（Infinite (注冊(cè)商標(biāo)）200Pro、TECAN公司制）測(cè)定 (激發(fā)光485nm/巧光535nm)。另一方面，向除去培養(yǎng)上清的48孔板的各孔各添加500 y 1的 PBS而進(jìn)行清洗。向各孔各添加500 y I增溶緩沖液巧OmM Tris-肥I (抑7. 5)、I % CHAPS、 5mM邸TA(pH8.0)及150mM化Cl)。然后，將板于25°CW 450巧m振蕩15分鐘，使細(xì)胞溶 解。從各孔各回收200 y 1細(xì)胞增溶液，添加到移了上清的96孔平底黑色板的對(duì)應(yīng)的孔。將 上清和細(xì)胞增溶液的混合物的巧光強(qiáng)度用巧光平板讀數(shù)儀（Inf inite (注冊(cè)商標(biāo)）200Pro、 TECAN公司制）測(cè)定（激發(fā)光485nm/巧光535nm)。
[0106] 【（3-4)比較】
[0107] 將由本實(shí)施方式的方法的測(cè)定結(jié)果取為橫軸，將由W往方法的測(cè)定結(jié)果取為 縱軸，標(biāo)繪各血清待測(cè)樣品的數(shù)據(jù)，則得到可近似直線的分布圖。其示于圖3。另外，由 EXCEL (微軟公司）求出決定系數(shù)R2,是0. 7602。從而確認(rèn)，使用BODIPY被標(biāo)記的膽醬醇及 皿L捕獲用抗體的皿L的膽醬醇運(yùn)載功能的測(cè)定的結(jié)果與由使用培養(yǎng)細(xì)胞的W往方法的測(cè) 定結(jié)果相關(guān)，本實(shí)施方式的方法顯示與W往方法同程度的性能。
[010引【比較例：測(cè)定用樣品的制備順序的探討】
[0109] 在此比較例中，對(duì)于由抗體的皿L的捕獲后，W運(yùn)載被巧光標(biāo)記的膽醬醇的順序 進(jìn)行測(cè)定的情況進(jìn)行探討。
[0110] 【（4-1)皿L級(jí)分的運(yùn)載】
[0111] 與實(shí)施例1同樣地，使用陽(yáng)G4000從人血清待測(cè)樣品（待測(cè)樣品1及待測(cè)樣品2) 得到皿L級(jí)分。
[011引【（4-2)測(cè)定用板的準(zhǔn)備】
[0113] 與實(shí)施例3的本實(shí)施方式的方法同樣地，將抗ApoAI抗體（M0N05030、SANBIO公 司）固相化到96孔微平板的各孔，用BSA溶液封閉，準(zhǔn)備測(cè)定用板。
[0114] 【（4-3)巧光強(qiáng)度的測(cè)定】
[0115] 【（i)皿L和抗ApoAI抗體的復(fù)合物的形成】
[0116] 取上述得到的各皿L級(jí)分的一部分，與實(shí)施例1同樣地測(cè)定ApoAI濃度。測(cè)定后， 將各皿L級(jí)分用反應(yīng)緩沖液稀釋至ApoAI濃度成0. 1 y g/ml。向得到的各稀釋液（300 y 1) 各添加34 氧化劑（1M過(guò)氧化氨、200 y M亞硝酸鋼及IOOyM DTPA)，于37°C W SOO^m 振蕩1小時(shí)。從上述的測(cè)定用板除去BSA溶液，向孔各添加100 ii 1與氧化劑反應(yīng)的皿L級(jí) 分。另外，作為陰性對(duì)照，也準(zhǔn)備未添加皿L級(jí)分的孔。然后，將板于25°C W 60化pm振蕩1 小時(shí)，使皿L和抗ApoAI抗體的復(fù)合物形成。從板除去皿L級(jí)分，與實(shí)施例3同樣地將各孔 用PBS清洗3次。
[0117] 【（ii)皿L和被巧光標(biāo)記的膽醬醇的接觸及巧光強(qiáng)度的測(cè)定】
[0118] 混合 3 Ji 1 的 0. 5mM BODIPY 被標(biāo)記的膽醬醇（TopFluor Qiolesterol、Avanti Polar Lipids公司）和300 y 1的反應(yīng)緩沖液。混合得到的混合液（303 y 1)和氧化劑 (34 y 1)。將得到的被標(biāo)記的膽醬醇溶液各100 y 1添加到上述的板的各孔，于37°C W 80化pm振蕩1小時(shí)。從板除去被標(biāo)記的膽醬醇溶液，將各孔用PBS清洗5次。向各孔各添加 IOOiil的IOmM環(huán)糊精/PBS，于25°CW60化pm振蕩15分鐘。然后，將巧光強(qiáng)度用巧光平板 讀數(shù)儀（Infinite (注冊(cè)商標(biāo)）200Pro、TECAN公司制）測(cè)定（激發(fā)光485nm/巧光535nm)。
[0119] 【（iii)由夾屯、ELISA法的HDL的檢測(cè)】
