露腹部，用注射器抽取5mL無血清培養(yǎng)液注入腹腔，輕柔腹部1~2min，吸出細胞 懸液，移入離心管。用無血清培養(yǎng)液離心洗滌一次。棄去上清液，加入HAT培養(yǎng)液，均勻懸 液，接種于96孔培養(yǎng)板，0.lmL/孔。置37°C、5% 0)2及飽和濕度條件下培養(yǎng)備用。
[0036] (2)細胞融合
[0037] 將50 %PEG4000、無血清培養(yǎng)液、HAT篩選培養(yǎng)液置37°CC02培養(yǎng)箱中預(yù)熱。收 獲對數(shù)生長期的Sp2/0細胞，用無血清培養(yǎng)液洗滌3次，作活細胞計數(shù)。無菌條件下分離脾 細胞，作活細胞計數(shù)。將IX10s脾細胞與1X10 7Sp2/0細胞在50mL尖底離心管中混勻，離 心棄去上清液。將含有脾細胞和Sp2/0瘤細胞的50mL尖底離心管放于水杯中，用lmL吸管 吸取0. 7mLPEG4000緩慢加入到細胞混懸液中，靜置90秒，加15mL37°C預(yù)熱的無血清培 養(yǎng)液，離心棄去上清液，加入37°C預(yù)溫HAT培養(yǎng)液充分混勻。接種于含有飼養(yǎng)細胞的96孔 培養(yǎng)板中，置37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)。
[0038] (3)雜交瘤細胞的篩選和雜交瘤細胞的克隆
[0039] 融合5天觀察有小集落后，用HAT篩選培養(yǎng)液換液，10天后換HT培養(yǎng)液。集落長 至1/3~1/2孔時，取培養(yǎng)上清液，用間接ELISA法檢測陽性孔。0D45。值大于1時，判定為 陽性孔。將陽性孔細胞轉(zhuǎn)至24孔含有巨噬細胞的培養(yǎng)板，待集落長至1/3~1/2孔時，取 培養(yǎng)上清液，用間接ELISA法檢測特異性。檢出無交叉陽性株，進行克隆化培養(yǎng)，同時轉(zhuǎn)入 培養(yǎng)瓶。
[0040] 采用有限稀釋法分別對陽性的雜交瘤細胞株進行了 3次克隆，用ELISA法篩選陽 性率達到100%的細胞株，且0D45。值最高的細胞株。擴大培養(yǎng)，凍存，建立細胞株系。
[0041] (4)腹水獲得
[0042] 將篩選得到的細胞株生產(chǎn)細胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)擴增。于兩周前給小鼠腹腔注射降植 烷。然后將擴增的雜交瘤細胞接種于用降植烷處理過的BALB/C小鼠腹腔內(nèi)。7~11天后 小鼠開始產(chǎn)生腹水。采用一次收集的方法收集腹水，離心，棄去上層油脂，吸取淡黃色腹水， 分裝，-20 °C凍存?zhèn)溆谩?br>[0043] (5)抗體的分離純化和鑒定
[0044] 純化抗體；SDS-PAGE電泳法鑒定抗體純度，抗體純度良好；ELISA方法鑒定抗體活 性，〇D45。值大于1，均合格；ELISA方法鑒定抗體特異性，檢測單抗只針對該毒素抗原特異， 與其它抗原不發(fā)生反應(yīng)，具有較好的特異性；抗體親和力測定。
[0045] 采用上述步驟獲得河豚毒素單克隆抗體，該抗體可用于膠體金標記。
[0046] 3、金標微孔試劑的制備
[0047]取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到90~95°C，加入適量枸櫞酸三納繼續(xù) 加熱攪拌至沸騰，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br>[0048] 把河豚毒素單克隆抗體標記的膠體金液，吸附微孔上，凍干后得到微孔試劑8備 用，如圖2所示。
[0049] 微孔試劑8可以由凍干后的金納米棒標記河豚毒素單克隆抗體復(fù)合物代替，金 納米棒的制備方法如下：
[0050] 2. 5ml2· 5X104的HAuCl4溶液與 2. 5ml2· 5X10 4的CTAB溶液混合，然后加入 0. 6ml的冰凍的0. 01MNaBH4溶液并攪拌lOmin得到種子溶液。5ml的0. 08M十六烷基三甲 基溴化銨（CTAB)水溶液與4ml的0. 25ml的5X104的氯金酸水溶液混合，加入0~50微升 的0. 01M硝酸銀（AgN03)溶液，攪拌均勻然后加入20微升0. 1M抗壞血酸，攪拌2min得到 無色透明的生長溶液。lml種子溶液加入到9ml的生長溶液中，攪拌lmin，然后靜置一周， 得到深紫藍色納米金棒溶液。
[0051 ] 把河豚毒素單克隆抗體標記的金納米棒液加入微孔中，凍干后得到金納米棒標記 的微孔試劑8備用。
[0052] 4、試驗線和控制線的制備
