動物器官人源化的方法及人-動物嵌合體模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種動物器官人源化的方法，其通過使用高效的DTA作為毒性基因產(chǎn)物，構(gòu)建DTA-Cre雙轉(zhuǎn)基因動物，植入該雙轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)的人體干細胞，可以發(fā)育成人的體細胞，部分或完全替代動物體內(nèi)原內(nèi)臟或血液，達到人體細胞部分或完全替代動物體內(nèi)目標臟器或血液的效果，并且通過使用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控，可以嚴密控制毒性DTA的表達。通過上述方法構(gòu)建的人-動物嵌合體代替?zhèn)鹘y(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠，操作簡便。此外，本發(fā)明還涉及一種使用上述動物器官人源化的方法構(gòu)建得到的人-動物嵌合體模型。
【專利說明】動物器官人源化的方法及人-動物嵌合體模型

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種動物器官人源化的方法及使用該方法構(gòu)建的人-動物嵌合體模型。

【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(!fepatitis B virus，HBV)屬于嗜肝病毒科，嗜肝病毒都有較強的種屬特異性和組織特異性。例如人類乙肝病毒的自然宿主只有人類和少數(shù)非人靈長類動物(如黑猩猩)，通常只侵犯宿主的肝臟組織。醫(yī)學(xué)實驗中最常用的實驗動物小鼠因其肝臟無法感染HBV而限制了在這一研究領(lǐng)域的使用。而人與動物嵌合肝臟模型正好能夠解決這一難題，因為這種模型動物可以在自然情況下感染HBV。除用于HBV研究，這一模型還可以精確地測量抗HBV載體的效能。除應(yīng)用于HBV的研究，人和動物的嵌合肝臟還可以應(yīng)用于其他很多方面，包括人類肝細胞的生產(chǎn)和人工肝移植等。
[0003]肝臟有一個顯著的特點，即肝細胞具有增殖的潛力。在部分肝切除后，或在病毒性肝炎中發(fā)生散在的肝細胞細胞死亡時，肝細胞的增殖可以彌補肝臟細胞的損失直到肝臟回復(fù)原狀。肝臟細胞群的這一生理控制機制已經(jīng)被用來制造人與動物嵌合肝臟:建立一種宿主肝細胞慢性死亡機制，從而產(chǎn)生一個增值信號來刺激移植進來的人類肝細胞。目前已有兩個動物模型建立在這種機制之上，即尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogenactivator, uPA)轉(zhuǎn)基因小鼠模型和富馬酰乙酰乙酸水解酶(fumaryl acetoacetatehydrolase，F(xiàn)AH)基因敲除小鼠模型。肝細胞中uPA通常存在低水平的表達，過量的表達將導(dǎo)致細胞毒性從而摧毀宿主細胞。在轉(zhuǎn)基因uPA模型中，白蛋白基因啟動子驅(qū)動多拷貝的uPA基因，合成致毒劑量的uPA蛋白，結(jié)果導(dǎo)致宿主慢性肝細胞死亡。在FAH模型中，因為敲除了絡(luò)氨酸異化通路中的一個基因FAH，引起毒性代謝物尿激酶型纖溶酶逐漸累積從而導(dǎo)致宿主慢性肝壞死。雖然上述兩個模型中一致的人肝細胞可以填補替代高達70%的宿主肝臟，但由于毒性產(chǎn)物累計造成子代頻繁死亡而使得這兩種模型難以傳代。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，有必要提供一種可以較為容易傳代的且可以完全替代動物器官的動物器官人源化的方法及使用該方法構(gòu)建的人-動物嵌合體。
[0005]一種動物器官人源化的方法，包括如下步驟:
[0006]構(gòu)建含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物以及含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物，其中，所述含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物的啟動子與DTA基因被兩個LoxP和一個停止序列隔開，由所述LoxP加上停止序列抑制表達，所述含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物的Cre基因的啟動子由轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)特異性啟動子啟動的四環(huán)素依賴的反式作用子啟動；
[0007]將所述含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物與所述含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物雜交，并對雜交后代進行基因篩選得到含有Cre基因及DTA基因的雙轉(zhuǎn)基因動物；
