一種穩(wěn)定的游離脂肪酸測定試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種穩(wěn)定的游離脂肪酸測定試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 游離脂肪酸，即非酯化脂肪酸（non-estesterfied fatty acid，NEFA)，是人體內(nèi) 脂肪代謝的中間產(chǎn)物，也是細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的底物和前列腺素等細(xì)胞內(nèi)信號分子的供體。 當(dāng)肌肉活動所需能源一一肝糖耗盡時，脂肪組織會分解中性脂肪成為游離脂肪酸來充當(dāng)能 源使用。雖然游離脂肪酸只占身體脂肪很少的一部分，但卻滿足了能量需求的很大部分，故 而是監(jiān)控人體脂代謝、糖代謝的重要指標(biāo)。游離脂肪酸不僅能夠反映人體脂肪代謝情況及 血脂水平、評價血糖及輔助診斷糖尿病，還能反映人體內(nèi)多種其他病理、生理情況，如胰島 素抵抗、肥胖、惡性疾病、代謝綜合征和心血管疾病等。
[0003] 血清中高游離脂肪酸濃度多見于肥胖、糖尿病、心肌梗塞、重癥肝障礙、甲狀腺功 能亢進(jìn)、肢端肥大癥和饑餓等；游離脂肪酸含量低見于甲狀腺機(jī)能減退、腦垂體功能不全、 阿狄森氏病等，餐后亦可引起游離脂肪酸生理性降低。
[0004] 隨著糖尿病、高血壓、高血脂等現(xiàn)代病的日益多發(fā)，對糖類和脂類的異常代謝監(jiān) 控，也成為臨床上診治和檢測病情的重要事項。目前測定血清中游離脂肪酸的方法較多，如 酶法、滴定法、比色法、原子分光光度法、高壓液相層析法、氣相色譜法等。由于傳統(tǒng)方法操 作繁瑣且精密度差，而酶法檢測血清游離脂肪酸試劑盒具有特異性高、精密度好、操作簡單 等優(yōu)點(diǎn)，因此在臨床大批量樣本的自動快速檢測中，酶法應(yīng)用的最為廣泛。
[0005] 市售酶法測定游離脂肪酸試劑盒的主要反應(yīng)原理大都基于Trinder反應(yīng)模式，具 體反應(yīng)過程如下：
[0006]
[0007]
[0008]
[0009]即游離脂肪酸在ATP、輔酶A的存在下，經(jīng)脂酰輔酶A合成酶（Acyl CoA Synthetase，ACS)作用，生成脂酰輔酶A ;脂酰輔酶A被脂酰輔酶A氧化酶（Acyl CoA Oxidase，AC0D)氧化，生成反式-稀酰輔酶A(2,3-trans-Enoyl-CoA)和過氧化氫；而生成 的過氧化氫在過氧化物酶（peroxidase，P0D)存在下，與Trinder色原及4-氨基安替比林 (4-aminoantipyrine，4_APP)生成紅色醌亞胺物（purple dye)，該物質(zhì)的生成量與樣本中 的游離脂肪酸含量呈正比，通過測定其吸光度即可得到樣品中游離脂肪酸的濃度。
[0010] 目前市售酶法測定游離脂肪酸的試劑盒主要存在下述問題：
[0011] 1.酶法測定游離脂肪酸試劑盒最初從國外進(jìn)口，進(jìn)口試劑具有良好的穩(wěn)定性和優(yōu) 秀的分析性能，但價格昂貴，檢測成本較高，不適合大規(guī)模應(yīng)用?，F(xiàn)今，游離脂肪酸的生化 檢測在國內(nèi)市場上方興未艾，僅有少數(shù)的一些廠家能夠?qū)崿F(xiàn)游離脂肪酸試劑盒的自產(chǎn)，但 其所采用的色原反應(yīng)物質(zhì)活性低，顯色穩(wěn)定性差、抗干擾性弱，從而導(dǎo)致整個試劑盒穩(wěn)定性 差，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，靈敏度低。
[0012] 2.由于催化Trinder反應(yīng)的過氧化物酶對底物專一性較差，反應(yīng)易受到內(nèi)源性物 質(zhì)的干擾，如抗壞血酸、膽紅素、溶血等?？箟难岬冗€原性物質(zhì)還會與H 202競爭過氧化物 酶（P0D)或與色原性物質(zhì)競爭H202，從而使氧化過程中產(chǎn)生的H 202被消耗，生成的紅色醌亞 胺化合物減少，導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確。
