液稀釋IO4倍；取200μL稀釋液涂布于LB平板，于37°C培養(yǎng)20h；從LB平板中挑選單菌落涂布于新的LB平板，以便得到新的單菌落，于37°C培養(yǎng)20h；將最終得到的單菌落用pH為7的磷酸鹽緩沖液ImL振蕩稀釋，取200μL稀釋液涂布于新的LB平板以便得到菌層，于37°C培養(yǎng)20h；最后用3mL的LB培養(yǎng)基洗下菌層，然后將菌液加入到空的無菌保種管，按11比例加入40%的無菌甘油；甘油管-20°C保存?zhèn)溆?。LB平板培養(yǎng)基組成為酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂15g/L，鹽酸四環(huán)素20mg/L，滅菌前pH值7.2。2)一級搖瓶種子將步驟1)中的甘油管，以0.的接種量接種于裝有75mL—級種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于37°C，以150rpm培養(yǎng)12h。一級搖瓶種子培養(yǎng)基組成為磷酸氫二鉀20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氫鉀10g/L，硫酸銨4g/L，七水硫酸鎂3g/L，葡萄糖20g/L，鹽酸四環(huán)素20mg/L，滅菌前pH值7.2。3)二級發(fā)酵罐種子將步驟2)的一級搖瓶種子，以1%的接種量接種于裝有6L二級種子培養(yǎng)基的IOL種子罐中，培養(yǎng)過程中，風(fēng)量控制在6L/min，轉(zhuǎn)速控制在300rpm，溫度控制在37°C，罐壓保持在0.05MPa,pH值通過氨水控制在7.0,培養(yǎng)12h。二級發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基組成為磷酸氫二鉀4g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸鎂2g/L，硫酸銨2g/L，檸檬酸三鈉二水物4g/L，葡萄糖50g/L。4)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟3)的二級發(fā)酵罐種子，以5%的接種量接種于裝有15L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵過程中，風(fēng)量控制在15L/min，轉(zhuǎn)速控制在300600rpm，溫度控制在37°C，罐壓保持在0.05MPa,pH值通過氨水控制在7.0；流加葡萄糖濃度為500g/L，采用低糖補料的方法，維持溶氧在1030%;發(fā)酵周期36h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為磷酸氫二鉀5g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸鎂4g/L，硫酸銨4g/L，檸檬酸lg/L，硫酸亞鐵50mg/L，葡萄糖20g/L。采用液相色譜對產(chǎn)物進(jìn)行測定，HPLC流動相按體積比，0.15%磷酸二氫鈉甲醇=8515。色譜條件為色譜柱C180DS；柱溫36°C；檢測器DAD(HP1200)；檢測波長:278nm；流速lmL/min；進(jìn)樣量20μL。由圖1的發(fā)酵過程曲線可知，通過發(fā)酵罐培養(yǎng)36h，最終L-色氨酸的產(chǎn)量積累可達(dá)30g/L，而糖酸轉(zhuǎn)化率為14%。實施例21)菌種篩選打開冷凍甘油管，取15μL的ATCC27325菌液，用已滅過菌的pH為7的磷酸鹽緩沖液稀釋IO4倍；取200μL稀釋液涂布于LB平板，于37°C培養(yǎng)20h；從LB平板中挑選單菌落涂布于新的LB平板，以便得到新的單菌落，于37°C培養(yǎng)20h；將最終得到的單菌落用PH為7的磷酸鹽緩沖液ImL振蕩稀釋，取200μL稀釋液涂布于新的LB平板以便得到菌層，于37°C培養(yǎng)20h；最后用3mL的LB培養(yǎng)基洗下菌層，然后將菌液加入到空的無菌保種管，按11比例加入40%的無菌甘油；甘油管-20°C保存?zhèn)溆?。LB平板培養(yǎng)基組成為酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂15g/L，鹽酸四環(huán)素20mg/L，滅菌前pH值7.2。2)一級搖瓶種子將步驟1)中的甘油管，以0.的接種量接種于裝有75mL—級種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于37°C，以150rpm培養(yǎng)12h。一級搖瓶種子培養(yǎng)基組成為磷酸氫二鉀20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氫鉀10g/L，硫酸銨4g/L，七水硫酸鎂3g/L，葡萄糖20g/L，鹽酸四環(huán)素20mg/L，滅菌前pH值7.2。3)二級發(fā)酵罐種子將步驟2)的一級搖瓶種子，以1%的接種量接種于裝有6L二級種子培養(yǎng)基的10L種子罐中，培養(yǎng)過程中，風(fēng)量控制在6L/min，轉(zhuǎn)速控制在300rpm，溫度控制在37°C，罐壓保持在0.05MPa,pH值通過氨水控制在7.0,培養(yǎng)12h。二級發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基組成為磷酸氫二鉀4g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸鎂2g/L，硫酸銨2g/L，檸檬酸三鈉二水物4g/L，葡萄糖50g/L。