[0008]向所述含有Cre基因及DTA基因的雙轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)植入人體干細胞，制得含有人體細胞的雙轉(zhuǎn)基因動物；
[0009]對含有人體細胞的雙轉(zhuǎn)基因動物喂食或注射四環(huán)素或四環(huán)素衍生物，誘導(dǎo)表達Cre,從而介導(dǎo)兩個Loxp位點的重組，移除停止序列，啟動子接近并啟動表達DTA基因，殺死動物體內(nèi)目標細胞，促進人源性細胞的增生，得到人-動物嵌合體模型。
[0010]在其中一個實施例中，所述含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物為由R0SA26啟動子啟動表達的含有LoxP停止序列及DTA基因的動物，所述LoxP停止序列位于所述R0SA26啟動子與所述DTA基因之間。
[0011 ] 在其中一個實施例中，所述含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物在所述R0SA26啟動子之后依次含有如下序列:SA剪接受體序列、LoxP停止序列、eGFP序列盒、pFK-Neo序列盒、3個SV40poly A序列、LoxP停止序列及DTA基因序列。
[0012]在其中一個實施例中,所述動物體內(nèi)特異性啟動子為動物肝臟特異性啟動子白旦白基因啟動子(albumin gene promoter, Alb),所述人體干細胞為人肝臟干細胞。
[0013]在其中一個實施例中，所述含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物是一種TetOn調(diào)控系統(tǒng)，其中TetOn調(diào)控系統(tǒng)所表達的反向四環(huán)素依賴的反式作用子由所述啟動子Alb啟動表達，所述Cre重組酶序列位于由所述反向四環(huán)素依賴的反式作用子啟動的hCMV啟動子之后且可由所述hCMV啟動子啟動表達。
[0014]在其中一個實施例中，所述動物體內(nèi)特異性啟動子為動物造血干細胞特異性基因啟動子，所述人體干細胞為人造血干細胞。
[0015]在其中一個實施例中，所述動物為小鼠、豬或山羊。
[0016]一種由上述任一實施例所述的動物器官人源化的方法構(gòu)建的人-動物嵌合體。
[0017]上述動物器官人源化的方法構(gòu)建得到的人-動物嵌合體模型使用高效的DTA (白喉毒素)作為毒性基因產(chǎn)物，構(gòu)建DTA-Cre雙轉(zhuǎn)基因動物，植入該雙轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)的人體干細胞，可以發(fā)育成人的體細胞，部分或完全替代動物體內(nèi)原內(nèi)臟或血液，達到人體細胞部分或完全替代動物體內(nèi)目標臟器或血液的效果，并且通過使用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控，可以嚴密控制毒性DTA的表達。通過上述方法構(gòu)建的人-動物嵌合體代替?zhèn)鹘y(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠，操作簡便。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物的基因片段示意圖；
[0019]圖2為含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物的基因片段示意圖；
[0020]圖3為Cre表達后的含有Cre基因及DTA基因的雙轉(zhuǎn)基因動物的基因片段示意圖。

【具體實施方式】
[0021]下面主要結(jié)合附圖對發(fā)明的動物器官人源化的方法及由該方法構(gòu)建得到的人-動物嵌合體作進一步詳細的說明。
[0022]一實施方式的動物器官人源化的方法，包括如下步驟:
[0023]步驟一:構(gòu)建含有DTA (diphtheria tosin，白喉毒素)基因的轉(zhuǎn)基因動物以及含有Cre (Crerecombinase,來源于Pl曬菌體的一種整合酶)基因的轉(zhuǎn)基因動物。其中，含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物的啟動子與DTA基因被兩個LoxP重組序列及停止序列隔開，由LoxP加上停止序列抑制表達，含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物的Cre基因的啟動子由轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)特異性啟動子啟動的四環(huán)素依賴的反式作用子啟動。