[0053] 試紙的試驗線3和控制線4平行于硝酸纖維素膜5上，試驗線3由河豚毒素-大 分子蛋白偶聯(lián)物包被，控制線4靠近吸水板由羊抗鼠多克隆抗體包被。
[0054] 5、檢測試紙的組合
[0055] 檢測試紙由底板7、吸水板1、硝酸纖維素膜5、樣品吸液板2、MAX線6組成，底板 中部為硝酸纖維素膜5,硝酸纖維素膜上有一條試驗線3 (T線）和一條控制線4 (C線），在 底板7 -端端頭為吸水板1，另一端端頭為樣品吸液板2,硝酸纖維素膜5兩端分別與吸水 板1和樣品吸液板4相互交疊連接（交疊連接部分1~2毫米）。
[0056] 6、使用方法
[0057] 如圖3所示，用移液槍移取40μ1待檢液加入金標孔后反復(fù)吹打直至金標孔中紅 色固體充分溶解混勻；插入試紙條，同時開始計時；3分鐘讀取結(jié)果，5分鐘后結(jié)果無效。
[0058] 7、結(jié)果判讀
[0059] (1)陰性：Τ線色度比C線深或一樣深，表示樣品中待檢物濃度低于檢測限，或不含 待檢物，如圖4所示。
[0060] (2)陽性：Τ線色度比C線淺，或Τ線不顯色，則表示樣品中待檢濃度高于檢測限； Τ線比C線越淺，表示樣品中待檢物濃度越高，如圖5所示。
[0061] (3)無效：未出現(xiàn)控制線C線顯色，表明操作過程不正確或檢測卡已失效，如圖6 所示。
[0062] 8、測試結(jié)果
[0063] 本實用新型可測出待測毒素的最低濃度如表1所示：
[0064]表1
[0065]
【主權(quán)項】
1. 一種河豚毒素膠體金快速檢測試劑盒，其特征在于由檢測試紙和微孔試劑⑶組 成；所述檢測試紙由底板（7)、吸水板（1)、硝酸纖維素膜（5)、樣品吸液板（2)、MAX線（6) 組成； 所述硝酸纖維素膜（5)疊放在底板（7)的中部上面；所述吸水板（1)疊放在底板（7) 的其中一端的端頭部分上面，所述樣品吸液板（2)疊放在底板（7)的另一端的端頭部分上 面； 所述硝酸纖維素膜（5)兩端分別與吸水板（1)和樣品吸液板（2)相交疊，且所述硝酸 纖維素膜（5)位于吸水板（1)和樣品吸液板（2)的下方； 從所述硝酸纖維素膜（5)靠近樣品吸液板（2)的那一端開始，依次設(shè)置試驗線（3)和 控制線（4);所述試驗線（3)由河豚毒素-大分子蛋白偶聯(lián)物包被；所述控制線（4)由羊抗 鼠多克隆抗體包被； 所述微孔試劑（8)為凍干后的膠體金標記河豚毒素單克隆抗體復(fù)合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的河豚毒素膠體金快速檢測試劑盒，其特征在于所述底板（7) 是PVC背板，樣品吸液板（2)是玻璃纖維材料，微孔試劑（8)的微孔是聚苯乙烯材料。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的河豚毒素膠體金快速檢測試劑盒，其特征在于所述所述硝酸 纖維素膜（5)兩端與吸水板（1)和樣品吸液板（2)相交疊的部分長度分別為1~2毫米。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的河豚毒素膠體金快速檢測試劑盒，其特征在于所述所述微孔 試劑（8)由凍干后的金納米棒標記河豚毒素單克隆抗體復(fù)合物代替。
【專利摘要】一種河豚毒素膠體金快速檢測試劑盒，由檢測試紙和微孔試劑組成；檢測試紙由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、樣品吸液板、MAX線組成；硝酸纖維素膜疊放在底板的中部上面；吸水板疊放在底板的其中一端的端頭部分上面，樣品吸液板疊放在底板的另一端的端頭部分上面；硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和樣品吸液板相交疊；硝酸纖維素膜依次設(shè)置試驗線和控制線；試驗線由河豚毒素-大分子蛋白偶聯(lián)物包被；控制線由羊抗鼠多克隆抗體包被；微孔試劑為凍干后的膠體金標記河豚毒素單克隆抗體復(fù)合物。本實用新型在傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙基礎(chǔ)上進行改進，將膠體金標記抗體復(fù)合物直接凍干于微孔中，使檢測過程中待測樣本與金標抗體充分反應(yīng)，提高檢測靈敏度。
【IPC分類】G01N33/577
【公開號】CN205038220
【申請?zhí)枴緾N201520753880
【發(fā)明人】倫麗麗, 張勛, 李奇富, 吳雨萌
【申請人】江蘇美正生物科技有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年9月25日