4)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟3)的二級發(fā)酵罐種子，以5%的接種量接種于裝有15L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵過程中，風(fēng)量控制在15L/min，轉(zhuǎn)速控制在300600rpm，溫度控制在37°C，罐壓保持在0.05MPa,pH值通過氨水控制在7.0；流加葡萄糖濃度為500g/L，采用低糖補料的方法，維持溶氧在10%30%;同時在菌體進(jìn)入對數(shù)期時開始流加濃度為200g/L的鄰氨基苯甲酸，初始流加速度為0.3g/L/h，之后逐漸增大，至發(fā)酵結(jié)束時流加速度為0.8g/L/h。發(fā)酵周期36h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為磷酸氫二鉀5g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸鎂4g/L，硫酸銨4g/L，檸檬酸lg/L，硫酸亞鐵50mg/L，葡萄糖20g/L。液相色譜的測定條件同實施例1，由圖2發(fā)酵過程曲線可知，通過發(fā)酵罐培養(yǎng)36h，最終L-色氨酸的產(chǎn)量積累可達(dá)40g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為20%。而L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率相對于實施例1中沒有流加前體的結(jié)果分別提高了33.3%和42.9%。實施例31)菌種篩選打開冷凍甘油管，取15μL的ATCC27325菌液，用已滅過菌的pH為7的磷酸鹽緩沖液稀釋IO4倍；取200μL稀釋液涂布于LB平板，于37°C培養(yǎng)24h；從LB平板中挑選單菌落涂布于新的LB平板，以便得到新的單菌落，于37°C培養(yǎng)24h；將最終得到的單菌落用PH為7的磷酸鹽緩沖液ImL振蕩稀釋，取200μL稀釋液涂布于新的LB平板以便得到菌層，于37°C培養(yǎng)24h；最后用3mL的LB培養(yǎng)基洗下菌層，然后將菌液加入到空的無菌保種管，按11比例加入40%的無菌甘油；甘油管-20°C保存?zhèn)溆谩B平板培養(yǎng)基組成為酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂15g/L，鹽酸四環(huán)素20mg/L，滅菌前pH值7.2。2)一級搖瓶種子將步驟1)中的甘油管，以0.的接種量接種于裝有75mL—級種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于37°C，以150rpm培養(yǎng)15h。一級搖瓶種子培養(yǎng)基組成為磷酸氫二鉀20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氫鉀10g/L，硫酸銨4g/L，七水硫酸鎂3g/L，葡萄糖20g/L，鹽酸四環(huán)素20mg/L，滅菌前pH值7.2。3)二級發(fā)酵罐種子將步驟2)的一級搖瓶種子，以1%的接種量接種于裝有6L二級種子培養(yǎng)基的IOL種子罐中，培養(yǎng)過程中，風(fēng)量控制在8L/min，轉(zhuǎn)速控制在400rpm，溫度控制在37°C，罐壓保持在0.05MPa,pH值通過氨水控制在7.0,培養(yǎng)12h。二級發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基組成為磷酸氫二鉀4g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸鎂2g/L，硫酸銨2g/L，檸檬酸三鈉二水物4g/L，葡萄糖50g/L。4)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟3)的二級發(fā)酵罐種子，以10%的接種量接種于裝有15L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵過程中，風(fēng)量控制在20L/min，轉(zhuǎn)速控制在400700rpm，溫度控制在37°C，罐壓保持在0.05MPa,pH值通過氨水控制在7.0；流加葡萄糖濃度為500g/L，采用低糖補料的方法，維持溶氧在10%30%;同時在菌體進(jìn)入對數(shù)期時開始流加濃度為200g/L的鄰氨基苯甲酸，初始流加速度為0.3g/L/h，之后逐漸增大，至發(fā)酵結(jié)束時流加速度為0.8g/L/h。發(fā)酵周期36h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為磷酸氫二鉀5g/L，酵母粉lg/L，七水硫酸鎂4g/L，硫酸銨4g/L，檸檬酸lg/L，硫酸亞鐵50mg/L，葡萄糖20g/L。液相色譜的測定條件同實施例1，由圖3發(fā)酵過程曲線可知，通過發(fā)酵罐培養(yǎng)36h，最終L-色氨酸的產(chǎn)量積累可達(dá)47g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為22%。而L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率相對于實施例1中沒有流加前體的結(jié)果分別提高了56.7%和57.1%。