[0120] 從上述的測(cè)定后的板除去環(huán)糊精溶液，將各孔用PBS清洗3次。將ApoAI測(cè)定用 試劑盒（N-測(cè)定TIA ApoAI-H、WTTOBO MEDICAL株式會(huì)社）的山羊抗ApoAI血清用封閉緩 沖液（Startin濁lock、Thermo Scientific公司）稀釋1000倍，向各孔各添加100 Ji I得到 的稀釋液。將板于25°C W 60化pm振蕩1小時(shí)后，除去稀釋液，將各孔用PBS清洗3次。將 HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG多克隆抗體（P 0449、化ko公司）用封閉緩沖液（Startin濁lock、 Thermo Scientific公司）稀釋1000倍，向各孔各添加100 y 1得到的稀釋液。將板于25°C W 60化pm振蕩1小時(shí)后，除去稀釋液，將各孔用PBS清洗3次。向各孔各添加100 y 1化學(xué) 發(fā)光底物溶液（SuperSi即al ELISA Pico、37069、Thermo Scientific 公司）。將板于 25°C W 60化pm振蕩2分鐘后，將發(fā)光量用酶標(biāo)儀（Infinite (注冊(cè)商標(biāo)）F200Pro、TECAN公司 審Ij )進(jìn)行測(cè)定。
[0121] 【（4-4)測(cè)定結(jié)果及考察】
[0122] 由ELISA法的皿L檢測(cè)和巧光強(qiáng)度的測(cè)定的結(jié)果示于各自圖4A及4B。如圖4A所 示確認(rèn)，血清待測(cè)樣品中的皿L被固定在板上的抗ApoAI抗體捕獲。另一方面，如圖4B所 示，無(wú)關(guān)于使皿L級(jí)分和被巧光標(biāo)記的膽醬醇接觸，巧光強(qiáng)度是與未添加皿L的陰性對(duì)照同 程度。從而知，由抗ApoAI抗體捕獲皿L后，與被標(biāo)記的膽醬醇接觸，被標(biāo)記的膽醬醇也不 被皿L運(yùn)載。
[0123] 【符號(hào)的說(shuō)明】
[0124] 11 :含被標(biāo)記的膽醬醇的第1試劑
[0125] 22 :含與脂蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的第2試劑
[0126] 33 :固相（96孔微平板）
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 測(cè)定脂蛋白質(zhì)的膽甾醇運(yùn)載能力的方法，其包括： 通過(guò)使樣品中的脂蛋白質(zhì)和被標(biāo)記的膽留醇接觸，使上述脂蛋白質(zhì)運(yùn)載上述被標(biāo)記的 膽甾醇的工序， 通過(guò)使運(yùn)載上述被標(biāo)記的膽留醇的上述脂蛋白質(zhì)和與脂蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體接觸，形成 上述脂蛋白質(zhì)和上述抗體的復(fù)合物的工序， 測(cè)定從上述復(fù)合物發(fā)生的標(biāo)記的工序。2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中上述脂蛋白質(zhì)是高比重脂蛋白質(zhì)。3. 權(quán)利要求1所述的方法，其中 上述被標(biāo)記的膽留醇是被熒光標(biāo)記的膽甾醇， 在上述測(cè)定工序中，測(cè)定從上述復(fù)合物發(fā)生的熒光的強(qiáng)度。4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中在使上述脂蛋白質(zhì)運(yùn)載上述被標(biāo)記的膽留醇的工序 中，上述被標(biāo)記的膽留醇通過(guò)與上述樣品的接觸而被酯化，酯化的被標(biāo)記的膽留醇被運(yùn)載 到上述脂蛋白質(zhì)。5. 權(quán)利要求1所述的方法，其中使上述脂蛋白質(zhì)運(yùn)載上述被標(biāo)記的膽留醇的工序、形 成復(fù)合物的工序、及測(cè)定標(biāo)記的工序在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行。6. 權(quán)利要求1所述的方法，其還包括除去未被上述脂蛋白質(zhì)運(yùn)載的游離的被標(biāo)記的膽 甾醇的工序。7. 權(quán)利要求1所述的方法，其中在復(fù)合物形成工序之后，還包括通過(guò)除去未被脂蛋白 質(zhì)運(yùn)載的游離的被標(biāo)記的膽留醇，分離上述復(fù)合物和游離的被標(biāo)記的膽留醇的工序。8. 權(quán)利要求1所述的方法，其中與上述脂蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體是抗ApoAI抗體。9. 權(quán)利要求8所述的方法，其中上述抗ApoAI抗體被固定化到固相。