專利名稱：：5,7,4'-三羥基-3',5'-二甲氧基黃酮的合成方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物除草和抗菌劑的合成，特別是一種5,7,4'-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃酮的合成方法和應(yīng)用，具體是從化感品種水稻0o;za^rfh;a丄.(PI312777)中分離得到的化感物質(zhì)一5,7，4'-三羥基-3',5'-二甲氧基黃酮(俗稱小麥黃素)的化學(xué)合成及其在抑制稻田雜草和抗菌方面的應(yīng)用。技術(shù)背景眾所周知，在水稻的生長過程中，稻田中經(jīng)常會(huì)有大量的雜草(譬如稗草等)伴生，與水稻爭(zhēng)奪養(yǎng)分，影響水稻的長勢(shì)；同時(shí)水稻也會(huì)受到各種病菌的侵害，導(dǎo)致水稻枯萎或死亡。一般來說，稻農(nóng)為了除掉雜草或抑制病菌，往往會(huì)噴施除草劑或殺菌劑。但是，噴施除草劑或殺菌劑之類的化學(xué)試劑，除了會(huì)增加生產(chǎn)成本之外，還會(huì)帶來農(nóng)藥殘留的健康問題以及對(duì)環(huán)境的不友好。有研究表明，施用除草劑或殺菌劑會(huì)危及稻田的生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境。1988夏季，美國水稻遺傳育種學(xué)家Dilday在一個(gè)受雜草嚴(yán)重侵染的田間觀察到個(gè)別水稻品種周圍的雜草被排擠的現(xiàn)象，研究認(rèn)為這種現(xiàn)象是由這些水稻的化感抑草作用而引起的，自此水稻化感作用的研究引起了世界各國政府和科學(xué)家的廣泛關(guān)注。例如，孔垂華,徐效華，胡飛，等發(fā)表的'以特征次生物質(zhì)為標(biāo)記評(píng)價(jià)水稻品種及單株的化感潛力'.科學(xué)通報(bào)，2002，47:203206。植物化感是指一個(gè)活體植物通過莖葉揮發(fā)、淋溶、根系分泌和分解等途徑向環(huán)境中釋放其產(chǎn)生的某些化學(xué)物質(zhì)，從而影響周圍植物的生長和發(fā)育。利用水稻的化感作用控制田間雜草不僅能有效提高水稻產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本和增加稻農(nóng)的收入，而且能避免化學(xué)除草劑對(duì)環(huán)境造成的危害，適應(yīng)農(nóng)作系統(tǒng)內(nèi)"三效"兼顧及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需求。除此之外，通過對(duì)化感物質(zhì)的合成和修飾，可以發(fā)展防止雜草、抑制病菌的生物調(diào)控物質(zhì)，開發(fā)對(duì)生態(tài)環(huán)境友好的農(nóng)藥化學(xué)品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種5,7,4'-三羥基-3',5'-二甲氧基黃酮的合成方法和應(yīng)用。5,7，4'-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃酮是從化感品種水稻C^za虛/vaL(PI312777)中分離得到的一種次生代謝物，經(jīng)生物活性測(cè)試表明其有明顯的抑制農(nóng)田稗草、異型莎草和碎米莎草生長和阻止稻瘟霉和立枯絲核菌的孢子萌發(fā)的作用。利用該物質(zhì)的化感作用可以在不向系統(tǒng)引入難降解的化學(xué)物質(zhì)的情況下，有效得抑制稻田雜草，提高水稻產(chǎn)量，從而避免施用農(nóng)藥造成的大量殘留所引發(fā)的一系列難以解決的問題，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。5，7,4'-三羥基-3',5'-二甲氧基黃酮(C17H1407)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>5,7,4-三羥基-3',5'-二甲氧基黃酮的合成合成路線為:具體步驟是1)乙醚作溶劑，苯三酚在氯化氫和氯化鋅存在下與乙腈用冰鹽浴冷卻攪拌反應(yīng)，冰箱中放置48小時(shí)，生成得固體產(chǎn)物用無水乙醚洗滌，然后將固體加熱回流水溶解，靜置，固體產(chǎn)物重結(jié)晶，得到化合物A(Hoesch反應(yīng))。2)紫丁香酸與氯芐在堿性的乙醇溶液中回流反應(yīng)2h。