專利名稱：嵌合動(dòng)物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種嵌合動(dòng)物的制備方法。
背景技術(shù)：
抗體是一種可以高度專一地識(shí)別和結(jié)合抗原物質(zhì)的一種蛋白質(zhì)，是動(dòng)物抵御和清除外源病原體和內(nèi)源變異細(xì)胞的屏障。抗體作為疾病預(yù)防、診斷和治療藥物在臨床使用已有上百年的發(fā)展歷史，如中華人民共和國(guó)藥典2005年版(三部)收錄的基于特異抗體的藥物制劑有白喉抗毒素、破傷風(fēng)抗毒素、多價(jià)氣性壞疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇血清、抗炭疽血清和抗狂犬病血清等，這些抗體是通過超免疫注射馬匹獲得高效價(jià)抗血清，經(jīng)胃酶消化、鹽析提純、凍干后制成，有效成分為馬抗體的(Fab)2部分，作為異源蛋白馬抗體的(Fab)2注射給人體時(shí)易于引起過敏反應(yīng)，危害患者生命，因此，發(fā)展對(duì)人體沒有免疫反應(yīng)的人抗體生產(chǎn)技術(shù)具有重大的意義。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Tomizuka等在《Nature Genetics》(《自然遺傳學(xué)》，1997年16卷133頁(yè))上發(fā)表了題為“Functional expression and germlinetransmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice”(“一段人染色體片斷在崁合小鼠功能表達(dá)和在種系細(xì)胞中遺傳”)的論文提出如下技術(shù)方案將含人免疫球蛋白基因組座位的染色體片斷通過分子生物學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)入小鼠，同時(shí)對(duì)小鼠本身的內(nèi)源免疫球蛋白基因組座位(locus)進(jìn)行遺傳學(xué)操作進(jìn)行沉默，這樣的轉(zhuǎn)染色體小鼠從功能上能夠重組免疫球蛋白序列單元，表達(dá)各種人抗體。再用常規(guī)動(dòng)物免疫，即可達(dá)到小鼠生產(chǎn)的人抗體。但在這種轉(zhuǎn)染色體小鼠技術(shù)方案中，由于抗體基因組十分冗長(zhǎng)、其產(chǎn)生及調(diào)節(jié)極為復(fù)雜，操作過程極其復(fù)雜、周期長(zhǎng)、成功率低、難于普及應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種嵌合動(dòng)物的制備方法，使其簡(jiǎn)便易行、成本低、易成功、周期短、可在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)多種類型抗體。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括下列步驟
①準(zhǔn)備新鮮的人臍血細(xì)胞首先在無(wú)菌條件下用20ml的注射器抽吸斷臍后靠胎盤側(cè)的臍血(10-20ml)，然后將臍血在室溫下轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)小鼠胚胎需要注射100-200ul新鮮的人臍血細(xì)胞，不需要將人臍血干細(xì)胞進(jìn)行分離、純化；②注射于早期的動(dòng)物胚胎囊腔內(nèi)在無(wú)菌操作下，用注射器將100-200ul新鮮的人臍血細(xì)胞混懸液(上述轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的臍血)注射于早期小鼠胚胎囊腔內(nèi)，同時(shí)應(yīng)避免損傷動(dòng)物胚胎；③使注射后的早期小鼠胚胎繼續(xù)發(fā)育至新生動(dòng)物，最后發(fā)育至成年小鼠對(duì)孕有注射后胚胎的小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，并密切觀查，直至生出小鼠后代，然后使該小鼠后代發(fā)育為成年小鼠。
本發(fā)明的操作簡(jiǎn)單在無(wú)菌條件下，用注射器將新鮮的人臍血細(xì)胞注射于9-11天大小的小鼠胚胎囊腔內(nèi)，注射后的胚胎繼續(xù)發(fā)育至新生小鼠，最后發(fā)育至成年小鼠。用免疫方法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)測(cè)定顯示，在胚胎囊腔中注射人細(xì)胞的成年小鼠血液中存在成熟的人抗體，以及分泌人抗體的免疫細(xì)胞，一旦準(zhǔn)備出能夠產(chǎn)生人抗體的小鼠，本領(lǐng)域的科研人員就可以用傳統(tǒng)的動(dòng)物免疫技術(shù)免疫能夠產(chǎn)生人抗體的小鼠生產(chǎn)多克隆抗體，用B-細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體。
本發(fā)明的操作在大動(dòng)物，如馬、牛、豬，羊上更容易操作，因?yàn)檫@些大動(dòng)物的胚胎體積相對(duì)較大，更容易準(zhǔn)確將人細(xì)胞注射到胚胎囊腔內(nèi)，甚至胚胎囊腔中更精確的位置，從而準(zhǔn)備出可以產(chǎn)生人抗體的大動(dòng)物。在獲得本發(fā)明含人細(xì)胞崁合動(dòng)物的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域的科技人員就能夠常規(guī)的動(dòng)物免疫方法用各種抗原對(duì)含人細(xì)胞崁合動(dòng)物進(jìn)行免疫大規(guī)模制備抗原特異的人多克隆抗體；還可以利用常規(guī)的細(xì)胞融合技術(shù)，準(zhǔn)備人單克隆抗體。這些人抗體可以用于對(duì)人類疾病的預(yù)防和治療，避免動(dòng)物抗體給人體帶來(lái)的過敏和副作用，促進(jìn)人抗體藥物的開發(fā)。