[0024]本實施方式所述的動物可以是小鼠、豬或山羊等實驗動物。
[0025]在本實施方式中，該含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物為由R0SA26啟動子啟動表達DTA基因的動物，LoxP停止序列位于R0SA26啟動子與DTA基因之間。如圖1所示，具體該含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物在R0SA26啟動子之后依次含有如下序列:SA剪接受體序列、LoxP停止序列、eGFP序列盒、pFK-Neo序列盒、3個SV40poly A序列(three poly A,簡稱tpA)、LoxP停止序列及DTA基因序列。在正常狀態(tài)下，由于LoxP停止序列的存在，DTA基因沉默不表達DTA。
[0026]動物體內(nèi)特異性啟動子可以為動物肝臟特異性啟動子Alb或動物造血干細胞特異性基因啟動子等，對應(yīng)地，后續(xù)步驟植入的人體干細胞可以為人肝臟干細胞或造血干細胞等。可以理解，該動物體內(nèi)特異性啟動子還可以為動物其他內(nèi)臟器官的特異性啟動子，后續(xù)步驟植入的人體細胞可以為對應(yīng)的人體其他內(nèi)臟器官細胞。
[0027]具體在本實施方式中，如圖2所示，該含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物是一種TetOn調(diào)控系統(tǒng),其中TetOn調(diào)控系統(tǒng)所表達的反向四環(huán)素依賴的反式作用子(reversetetracycline-responsive transactivator, rtTA)由動物肝臟特特異性啟動子 Alb 啟動表達。Cre重組酶序列位于由反向四環(huán)素依賴的反式作用子啟動的hCMV啟動子之后且可由hCMV啟動子啟動表達。hCMV的啟動依賴于rtTA表達的TetO基因序列的表達。因此，當向該動物喂食或注射四環(huán)素或四環(huán)素衍生物后，TetO基因序列表達，從而啟動hCMV啟動子，進一步啟動Cre重組酶序列的表達Cre重組酶。
[0028]步驟二:將含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物與含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物雜交，并對雜交后代進行基因篩選得到含有Cre基因及DTA基因的雙轉(zhuǎn)基因動物。
[0029]步驟三:向含有Cre基因及DTA基因的雙轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)植入人體干細胞，制得含有人體細胞的雙轉(zhuǎn)基因動物。
[0030]步驟四:對含有人體細胞的雙轉(zhuǎn)基因動物喂食或注射四環(huán)素或四環(huán)素衍生物，得到人-動物嵌合體模型。
[0031]當向該雙轉(zhuǎn)基因動物喂食或注射四環(huán)素或四環(huán)素衍生物(如強力毒素DOX等)后，Cre基因表達Cre重組酶，該Cre重組酶可以引起兩個LoxP位點之間的基因序列發(fā)生重組，LoxP停止序列被去除，如圖3所示，從而表達DTA引起宿主目標細胞的死亡。通過調(diào)控喂食或注射的四環(huán)素或四環(huán)素衍生物的量，可以部分或完全去除宿主體內(nèi)的目標細胞，而讓植入的人體細胞得到繁衍并完全替代宿主體內(nèi)目標細胞。
[0032]該動物器官人源化的方法構(gòu)建得到的人-動物嵌合體模型使用高效的DTA (白喉毒素)作為毒性基因產(chǎn)物替代傳統(tǒng)的uPA和FHA，可以完全去除動物體內(nèi)目標臟器或血液細胞，達到人體細胞完全替代動物體內(nèi)目標臟器或血液的效果，并且通過使用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控，可以嚴密控制毒性DTA的表達。通過上述方法構(gòu)建的人-動物嵌合體代替?zhèn)鹘y(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠，操作簡便。
[0033]通過該方法獲得的人-動物嵌合體模型可以作為HBV的研究模型進行HBV的發(fā)病和治療研究，此外，該人-動物嵌合體還可以應(yīng)用在其他眾多領(lǐng)域，如:
[0034](I)人類肝細胞來源:人類原代肝細胞在體外難以培養(yǎng)和傳代，應(yīng)用上述人-動物嵌合體模型就可以在動物的體內(nèi)不斷地生成人類肝細胞。如果用體型較大的動物制作模型，即可以為人類的肝臟移植提供充足的供體來源。
[0035](2)其它疾病模型:用患者自身的誘導(dǎo)多能干細胞(induced pleuripotent stemcell, iPS)代替臍帶血干細胞作為人源性細胞來源，可以制作患者特異性肝臟疾病動物模型，比如A型和B型血友病、高膽固醇血癥，從而大大促進對這些疾病的基因和細胞治療研究。