權(quán)利要求前體流加發(fā)酵生產(chǎn)L色氨酸的方法，其特征在于包括以下步驟1)菌種篩選取大腸桿菌基因工程菌(E.coliK12W3110)ATCC27325菌液，用已滅過菌的pH為6～8的磷酸鹽緩沖液稀釋103～106倍后涂布于LB平板，于35～37℃培養(yǎng)18～30h；從LB平板中挑選單菌落涂布于新的LB平板，于35～37℃再培養(yǎng)18～30h，將得到的單菌落用pH為6～8的磷酸鹽緩沖液振蕩稀釋，然后涂布于新的LB平板，于35～37℃培養(yǎng)18～30h后得到菌層，用LB培養(yǎng)基洗下菌層，然后將菌液加入到無菌保種管，按1∶1比例加入40％的無菌甘油后于20℃保存?zhèn)溆茫?)一級搖瓶種子將步驟1)得到的菌液以0.1％～1％的接種量接種于裝有一級種子培養(yǎng)基的搖瓶中，于35～37℃，以150～250rpm培養(yǎng)10～20h；3)二級發(fā)酵罐種子將步驟2)得到的一級搖瓶種子以1％～10％的接種量接種于裝有二級種子培養(yǎng)基的種子罐中，控制風(fēng)量6～12L/min，轉(zhuǎn)速300～500rpm，溫度35～37℃，罐壓0.05～0.08MPa，pH值通過氨水控制在6.5～7.0，培養(yǎng)10～20h；4)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟3)得到的二級發(fā)酵罐種子以1％～10％的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，控制風(fēng)量15～30L/min，轉(zhuǎn)速300～700rpm，溫度35～37℃，罐壓0.05～0.08MPa，pH值通過氨水控制在6.5～7.0；流加葡萄糖濃度為500～600g/L，采用低糖補料的方法，維持溶氧在10％～30％，同時在菌體進(jìn)入對數(shù)期時開始流加濃度為200～300g/L的鄰氨基苯甲酸，初始流加速度為0.1～0.3g/L/h，之后逐漸增大，至發(fā)酵結(jié)束時流加速度為0.6～0.8g/L/h，發(fā)酵周期30～40h，產(chǎn)物L(fēng)色氨酸產(chǎn)量40～50g/L，鄰氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化量6～8g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率20％～22％。2.如權(quán)利要求1所述的前體流加發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于上述步驟1)中，所述LB培養(yǎng)基的組成為酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂1520g/L，鹽酸四環(huán)素10100mg/L，滅菌前pH值7.27.5。3.如權(quán)利要求1所述的前體流加發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于上述步驟2)中，所述一級種子培養(yǎng)基的組成為磷酸氫二鉀1530g/L，酵母粉1020g/L，磷酸二氫鉀618g/L，硫酸銨210g/L，七水硫酸鎂15g/L，葡萄糖2040g/L，鹽酸四環(huán)素10100mg/L,滅菌前pH值7.27.5。4.如權(quán)利要求1所述的前體流加發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于上述步驟3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為磷酸氫二鉀28g/L，酵母粉15g/L，七水硫酸鎂15g/L，硫酸銨15g/L，檸檬酸三鈉二水物15g/L，葡萄糖2050g/L。5.如權(quán)利要求1所述的前體流加發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于上述步驟4)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為磷酸氫二鉀515g/L，酵母粉15g/L，七水硫酸鎂15g/L，硫酸銨15g/L，檸檬酸15g/L，硫酸亞鐵50200mg/L，葡萄糖1030g/L。全文摘要前體流加發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，涉及L-色氨酸。先對ATCC27325進(jìn)行篩選，制作成冷凍甘油管，然后接種于一級搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)成一級種子，再接種于種子罐中培養(yǎng)成二級種子，最后接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵采用在菌體進(jìn)入對數(shù)期時開始流加濃度為200～300g/L的鄰氨基苯甲酸，初始流加速度為0.1～0.3g/L/h，之后逐漸增大，至發(fā)酵結(jié)束時流加速度為0.6～0.8g/L/h。采用發(fā)酵法生產(chǎn)的L-色氨酸的產(chǎn)量可達(dá)40～50g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率20％～22％，且發(fā)酵周期短，生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)成本低，可滿足工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸的要求，具有很大的應(yīng)用前景。文檔編號C12P13/22GK101985638SQ201010579428公開日2011年3月16日申請日期2010年12月1日優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日發(fā)明者凌雪萍,盧英華,姚傳義,敬科舉,謝友坪申請人:廈門大學(xué)