減壓旋去一半溶劑，剩余物用稀鹽酸酸化，析出產(chǎn)物用95%乙醇重結(jié)晶，得化合物B。3)化合物B在微量無水吡啶存在下于二氯亞砜中加熱回流2h,減壓除去溶劑,得化合物C。4)-78。C下，在含六甲基二硅胺鋰的THF中，化合物A與化合物C反應(yīng)，反應(yīng)液傾入HC1的冰水中，氯仿萃取，無水Na2S04干燥，減壓蒸去溶劑，制得化合物D。5)化合物D在冰醋酸和少量硫酸加熱條件下關(guān)環(huán)的同時(shí)脫去芐基得到目標(biāo)化合物E。其反應(yīng)式簡(jiǎn)單描述如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>該化合物能夠有效阻止伴生在水稻中的稗草、碎米莎草和異型莎草種子的生長，同時(shí)也能阻止稻瘟霉和立枯絲核菌的孢子萌發(fā)。'本發(fā)明是以紫丁香酸和間苯三酚為起始原料，經(jīng)四步以56%的收率合成了目標(biāo)產(chǎn)物。為避免紫丁香酸羥基參與反應(yīng)，發(fā)明采用芐基將其保護(hù)，此保護(hù)基可以在反應(yīng)最后一步用冰醋酸加熱關(guān)環(huán)的同時(shí)一并脫掉，減少了反應(yīng)步驟。和用Pd/C通氫氣脫節(jié)基的方法相比，該操作方法更加簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、安全。本發(fā)明利用該物質(zhì)的化感作用可以在不向系統(tǒng)引入難降解的化學(xué)物質(zhì)的情況下，能夠有效阻止伴生在水稻中的稗草、碎米莎草和異型莎草種子的生長，抑制稻ffl雜草，提高水稻產(chǎn)量。同時(shí)也能阻止稻瘟霉和立枯絲核菌的抱子萌發(fā)，從而避免施用農(nóng)藥造成的大量殘留所引發(fā)的一系列難以解決的問題，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。圖1含有該化感物質(zhì)的水稻根分泌物在不同生測(cè)條件下對(duì)稗草和異型莎草的抑制性。圖2不同濃度的化合物對(duì)稻瘟霉孢子萌發(fā)的抑制性。圖3不同濃度的化合物對(duì)立枯絲核菌的孢子萌發(fā)的抑制性。具體實(shí)施方式實(shí)施例15,7，4'-三羥基-3',5'-二甲氧基黃酮的合成1)化合物A的合成(Hoesch反應(yīng))5.0g無水間苯三酚、3.5mL乙腈溶于165mL干燥的乙醚，冰鹽浴冷卻至-l(TC,攪拌下加入2.7g熔融氯化鋅，接著通入干燥的氯化氫氣體2h,然后將反應(yīng)瓶密封于冰箱中放置1d，次閂繼續(xù)通氯化氫氣體2h,再于冰箱中放置1d，有桔色固體析出，過濾，濾餅用無水乙醚洗兩次，然后用250mL水溶解轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，加熱回流lh，靜置過夜，析出黃色固體，用水重結(jié)晶兩次，得到淡黃色針狀晶體5.8g，產(chǎn)率87%。NMR(300MHz,DMSO)52.37(s,3H，CH3C=0)，7.40(s,2H,Ar-H);l3CNMR(IOOMHz,DMSO)S33.09,95.09,64.62,164.96,203.10。2)化合物B的合成將10.0g紫丁香酸溶于50mL95%乙醇'加入17.4mL氯芐和26mL2mol/L的NaOH溶液，攪拌回流，接著緩慢滴加5mol/L的NaOH溶液40mL，反應(yīng)2h。減壓旋去一半溶劑，剩余物用稀鹽酸酸化，析出大量淺黃色固體，抽濾，濾餅用水洗滌三次(3xl0mL)。用95%乙醇重結(jié)晶，得白色針狀晶體12.8g，產(chǎn)率91%。NMR(400MHz,CDCl3)S3.89(s，6H,-OCH3):5.12(s，2H，OCH2-)，7.47(d，2H,^7.2，Ar-H)，7.30-7.36(m，5H,Ar-H);nCNMR(IOOMHz,CDC13)S56.44,75.22，107.61，124.47,128.27,128.44，128.68,137.51,141.99，153.52,172.13，190.0。3)化合物C的制備將5.0g化合物B溶于10mL二氯亞砜，滴加一滴無水吡啶，加熱回流2h,減壓除去溶劑，得淺黃色固體5.2g,產(chǎn)率9813/0。4)化合物D的制備將3.7mLHMDS(六甲基二硅氮垸)溶于8mL無水THF，降溫至-78。C，氬氣保護(hù)下緩慢滴加2.8mol/L的正丁基鋰6.4mL，2min后，將制好的LiHMDS(六甲基二硅胺鋰)在15min內(nèi)加到化合物A的THF溶液中(500mg,15mL)，反應(yīng)液于-78。