本發(fā)明的制備方法具有下述優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便易行、成本低、易成功、周期短、能夠大規(guī)模制備特異的人源多克隆抗體，克服鼠源抗體人源化不足以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物操作復(fù)雜的困難，促進(jìn)人源單克隆抗體藥物的開發(fā)。(1)能夠大規(guī)模制備特異的人多克隆抗體，一方面避免直接用抗原免疫人體帶來(lái)的不適、副作用和潛在安全等風(fēng)險(xiǎn)，另一方面克服動(dòng)物抗體帶來(lái)的過敏和不能滿足部分過敏體質(zhì)人群的缺點(diǎn)；(2)能夠制備人源多克隆抗體，克服鼠源抗體人源化不足，以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物操作復(fù)雜的困難，促進(jìn)人源單克隆抗體藥物的開發(fā)。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如張龍翔、張庭芳、李令媛等人在《生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)(第二版)》(北京高等教育出版社，2001)和JohnM.Walker等人在《Theproteinprotocolshandbook(secondedition)》(《蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第二版)》)，totowa，NewJersey，HumanaPress，2002)中所述的條件。
實(shí)施例1小鼠1的操作過程在無(wú)菌條件下用20ml的注射器抽吸斷臍后靠胎盤側(cè)的臍血(10-20ml)，然后將臍血在室溫下轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌條件下，將上述從醫(yī)院轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的臍血倒入60平方毫米大小的平皿，用注射器直接從平皿中抽取100-200ul新鮮的人臍血細(xì)胞混懸液(來(lái)自上海市第五醫(yī)院)注射于9天大小的小鼠胚胎(C57BL/6與昆明小鼠雜交后的胚胎)的囊腔內(nèi)，并讓此胚胎繼續(xù)發(fā)育至新生小鼠，最后發(fā)育至成年小鼠，標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)小鼠1。
免疫熒光組織化學(xué)鑒定從成年實(shí)驗(yàn)小鼠1和未經(jīng)過任何操作的小鼠(陰性對(duì)照)的尾中各取一滴血滴在載玻片上，做成血涂片，分別編號(hào)，用甲醇固定5分鐘，用PBS緩沖液(pH7.2～7.4，含NaCl 137mmol/L、KCl2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L)漂洗3次，用0.1％的胰蛋白酶(100ml0.1mg胰蛋白酶，含0.1％氯化鈣)于37℃消化20分鐘，再經(jīng)PBS漂洗3次后，用1∶10的山羊血清于37℃封閉血涂片10分鐘；最后進(jìn)行熒光抗體染色(1)滴加MouseAnti-HumanIgG(鼠抗人IgG)(γchainspecific，1∶10稀釋)第一抗體，于4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，然后用PBS充分沖洗；(2)在血涂片上滴加山羊抗鼠lgG-FITC(1∶100稀釋)第二抗體，于37℃濕盒中孵育30分鐘，然后用PBS漂洗；(3)滴加DAPI(1∶10000稀釋)，于37℃濕盒中孵育20分鐘，用PBS漂洗、晾干、封片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)小鼠1出現(xiàn)特異性陽(yáng)性信號(hào)，陰性對(duì)照小鼠未出特異性信號(hào)。
人抗體蛋白水平鑒定剪小鼠尾，取一滴血，接入1.5毫升塑料離心管中，超聲破碎，用含0.9％NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH7.2)進(jìn)行稀釋至1/2、1/4和1/16，分別取0.5μl，點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，空氣中涼干。用空白小鼠血液樣品作陰性對(duì)照，人血液樣品作陽(yáng)性對(duì)照，經(jīng)過3％牛血清白蛋白封閉，與抗人IgG抗體的小鼠抗體-辣根過氧化酶(HRP，1∶16)孵育，DAB底物顯色，結(jié)果實(shí)驗(yàn)小鼠1在1/2、1/4兩個(gè)稀釋濃度，陽(yáng)性對(duì)照都出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，空白小鼠未出信號(hào)。
人抗體K鏈基因鑒定針對(duì)人的抗體的K鏈基因設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物IgGLKf-r上游引物5’-gtggctgcaccatctgtcttcatc-3’，下游引物5’-ctaacactctcccctgtt-3’；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系(50μL)為10×superTaq緩沖液III10μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，superTaq酶(5U/μL)(申能博采，上海)0.5μL，重蒸水32μL；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件為94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，40個(gè)循環(huán)，最后循環(huán)為95℃1min，55℃1min，72℃延伸10min。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示混合人血的空白小鼠血液樣品，以及實(shí)驗(yàn)小鼠1血液樣品都擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為315bp的目標(biāo)條帶，而空白小鼠血液樣品未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
