一種piRNA藥物組合物及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種內(nèi)源性非編碼小RNAs的新藥及其用途，特別是一種PiRNA治療心臟疾病的藥物組合物及其用途，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
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[0002]心血管疾病主要包括高血壓、冠心病和充血性心力衰竭等，心血管疾病是人類健康的頭號(hào)殺手，全世界范圍內(nèi)每年有一千七百萬(wàn)人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和。隨著人民生活水平日益提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，已超過(guò)癌癥成為第一大致死原因，預(yù)防和治療心血管疾病仍然是醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的重大任務(wù)。心肌肥大是指組織水平上心肌組織的增厚和細(xì)胞水平上心肌細(xì)胞體積的增大的總稱，是由于心肌細(xì)胞體積增大而導(dǎo)致心臟體積增大所發(fā)生的一種疾病。該病是由一些生理和病理因素的共同刺激而發(fā)生的，是許多心血管疾病的綜合性表現(xiàn)；心肌肥大是心肌病的一種，是心肌細(xì)胞針對(duì)于血液動(dòng)力學(xué)增加的一種應(yīng)答反應(yīng)，多種情況可引起人體內(nèi)血液動(dòng)力的增加，如高血壓，心臟瓣膜疾病。長(zhǎng)期的超負(fù)荷血液動(dòng)力刺激會(huì)引起以心肌細(xì)胞體積增大為特征的心肌細(xì)胞重塑過(guò)程，就是心肌肥大?，F(xiàn)在一般認(rèn)為存在兩種情況的心肌肥大，一種是正常的生理性肥大，比如出生后伴隨著發(fā)育發(fā)生的心肌肥大，還有體育鍛煉引起的心肌肥大；另外一種是病理性心肌肥大，其早期特征是室壁和室間隔增厚，心肌收縮功能增強(qiáng)，因此被視為代償性肥大，如果病情一直未得到緩解，心肌肥大后期會(huì)發(fā)生心室壁間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞收縮功能失調(diào)以及能量代謝，基因表達(dá)和電生理特征的異常，最終導(dǎo)致心臟功能衰竭。鑒于心肌肥大的發(fā)生是一個(gè)進(jìn)行性不可逆過(guò)程，而且最終會(huì)引起心力衰竭，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)把它作為心臟發(fā)生臨床病變的一個(gè)里程碑式的心肌形態(tài)變化，認(rèn)為它是導(dǎo)致心臟疾病和心臟猝死的一個(gè)危險(xiǎn)因素。
[0003]2006年，Aravin等人通過(guò)吸附柱方法分離出雄性小鼠睪丸中的小RNA，長(zhǎng)度范圍在24到30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的位置，這些小RNA的表達(dá)特別高，由此發(fā)現(xiàn)了一類新的小RNA，他們根據(jù)這些小RNA與Piwi蛋白家族的成員MILI相互作用，從而被命名為Piwi相互作用RNAs (Piw1-1nteracting RNAs)，即piRNAs。除了特征性的長(zhǎng)度外，這些小RNA還有許多其他特點(diǎn)，比如它的作用不依賴Dicer而是和Piwi蛋白結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用，此外它還有自我正反饋的特點(diǎn)。關(guān)于Piwi蛋白在許多研宄中包括斑馬魚、埃及伊蚊等不同類型的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)大量的同源蛋白，并行使類似的功能。起初的研宄表明這些PiRNA序列主要源于轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列元件，后來(lái)發(fā)現(xiàn)除rasiRNA以外，復(fù)雜的DNA序列也可以轉(zhuǎn)錄出piRNA。功能上研宄一直是PiRNA研宄中最重要的一環(huán)，由于生殖細(xì)胞RNA表達(dá)庫(kù)的特異性，在小鼠、斑馬魚和果幡中關(guān)于piRNA對(duì)于發(fā)育的影響走在了相關(guān)研宄的最前列，在臨床上，也開(kāi)始有人試圖探索PiRNA和生育疾病的關(guān)系，這是piRNA功能應(yīng)用前景最重要的一面。此外，參與piRNA功能的蛋白也被發(fā)現(xiàn)在體細(xì)胞中有調(diào)控基因表達(dá)的功能，甚至有研宄表明它可能參與學(xué)習(xí)和記憶等高等生物的功能調(diào)節(jié)，最近研宄毫無(wú)異議地證明PiRNA對(duì)生殖支持細(xì)胞確實(shí)有影響。由于小RNA的表達(dá)可能有很強(qiáng)的組織和時(shí)間特異性，而piRNA和進(jìn)化密切相關(guān)，所以從功能學(xué)方面進(jìn)行研宄，對(duì)于探索PiRNA在人體生殖疾病病因與機(jī)制研宄中把握組織特異性，尤其是時(shí)間表達(dá)特異性方面有很大的意義。