10. 權(quán)利要求1所述的方法，其中上述樣品是血液、血清或血漿。11. 權(quán)利要求1~10之任一項(xiàng)所述的方法，其中上述被標(biāo)記的膽留醇含熒光團(tuán)，所述熒 光團(tuán)具有有極性結(jié)構(gòu)。12. 權(quán)利要求11所述的方法，其中上述被標(biāo)記的膽留醇含有下述的式（I): 【化1】所表示的硼二吡咯亞甲基骨架結(jié)構(gòu)或下述的式（II): 【化2】所表示的苯并噁二唑骨架結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)。13. 權(quán)利要求12所述的方法，其中上述含有硼二吡咯亞甲基骨架結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)的被熒 光標(biāo)記的膽留醇是下述的式（III):所表示的被熒光標(biāo)記的膽甾醇。14. 權(quán)利要求12所述的方法，其中上述含有苯并噁二唑骨架結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)的被熒光標(biāo) 記的膽甾醇是下述的式（IV):所表示的被熒光標(biāo)記的膽甾醇。15. 脂蛋白質(zhì)的膽留醇運(yùn)載能力測(cè)定用試劑盒，其含： 含被標(biāo)記的膽留醇的第1試劑，和 含與脂蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的第2試劑。16. 權(quán)利要求15所述的試劑盒，其還含固相。17. 權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中在上述固相固定化有抗ApoAI抗體。18. 權(quán)利要求15~17之任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中上述被標(biāo)記的膽留醇是被熒光標(biāo)記 的膽甾醇。19. 權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中上述被標(biāo)記的膽留醇含熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)具有 有極性結(jié)構(gòu)。20. 權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中上述被標(biāo)記的膽留醇含有下述的式（I):所表示的硼二吡咯亞甲基骨架結(jié)構(gòu)或下述的式（II): 【化2】所表示的苯并噁二唑骨架結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)。21. 權(quán)利要求20所述的方法，其中上述含有硼二吡咯亞甲基骨架結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)的被熒 光標(biāo)記的膽留醇是下述的式（III):所表示的被熒光標(biāo)記的膽甾醇。22. 權(quán)利要求20所述的方法，其中上述含有苯并噁二唑骨架結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)的被熒光標(biāo) 記的膽甾醇是下述的式（IV):所表示的被熒光標(biāo)記的膽甾醇。
【專利摘要】本發(fā)明提供測(cè)定脂蛋白質(zhì)的膽甾醇運(yùn)載能力的方法。此方法包括，通過(guò)使樣品中的脂蛋白質(zhì)和被標(biāo)記的膽甾醇接觸，使上述脂蛋白質(zhì)運(yùn)載上述被標(biāo)記的膽甾醇的工序；通過(guò)使運(yùn)載上述被標(biāo)記的膽甾醇的上述脂蛋白質(zhì)和與脂蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體接觸，形成上述脂蛋白質(zhì)和上述抗體的復(fù)合物的工序；測(cè)定從上述復(fù)合物發(fā)生的標(biāo)記的工序。
【IPC分類】G01N33/533
【公開號(hào)】CN105527418
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510672254
【發(fā)明人】原田周, 村上克洋, 桐山真利亞, 吉川景子, 三輪桂子
【申請(qǐng)人】希森美康株式會(huì)社
【公開日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2015年10月16日
【公告號(hào)】EP3009844A1, US20160109469