人抗體重鏈基因鑒定針對(duì)人的抗體重鏈基因設(shè)計(jì)引物，目標(biāo)條帶長(zhǎng)度127bp，上游引物5’-gactccgacggctccttcttcc-3’，下游引物5’-ggctcttctgcgtgtagtggttgt-3’；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系(50μL)為10×Taq聚合酶緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，Taq酶(5U/μL)(賽百盛，上海)0.5μL，重蒸水37μL；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件為94℃3min，94℃0.5min，58℃0.5min，72℃0.5min，40個(gè)循環(huán)，最后循環(huán)為95℃0.5min，58℃0.5min，72℃延伸10min。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在人血DNA樣品，含1％人血的空白小鼠血液樣品，以及實(shí)驗(yàn)小鼠1血液樣品都擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為127bp的目標(biāo)條帶，而空白小鼠血液樣品未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
實(shí)施例2小鼠2的操作過程在無(wú)菌條件下用20ml的注射器抽吸斷臍后靠胎盤側(cè)的臍血(10-20ml)，然后將臍血在室溫下轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌條件下，將上述從醫(yī)院轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的臍血倒入60平方毫米大小的平皿，用注射器直接從平皿中抽取100-200ul新鮮的人臍血細(xì)胞混懸液(來(lái)自上海市第五醫(yī)院)注射于11天大小的小鼠胚胎(C57BL/6與昆明小鼠雜交后的胚胎)的囊腔內(nèi)，并讓此胚胎繼續(xù)發(fā)育至新生小鼠，最后發(fā)育至成年小鼠，標(biāo)為實(shí)驗(yàn)小鼠2。
免疫熒光組織化學(xué)鑒定從成年實(shí)驗(yàn)小鼠2和未經(jīng)過任何操作的小鼠(陰性對(duì)照)的尾中各取一滴血滴在載玻片上，做成血涂片，分別編號(hào)，用甲醇固定5分鐘，用用PBS緩沖液(pH7.2～7.4，含NaCl137mmol/L、KCl2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L)漂洗3次，用0.1％的胰蛋白酶(100ml0.1mg胰蛋白酶，含0.1％氯化鈣)于37℃消化20分鐘，再經(jīng)PBS漂洗3次后，用1∶10的山羊血清于37℃封閉血涂片10分鐘，最后進(jìn)行熒光抗體染色(1)滴加MouseAnti-HumanIgG(鼠抗人IgG)(γchainspecific，1∶10稀釋)第一抗體，于4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，然后用PBS充分沖洗；(2)在血涂片上滴加山羊抗鼠lgG-FITC(1∶100稀釋)第二抗體，于37℃濕盒中孵育30分鐘，然后用PBS漂洗；(3)滴加DAPI(4’，6-diamidino-2-phenylindole，4’，6-二瞇基-2-苯基吲哚)(1∶10000稀釋)，于37℃濕盒中孵育20分鐘，用PBS漂洗、晾干、封片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)小鼠2出現(xiàn)特異性陽(yáng)性信號(hào)，陰性對(duì)照小鼠未出特異性信號(hào)。
人抗體蛋白水平鑒定剪小鼠尾，取一滴血，接入1.5毫升塑料離心管中，超聲破碎，用含0.9％NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH7.2)進(jìn)行稀釋至1/2、1/4、1/16，分別取0.5μl，點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，空氣中涼干；用空白小鼠血液樣品作陰性對(duì)照，人血液樣品作陽(yáng)性對(duì)照，經(jīng)過3％牛血清白蛋白封閉，與抗人IgG抗體的小鼠抗體-辣根過氧化酶(HRP，1∶16)孵育，DAB底物顯色，結(jié)果實(shí)驗(yàn)小鼠2在1/2，1/4兩個(gè)稀釋濃度，陽(yáng)性對(duì)照都出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，空白小鼠未出信號(hào)。
人抗體K鏈基因鑒定針對(duì)人的抗體的K鏈基因設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物IgGLKf-r上游引物5’-gtggctgcaccatctgtcttcatc-3’，下游引物5’-ctaacactctcccctgtt-3’；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系(50μL)為10xsuperTaq聚合酶緩沖液bufferIII10μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，superTaq酶(5U/μL)(申能博采，上海)0.5μL，重蒸水32μL；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件為94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，40個(gè)循環(huán)，最后循環(huán)為95℃1min，55℃1min，72℃延伸10min。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人血的空白小鼠血液樣品，以及實(shí)驗(yàn)小鼠2血液樣品都擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為315bp的目標(biāo)條帶，而空白小鼠血液樣品未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
