李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條，具有襯板，以及在襯板上依次排列的樣品墊、金標墊、NC膜和吸收墊，其特征在于：其中，由保藏號為CGMCCNo.8002的雜交瘤細胞株6D4H7C8B6產(chǎn)生的單克隆抗體作為金標抗體偶聯(lián)膠體金，以及由保藏號為CGMCCNo.8765的雜交瘤細胞株1B4E7A6C9產(chǎn)生的單克隆抗體作為檢測抗體，金標抗體偶聯(lián)膠體金后噴涂于金標墊上，檢測抗體噴涂于NC膜上形成檢測線。本發(fā)明對李斯特菌的檢測特異性和靈敏性均較高。
【專利說明】李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]李斯特菌(Listeriaspp.)是一種短小的革蘭氏陽性無芽胞兼性厭氧桿菌,共有單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytohenes)、綿羊李斯特菌(Listeria iuanuii)、英諾克李斯特菌(Listeria innocua)、威爾斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、西爾李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、默氏李斯特菌(Listeriamurrayi)七個菌株，其中單核細胞增生李斯特菌是李斯特菌屬中致病力最強的細菌，也是唯一對人致病的、典型的胞內(nèi)寄生菌，可以導(dǎo)致嚴重的人畜共患傳染病，如腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)和單核細胞增多等癥狀。1988年，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)發(fā)表“食源性李斯特菌病勸告書”，指導(dǎo)全世界各國如何預(yù)防李斯特菌污染和中毒。自此，LM成為新的重要的食源性疾病病原菌，WHO將其與E.coli0157、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌并列為20世紀90年代四大食源性致病菌。該菌主要污染牛奶及乳制品、乳酪制品、肉制品香腸、加工禽類、生肉、魚、蝦、煙熏魚、生蔬菜。
[0003]目前李斯特菌的檢測主要依賴于國標所規(guī)定的生化鑒定，其缺點是操作繁瑣、檢測周期較長，無法適應(yīng)大量的樣品篩查。免疫學(xué)檢測是近年來出現(xiàn)的最快速、準確、穩(wěn)定的快速檢測手段，但是檢測產(chǎn)品全部依賴進口，我國目前尚無擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)，且可運用于檢測實踐的快速檢測產(chǎn)品，該專利以李斯特菌為檢測靶標，所要求保護的技術(shù)涉及李斯特菌快速檢測產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問題，本發(fā)明提供一種李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條。
[0005]一種李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條，具有襯板，以及在襯板上依次排列的樣品墊、金標墊、NC膜和吸收墊，其特征在于:
[0006]其中，由保藏號為CGMCCN0.8002的雜交瘤細胞株6D4H7C8B6產(chǎn)生的單克隆抗體作為金標抗體偶聯(lián)膠體金，由保藏號為CGMCCN0.8765的雜交瘤細胞株1B4E7A6C9產(chǎn)生的單克隆抗體作為檢測抗體，金標抗體偶聯(lián)膠體金后噴涂于金標墊上，檢測抗體噴涂于NC膜上形成檢測線。
[0007]另外，本發(fā)明還提供了李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條在檢測食品中的李斯特菌中的應(yīng)用。
[0008]發(fā)明作用與效果
[0009]根據(jù)本發(fā)明的李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條，由于采用了配對單克隆抗體分別噴涂金標墊和檢測線，實驗結(jié)果對李斯特菌的檢測特異性和靈敏性均較高?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0010]圖1是本發(fā)明實施例中單克隆抗體純度測定的結(jié)果；
[0011]圖2是本發(fā)明實施例中李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體偶聯(lián)膠體金的最佳pH的檢測結(jié)果；
[0012]圖3是本發(fā)明實施例中李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體偶聯(lián)膠體金的最佳結(jié)合量的檢測結(jié)果；
[0013]圖4是本發(fā)明李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0014]圖5是本發(fā)明李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體組合配對結(jié)果；
[0015]圖6是本發(fā)明李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的靈敏度測定結(jié)果；
[0016]圖7是本發(fā)明李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的交叉反應(yīng)結(jié)果；以及
[0017]圖8是本發(fā)明實施例中李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的模擬帶菌實驗結(jié)果O
[0018]保藏信息