[0036](3)藥物代謝動力學(xué)研究。肝臟是人體內(nèi)主要的代謝器官，絕大部分的內(nèi)源性和外源性化合物都在肝內(nèi)進行代謝，而人類肝細胞內(nèi)的代謝酶系統(tǒng)與動物的明顯不同，所以該人-動物嵌合體的肝臟模型可以為人類的藥物代謝動力學(xué)研究提供一個便利的動物模型。
[0037](4)其它器官的人-動物嵌合模型。利用制作嵌合肝臟模型的原理，可以制作其它器官的嵌合模型，例如嵌合血液和免疫系統(tǒng)、嵌合心血管和神經(jīng)系統(tǒng)；還可以制作擁有兩個嵌合器官的轉(zhuǎn)基因動物，例如嵌合的肝臟和血液的雙嵌合器官動物模型，該雙嵌合器官動物模型將有利于研究人類免疫系統(tǒng)和許多病毒(例如HBV和HCV)的相互作用。
[0038]以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。
【權(quán)利要求】
1.一種動物器官人源化的方法，其特征在于，包括如下步驟: 構(gòu)建含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物以及含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物，其中，所述含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物的啟動子與DTA基因被兩個LoxP和一個停止序列隔開，由所述LoxP加上停止序列抑制表達，所述含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物的Cre基因的啟動子由轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)特異性啟動子啟動的四環(huán)素依賴的反式作用子啟動； 將所述含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物與所述含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物雜交，并對雜交后代進行基因篩選得到含有Cre基因及DTA基因的雙轉(zhuǎn)基因動物； 向所述含有Cre基因及DTA基因的雙轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)植入人體干細胞，制得含有人體細胞的雙轉(zhuǎn)基因動物； 對含有人體細胞的雙轉(zhuǎn)基因動物喂食或注射四環(huán)素或四環(huán)素衍生物，誘導(dǎo)表達Cre，從而介導(dǎo)兩個Loxp位點的重組,移除停止序列，啟動子接近并啟動表達DTA基因，殺死動物體內(nèi)目標細胞，促進人源性細胞的增生，得到人-動物嵌合體模型。
2.如權(quán)利要求1所述的動物器官人源化的方法，其特征在于，所述含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物為由R0SA26啟動子啟動表達的含有LoxP停止序列及DTA基因的動物，所述LoxP停止序列位于所述R0SA26啟動子與所述DTA基因之間。
3.如權(quán)利要求2所述的動物器官人源化的方法，其特征在于，所述含有DTA基因的轉(zhuǎn)基因動物在所述R0SA26啟動子之后依次含有如下序列:SA剪接受體序列、LoxP停止序列、eGFP序列盒、pFK-Neo序列盒、3個SV40polyA序列、LoxP停止序列及DTA基因序列。
4.如權(quán)利要求1所述的動物器官人源化的方法，其特征在于，所述動物體內(nèi)特異性啟動子為動物肝臟特異性啟動子白旦白基因啟動子，所述人體干細胞為人肝臟干細胞。
5.如權(quán)利要求4所述的動物器官人源化的方法，其特征在于，所述含有Cre基因的轉(zhuǎn)基因動物是一種TetOn調(diào)控系統(tǒng)，其中TetOn調(diào)控系統(tǒng)所表達的反向四環(huán)素依賴的反式作用子由所述啟動子Alb啟動表達，所述Cre重組酶序列位于由所述反向四環(huán)素依賴的反式作用子啟動的hCMV啟動子之后且可由所述hCMV啟動子啟動表達。
6.如權(quán)利要求1所述的動物器官人源化的方法，其特征在于，所述動物體內(nèi)特異性啟動子為動物造血干細胞特異性基因啟動子，所述人體干細胞為人造血干細胞。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的動物器官人源化的方法，其特征在于，所述動物為小鼠、豬或山羊。
8.一種由權(quán)利要求1-7中任一項所述的動物器官人源化的方法構(gòu)建的人-動物嵌合體模型。
【文檔編號】A01K67/027GK104419700SQ201310404844
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】陳志英, 何成宜, 張麗萍 申請人:深圳先進技術(shù)研究院