人抗體重鏈基因鑒定針對(duì)人的抗體重鏈基因設(shè)計(jì)引物，目標(biāo)條帶長(zhǎng)度127bp，上游引物5’-gactccgacggctccttcttcc-3’，下游引物5’-ggctcttctgcgtgtagtggttgt-3’，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系(50μL)為10xTaq聚合酶緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，Taq酶(5U/μL)(賽百盛，上海)0.5μL，重蒸水37μL，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件為94℃3min，94℃0.5min，58℃0.5min，72℃0.5min，40個(gè)循環(huán)，最后循環(huán)為95℃0.5min，58℃0.5min，72℃延伸10min。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在人血DNA樣品，含1％人血的空白小鼠血液樣品，以及實(shí)驗(yàn)小鼠2血液樣品都擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為127bp的目標(biāo)條帶，而空白小鼠血液樣品未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
實(shí)施例3操作過程在無(wú)菌條件下用20ml的注射器抽吸斷臍后靠胎盤側(cè)的臍血(10-20ml)，然后將臍血在室溫下轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌條件下，將上述從醫(yī)院轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的臍血倒入60平方毫米大小的平皿，用注射器直接從平皿中抽取100-200ul新鮮的人臍血細(xì)胞(來(lái)自上海市第五醫(yī)院)注射于10天大小的小鼠胚胎(C57BL/6與昆明小鼠雜交后的胚胎)的囊腔內(nèi)，并讓此胚胎繼續(xù)發(fā)育至新生小鼠，最后發(fā)育至成年小鼠，標(biāo)為實(shí)驗(yàn)小鼠3。
免疫熒光組織化學(xué)鑒定從成年實(shí)驗(yàn)小鼠3和未經(jīng)過任何操作的小鼠(陰性對(duì)照)的尾中各取一滴血滴在載玻片上，做成血涂片，分別編號(hào)，用甲醇固定5分鐘，用用PBS緩沖液(pH7.2～7.4，含NaCl137mmol/L、KCl2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L)漂洗3次，用0.1％的胰蛋白酶(100ml0.1mg胰蛋白酶，含0.1％氯化鈣)于37℃消化20分鐘，再經(jīng)PBS漂洗3次后，用1∶10的山羊血清于37℃封閉血涂片10分鐘，最后進(jìn)行熒光抗體染色(1)滴加MouseAnti-HumanIgG(鼠抗人IgG)(γchainspecific，1∶10稀釋)第一抗體，于4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。然后用PBS充分沖洗；(2)在血涂片上滴加山羊抗鼠lgG-FITC(1∶100稀釋)第二抗體，于37℃濕盒中孵育30分鐘，然后用PBS漂洗；(3)滴加DAPI(1∶10000稀釋)，于37℃濕盒中孵育20分鐘，用PBS漂洗、晾干、封片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)小鼠3出現(xiàn)特異性陽(yáng)性信號(hào)，陰性對(duì)照小鼠未出特異性信號(hào)。
人抗體蛋白水平鑒定剪小鼠尾，取一滴血，接入1.5毫升塑料離心管中，超聲破碎，用含0.9％NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH7.2)稀釋至1/2、1/4、1/16，分別取0.5μl，點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，空氣中涼干。用空白小鼠血液樣品作陰性對(duì)照，人血液樣品作陽(yáng)性對(duì)照，經(jīng)過3％牛血清白蛋白封閉，與抗人IgG抗體的小鼠抗體-辣根過氧化酶(HRP，1∶16)孵育，DAB底物顯色，結(jié)果實(shí)驗(yàn)小鼠3在1/2，1/4兩個(gè)稀釋濃度，陽(yáng)性對(duì)照都出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，空白小鼠未出信號(hào)。