[0019]1.產(chǎn)生抗單核細胞增生李斯特菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株6D4H7C8B6于2013年07月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京市)，保藏號為CGMCCN0.8002。
[0020]2.抗單核細胞增生李斯特菌雜交瘤細胞1B4E7A6C9于2014年01月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京市)，保藏號為CGMCCN0.8765。
【具體實施方式】
[0021]本發(fā)明人的研究表明，以單核細胞增生性李斯特菌作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純化得到抗李斯特菌單克隆抗體1B4E7A6C9和6D4H7C8B6，其抗體效價可達到1:100000，其能夠特異性、高效地與李斯特菌結(jié)合，與豬霍亂沙門、鼠傷寒沙門、腸炎沙門、福氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等均無交叉反應(yīng)。
[0022]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中所使用的菌株，除提供保藏編號的兩株外，其它菌株均可以通過商業(yè)渠道獲得。
[0023]一、抗李斯特菌單克隆抗體的制備及鑒定
[0024]1.免疫原和陽性標準品的準備
[0025]單核細胞增生性李斯特菌(ATCCN0.43251)接種于李氏增菌肉湯37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)17h，計數(shù)，加入0.3%甲醛溶液室溫滅活I(lǐng)天。用生理鹽水調(diào)整單核細胞增生性李斯特菌(ATCC N0.43251)濃度至5 X 109cfu/ml作為免疫原；用生理鹽水調(diào)整濃度為IO8Cfu/ml作為陽性對照標準品，李氏增菌肉湯為陰性對照標準品。
[0026]2.單克隆抗體的制備過程
[0027](I)實驗動物:選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實驗動物。[0028](2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強注射一次。
[0029](3)采血:3次加強免疫后從尾部靜脈采血，采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價。待效價不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規(guī)方法進行細胞融合。
[0030](4)細胞融合:取免疫小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50% PEG作用下常規(guī)融合，分別接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0031](5)雜交瘤細胞篩選:采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法，篩選強陽性孔的雜交瘤細胞，將其轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板。
[0032](6)克隆培養(yǎng)及抗體制備:用有限稀釋法進行克隆化培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至鋪滿孔底1/10時，再用同樣方法檢測，將強陽性孔再克隆，如此反復(fù)3 — 4次，直至陽性率達到100 %。將雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，注射于經(jīng)石蠟油預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6個雜交瘤細胞，7~10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水。
[0033]3.單克隆抗體純化及鑒定
[0034]腹水先用辛酸-硫酸銨法粗提后,再用Protein G Sepharose親和層析法純化,將制備純化所得抗體D3、E7、B9通過Nanodrop2000C測定儀測得濃度如表1，1B4E7A6C9濃度為4.5mg/ml,6D4H7C8B6濃度為3.8mg/ml，該濃度適于抗體的使用與保存，不需再進行濃縮或稀釋。 [0035]純化后的抗體經(jīng)倍比稀釋后用間接ELISA法測定效價，結(jié)果見表2 ;再用SDS-PAGE分析純度，5%積層膠，10%分離膠，120V電壓，電泳至膠底部，凝膠用考馬斯亮藍法染色，脫色后凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，結(jié)果如圖1所示。圖1中第I泳道是1B4E7A6C9，第二泳道是:6D4H7C8B6。
[0036]表1單克隆抗體的濃度
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條，具有襯板，以及在襯板上依次排列的樣品墊、金標墊、NC膜和吸收墊，其特征在于: 其中，由保藏號為CGMCCN0.8002的雜交瘤細胞株6D4H7C8B6產(chǎn)生的單克隆抗體作為金標抗體偶聯(lián)膠體金，由保藏號為CGMCCN0.8765的雜交瘤細胞株1B4E7A6C9產(chǎn)生的單克隆抗體作為檢測抗體，所述金標抗體偶聯(lián)膠體金后噴涂于所述金標墊上，所述檢測抗體噴涂于所述NC膜上形成檢測線。
2.如權(quán)利要求1所述的李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條在檢測食品中的李斯特菌中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/577GK103941012SQ201410178017
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】劉箐, 李建武, 楊標 申請人:上海理工大學(xué)