在果蠅的卵巢，PiRNA的基因定位位于端粒偏中心位置和端粒位點(diǎn)，這些位點(diǎn)和轉(zhuǎn)座子高度相關(guān)。PiRNA和Piwi蛋白以及Aubergine蛋白高度相關(guān)，此外，Agonaute3參與piRNA的循環(huán)，剪切點(diǎn)位于第10個(gè)核苷酸?！癙ing-Pong”模型是現(xiàn)在接受的piRNA模型。小鼠的卵巢piRNA的研宄基本確定了在哺乳動(dòng)物中也有類似的PiRNA模型。最近的研宄在不同程度上揭示piRNA結(jié)合蛋白的輔助蛋白也有調(diào)節(jié)作用。
[0004]對(duì)于心臟的piRNA的研宄具有非常廣泛的實(shí)踐意義與應(yīng)用價(jià)值。首先，對(duì)piRNA的功能研宄有利于發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控心肌梗死的機(jī)制，加深人們對(duì)現(xiàn)有信號(hào)途徑的了解。其次，對(duì)心臟特異性PiRNA的研宄有利于發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)和藥物?，F(xiàn)在，很多研宄者都利用人工合成的piRNA抑制劑對(duì)piRNA進(jìn)行功能研宄。這種經(jīng)過(guò)諸如甲基化、膽固醇修飾的抑制劑在體內(nèi)代謝時(shí)間長(zhǎng)，特異地作用于靶標(biāo)PiRNA，能夠有效地抑制piRNA的表達(dá)，因而具有成為治療性藥物的可能性。這種抑制劑結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，具有很高的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值。鑒于非編碼RNA在心臟發(fā)育以及心肌梗死過(guò)程中扮演著重要的調(diào)節(jié)角色，而現(xiàn)在很多非編碼RNA，例如我們著重研宄的piRNA在心臟中的表達(dá)調(diào)控以及功能尚且不為人們所知，我們通過(guò)對(duì)這類在心臟中表達(dá)的PiRNA進(jìn)行表達(dá)調(diào)控以及功能的研宄，從而加深人們對(duì)心肌肥大等相關(guān)心臟疾病的了解，提供新的藥物作用靶點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種PiRNA藥物組合物及其用途，確定或發(fā)現(xiàn)調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的在心臟中表達(dá)的PiRNA，進(jìn)一步確定其在心臟疾病中的作用，并將其應(yīng)用于心臟疾病的防治藥物中。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)的piRNA序列如下列SEQ ID NO:1所示:5’ -UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’ ；采用常規(guī)工藝配成藥物組合物，包括感染滴度為116PFU過(guò)表達(dá)piRNA載體、病毒或輔料；所述載體為膽固醇、納米顆粒或脂質(zhì)體；病毒載體為腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的一種或多種；所述輔料為甘露醇、磷酸鹽緩沖液、生理鹽水中的一種或多種；
[0007]藥物劑型為口服制劑、注射制劑、片劑、干粉劑型中的一種或多種，優(yōu)選的為注射用小水針劑或注射用凍干粉針。
[0008]本發(fā)明的piRNA藥物組合物，通過(guò)口服或注射用于預(yù)防和治療心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病和心衰。
[0009]本發(fā)明涉及的藥物組合物在肥大的心肌細(xì)胞和心臟肥厚中表達(dá)顯著下調(diào)，通過(guò)合成PiRNA的反義核苷酸來(lái)降低piRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)piRNA的抑制在細(xì)胞水平能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生，肥大基因的表達(dá)與對(duì)照組相比有明顯的升高；對(duì)其進(jìn)行肥大指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，心肌肥大的指標(biāo)如細(xì)胞表面積，蛋白/DNA的比值及肌小節(jié)的重組也與對(duì)照組相比都有明顯的升高，能夠誘導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生，作為早期診斷和早期預(yù)防心肌肥大、心肌纖維化等心臟疾病的生物標(biāo)志物；對(duì)心肌肥厚和心肌纖維化具有保護(hù)作用，在細(xì)胞水平通過(guò)轉(zhuǎn)染PiRNA發(fā)現(xiàn)，能