人抗體K鏈基因鑒定針對(duì)人的抗體的K鏈基因設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物IgGLKf-r上游引物5’-gtggctgcaccatctgtcttcatc-3’，下游引物5’-ctaacactctcccctgtt-3’；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系(50μL)為10xsuperTaq聚合酶緩沖液III10μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，superTaq酶(5U/μL)(申能博采，上海)0.5μL，重蒸水32μL；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件為94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，40個(gè)循環(huán)，最后循環(huán)為95℃1min，55℃1min，72℃延伸10min，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示混合人血的空白小鼠血液樣品，以及實(shí)驗(yàn)小鼠3血液樣品都擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為315bp的目標(biāo)條帶，而空白小鼠血液樣品未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
人抗體重鏈基因鑒定針對(duì)人的抗體重鏈基因設(shè)計(jì)引物，目標(biāo)條帶長(zhǎng)度127bp，上游引物5’-gactccgacggctccttcttcc-3’，下游引物5’-ggctcttctgcgtgtagtggttgt-3’。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系(50μL)為10xTaq聚合酶緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，Taq酶(5U/μL)(賽百盛，上海)0.5μL，重蒸水37μL；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件為94℃3min，94℃0.5min，58℃0.5min，72℃0.5min，40個(gè)循環(huán)，最后循環(huán)為95℃0.5min，58℃0.5min，72℃延伸10min。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在人血DNA樣品，含1％人血的空白小鼠血液樣品，以及實(shí)驗(yàn)小鼠3血液樣品都擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為127bp的目標(biāo)條帶，而空白小鼠血液樣品未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
權(quán)利要求
1.一種嵌合動(dòng)物的制備方法，其特征在于，具體步驟包括①準(zhǔn)備新鮮的人臍血細(xì)胞首先在無(wú)菌條件下用注射器抽吸斷臍后靠胎盤側(cè)的臍血，然后將臍血在室溫下轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；②注射于早期的動(dòng)物胚胎囊腔內(nèi)在無(wú)菌條件下，用注射器將上述轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的臍血注射于早期小鼠胚胎囊腔內(nèi)；③使注射后的早期小鼠胚胎繼續(xù)發(fā)育至新生動(dòng)物，最后發(fā)育至成年小鼠對(duì)孕有注射后胚胎的小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，直至生出小鼠后代，然后使該小鼠后代發(fā)育為成年小鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合動(dòng)物的制備方法，其特征是，步驟①中，所述的以注射器抽吸斷臍后靠胎盤側(cè)的臍血，抽吸的體積為10-20ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合動(dòng)物的制備方法，其特征是，步驟②中，所述的用注射器將上述轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的臍血注射于早期小鼠胚胎囊腔內(nèi)，注射的臍血為100-200ul。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合動(dòng)物的制備方法，其特征是，步驟②中，所述的早期小鼠胚胎，是指9-11天大小的小鼠胚胎。
全文摘要
一種嵌合動(dòng)物的制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法具體步驟包括①準(zhǔn)備新鮮的人臍血細(xì)胞首先在無(wú)菌條件下用注射器抽吸斷臍后靠胎盤側(cè)的臍血，然后將臍血在室溫下轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；②注射于早期的動(dòng)物胚胎囊腔內(nèi)在無(wú)菌條件下，用注射器將上述轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的臍血注射于早期小鼠胚胎囊腔內(nèi)；③使注射后的早期小鼠胚胎繼續(xù)發(fā)育至新生動(dòng)物，最后發(fā)育至成年小鼠對(duì)孕有注射后胚胎的小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，直至生出小鼠后代，然后使該小鼠后代發(fā)育為成年小鼠。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便易行、成本低、易成功、周期短、能夠大規(guī)模制備特異的人源多克隆抗體，可克服鼠源抗體人源化不足以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物操作復(fù)雜的困難，促進(jìn)人源單克隆抗體藥物的開發(fā)。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1994073SQ20061014822
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月28日
發(fā)明者吳際, 李榮秀 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)