C攪拌1h，-20°。攪拌2h。繼續(xù)降溫至-78。C，在10min內(nèi)加入化合物C的THF溶液(0.91g,7.0mL)，于-78。C攪拌30min，室溫?cái)嚢?h，然后將反應(yīng)液傾入HC1(20.0mL)的冰水(500.0g)溶液中，用50mL氯仿萃取三次，合并萃取液用無水Na2S04干燥，減壓蒸去溶劑，制得化合物D，未經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。5)目標(biāo)化合物E的合成將D溶于14.8mL冰醋酸，滴加74pL濃硫酸，于100。C反應(yīng)1h，減壓蒸去醋酸，剩余物經(jīng)硅膠柱層析,K筑仿:r丙s-8:l洗脫,收集黃色部分，濃縮得黃色固體621mg,第四、五步總產(chǎn)率63%。本步在關(guān)環(huán)脫水的同時(shí)，脫去芐基,制得目標(biāo)產(chǎn)物。'HNMR(400MHz,DMSO)S12.96(s，1H，5國0H),10.82(s,H，7-0H),9.34(s，lH,4'-OH)，7.32(s,2H，2'6'—H),6.98(s，1H，3—H),6.56(d,/=2.4,1H,8—H),6.20(s，1H，6—H),3.88(s,6H,3'5'-H);l3CNMR(IOOMHz,DMSO):S81.76，163.88，163.59，161.37,157.32，148.10,139.64,120.45,104.36,103.66，98.68,94.18,56.35。實(shí)施例21)培養(yǎng)皿抑草生物活性測(cè)試在直徑9cm的培養(yǎng)皿底部墊入一層濾紙，然后加入設(shè)定濃度的黃酮水溶液，另設(shè)只加蒸餾水的培養(yǎng)皿為對(duì)照。預(yù)先萌發(fā)的受試稗草或異型莎草種子，以每皿50粒均勻播入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱在25±1'C和12h光照條件下生長7d。收獲各培養(yǎng)皿中的幼苗在8(TC。12h條件下干燥后稱取干重。2)盆栽抑草生物活性測(cè)試50粒稗草或異型莎草種子均勻播入含150g水稻土的盆(5cmx7cm)中，待出苗后，每盆間苗至10株，并向盆中施入設(shè)定濃度的黃酮水溶液，對(duì)照則只加蒸餾水。盆放入培養(yǎng)箱在25±1。C和12h光照條件下生長14d。幼苗收獲后，從根苗分界處剪切，地上部在80。C，24h條件下于燥后稱取干重。兩種條件下的生測(cè)均針對(duì)不同的受試雜草和處理溶液設(shè)置3個(gè)重復(fù)，抑制率為在相同條件下處理相對(duì)于對(duì)照幼苗干重的百分?jǐn)?shù)?！鏊袛?shù)據(jù)均用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。表l5,7,4'-三羥基-3',5'-二甲氧基黃酮對(duì)稗草和異型莎草的抑制性(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>該物質(zhì)在盆栽土壤生測(cè)條件下的抑制活性明顯低于培養(yǎng)皿條件下的生測(cè)，這與土壤降低了該化感物質(zhì)的有效濃度有關(guān)。包含此化感物質(zhì)的水稻根分泌物在培養(yǎng)皿生測(cè)條件下抑制活性較低，但在盆栽土壤生測(cè)條件下的抑制活性顯著增強(qiáng)。很顯然，這與盆栽生測(cè)條件下的土壤載體有關(guān)。在培養(yǎng)皿生測(cè)條件下，根分泌物中的營養(yǎng)物質(zhì)可以較長時(shí)間存在，而在土壤生測(cè)條件下，這些營養(yǎng)物質(zhì)可以在土壤微生物及其它生物和非生物因子的作用下消耗或降解，這樣導(dǎo)致它們對(duì)化感物質(zhì)的拮抗作用降低而使化感物質(zhì)能對(duì)雜草表現(xiàn)抑制性。表25，7，4'-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃酮對(duì)稗草、碎米莎曹和異型莎草的抑制性(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>該化合物能夠有效阻止伴生在水稻中的稗草、碎米莎草和異型莎草種子的生長，其能夠起到抑草作用的最低濃度是1g土壤中含11.3嗎和6.8嗎(在稗草和異型莎草中)，其在稗草、異型莎草和碎米莎草生長過程中的ICso值分別是200和100嗎'g-l。3)抗菌活性測(cè)試將待測(cè)物用丙酮溶解，然后加入9cm培養(yǎng)皿中，再加入10mL無菌水，對(duì)照直接加入lOmL無菌水，向培養(yǎng)皿中加入已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基(約50mL)搖勻，冷凝后待用。PDA培養(yǎng)基200g馬鈴薯煮出液，20g葡萄糖，20g瓊脂，0.1MPa滅菌30min。將稻瘟病、文枯病菌絲瓊脂塊接種于已冷凝的培養(yǎng)基上，28t:培養(yǎng)，培養(yǎng)4d，用紙片法測(cè)定抑菌圈直徑，取菌落輻射生長長軸直徑和短軸直徑的平均值，每個(gè)濃度設(shè)為一個(gè)處理，每個(gè)處理稻瘟病6個(gè)重復(fù)，文枯病3個(gè)重復(fù)。抑制率用下式計(jì)算i+CK菌落平均直徑-處理菌落平均直徑菌絲生長抑制率%=-CK菌落平均直徑結(jié)論該化合物不僅能顯著的阻止稗草、異型莎草和碎米莎草種子的生長，同時(shí)也能阻止稻瘟霉和立枯絲核菌的孢子萌發(fā)(圖2，3)。其在稻瘟霉和立枯絲核菌的孢子萌發(fā)中的IC50值分別是50和70嗎'g-l。該化合物在250嗎'g-l條件下能夠完全阻止兩種病原菌的萌發(fā)，而在同樣濃度下卻不能完全阻止三種種子的生長。權(quán)利要求1、一種5，7，4’-三羥基-3’，5’-二甲氧基黃酮的化學(xué)合成方法，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為其特征在于包括的步驟具體步驟是1)乙醚作溶劑，間苯三酚在氯化氫和氯化鋅存在下與乙腈用冰鹽浴冷卻攪拌反應(yīng)，冰箱中放置48小時(shí)，生成得固體產(chǎn)物用無水乙醚洗滌，然后將固體加熱回流水溶解，靜置，固體產(chǎn)物重結(jié)晶，得到化合物A；2)紫丁香酸與氯芐在乙醇的堿溶液中回流反應(yīng)2h；減壓旋去一半溶劑，剩余物用稀鹽酸酸化，析出產(chǎn)物用95％乙醇重結(jié)晶，得化合物B；3)化合物B在微量無水吡啶存在下于二氯亞砜中加熱回流2h，減壓除去溶劑，得化合物C；4)-78℃下，在含六甲基二硅胺鋰的THF中，化合物A與化合物C反應(yīng)，反應(yīng)液傾入HCl的冰水中，氯仿萃取，無水Na2SO4干燥，減壓蒸去溶劑，制得化合物D；5)化合物D在冰醋酸和少量硫酸加熱條件下反應(yīng)關(guān)環(huán)的同時(shí)脫去芐基得到目標(biāo)化合物E。2、按照權(quán)利要求1所述的合成方法,其特征在于步驟所述的5)化合物D在冰醋酸和少量硫酸在IO(TC下加熱反應(yīng)1小時(shí)后，減壓蒸去醋酸，剩余物經(jīng)硅膠柱層析，1^仿:7翻=8:1洗脫，收集黃色部分產(chǎn)物。3、權(quán)利要求卜4所述的合成方法得到的5,7，4'-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃酮用于水稻田中的抑草、抗菌。全文摘要本發(fā)明涉及一種5，7，4’-三羥基-3’，5’-二甲氧基黃酮的合成方法和應(yīng)用，具體是從化感品種水稻OryzasativaL.(PI312777)中分離得到的化感物質(zhì)一5，7，4’-三羥基-3’，5’-二甲氧基黃酮的化學(xué)合成。以紫丁香酸和間苯三酚為起始原料，經(jīng)四步合成了目標(biāo)產(chǎn)物。采用芐基將其保護(hù)，在反應(yīng)最后一步用冰醋酸加熱關(guān)環(huán)的同時(shí)一并脫掉，減少了反應(yīng)步驟。和用Pd/C通氫氣脫芐基的方法相比，該操作方法更加簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、安全。本發(fā)明能夠有效阻止伴生在水稻中的稗草、碎米莎草和異型莎草種子的生長，抑制稻田雜草，提高水稻產(chǎn)量。同時(shí)也能阻止稻瘟霉和立枯絲核菌的孢子萌發(fā)，從而避免施用農(nóng)藥造成的大量殘留所引發(fā)的一系列難以解決的問題，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。文檔編號(hào)A01N43/16GK101239960SQ20081005234公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2008年2月28日優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日發(fā)明者劉愛國,孔垂華,艷崔,徐效華,朱應(yīng)棟,程輝敏,謝龍觀,華趙,煒高申請(qǐng)人:南開大學(xué)