[0013] 3.目前市售酶法游離脂肪酸試劑盒均選用單一的穩(wěn)定劑，由于游離脂肪酸試劑盒 成分比較復(fù)雜含有多種酶，其試劑盒穩(wěn)定性直接與酶活性相關(guān)，而酶的活性易受各種因素 的干擾，比如PH、溫度、紫外線、重金屬鹽、抑制劑、激活劑等，導(dǎo)致試劑盒缺乏穩(wěn)定性，保存 時間短，影響臨床使用。單一的穩(wěn)定劑已越來越不能滿足對試劑盒穩(wěn)定性的要求，因此，組 合選用兩種或多種配制簡單、成本低廉、對酶種類較多的游離脂肪酸測定試劑盒有良好穩(wěn) 定效果的穩(wěn)定劑，是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明為克服上述現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供了一種高穩(wěn)定性的酶法游離脂肪酸測定試 劑盒，能夠消除人血清中抗壞血酸、膽紅素等多種物質(zhì)的干擾、靈敏度高、成本低，不僅能夠 適應(yīng)大規(guī)模人群普查的需求，也能滿足日常臨床快速、大量檢查的要求，適合產(chǎn)業(yè)化，便于 臨床推廣。
[0015] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：一種基于Trinder反應(yīng)原 理的酶法測定血清中游離脂肪酸的試劑盒，其組成包括試劑1和試劑2兩種獨(dú)立液態(tài)試劑， 其中試劑1、試劑2中的各組分及濃度范圍為：
[0016] 試劑 1 :
[0017]
[0018] 試劑 2 :
[0019]
[0020] 所述試劑1和試劑2的容積比為4:1。
[0021] 由于酶法反應(yīng)需要合適的pH范圍和適宜離子強(qiáng)度的緩沖環(huán)境，離子強(qiáng)度過高，電 解質(zhì)干擾酶與底物結(jié)合，酶活性將逐漸下降，但離子強(qiáng)度過低也可能無法激活酶的活性，因 此，一般選擇與生理環(huán)境的體液比較接近的離子強(qiáng)度。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述試劑緩沖液 選自對酶化學(xué)反應(yīng)等無抑制作用，不干擾生物化學(xué)反應(yīng)過程的GOOD' S緩沖液，如2-嗎啉 代乙磺酸（MES)、3-嗎啉代丙磺酸（M0PS)、N-[三（羥甲基）甲基]-2-氨基甲磺酸（TES)、 3-[4-(2_羥甲基）-1_哌嗪]丙磺酸（(H)EPPS)中的一種，優(yōu)選MOPS緩沖液，pH優(yōu)選范圍 為6. 0~8. 5。根據(jù)酶催化反應(yīng)最適條件的要求，在酶測定體系中還需要加入一定量的離子 激活劑，激活劑可以是酶的活性中心，也可以通過其他機(jī)制激活酶的活性。優(yōu)選的，本發(fā)明 所述試劑盒中所述離子激活劑為MgCl2 ? 6H20,同時加入一定濃度的KCL調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度。
[0022] 本發(fā)明所述防腐劑為咪唑烷基脲，較市售常用的proclin系列防腐劑不僅具有良 好的防腐作用，且無還原性，對酶活性無抑制，不影響反應(yīng)。
[0023] 本發(fā)明所述穩(wěn)定劑并不特指某一個，而是由兩種或兩種以上試劑共同發(fā)揮了穩(wěn)定 劑的作用，對保持酶活性、維持試劑的長期穩(wěn)定發(fā)揮重要作用，是本發(fā)明的一個關(guān)鍵所在。 所述穩(wěn)定劑選自海藻糖、鹿糖、0 -環(huán)糊精、甘露醇中的一種或多種，不僅能夠發(fā)揮穩(wěn)定試劑 的作用，還可以用于維持試劑中多種酶的活性。為了減少各試劑之間的交叉影響，更好提高 試劑的穩(wěn)定性，所述穩(wěn)定劑同時添加白蛋白，特別選用利用基因工程學(xué)上的方法制造的無 脂肪酸白蛋白，經(jīng)專門的去脂純化處理，脂肪酸含量低于〇. 002 % (w/w)，較市售產(chǎn)品選用 來自牛、馬、羊、人的白蛋白，消除了其所含高濃度脂肪酸對檢測結(jié)果的影響，減少了檢測背 景干擾。
[0024] 本發(fā)明所述試劑2中酶保護(hù)劑為脂酰輔酶A氧化酶穩(wěn)定劑，用于維持試劑2中的 脂酰輔酶A氧化酶的高活性，有助于提高試劑的穩(wěn)定性。
[0025] 本發(fā)明所述色原物質(zhì)的選擇對試劑的穩(wěn)定性、靈敏度以及準(zhǔn)確性十分重要，為本 發(fā)明的另一個關(guān)鍵因素。本發(fā)明通過綜合比較國內(nèi)外常用色原，最終選用了一種胺類新 色原3-甲基-N，N-二丙磺酸鈉苯胺（T0DP)，作為酶法測定游離脂肪酸顯色劑，其優(yōu)點(diǎn)在 于色原合成容易，性能穩(wěn)定，分子共輒結(jié)構(gòu)特性使得靈敏度大大提高（反應(yīng)靈敏度可達(dá)到 0.0 lmmol/L)，相應(yīng)可減少樣本使用量，最終有效地降低干擾物的量；所述色原的靈敏度、穩(wěn) 定性優(yōu)于T0PS、T00S、ADPS等顯色劑，與4-AAP氧化縮合顯色迅速，呈色穩(wěn)定，可有效改善對 反應(yīng)體系中酶類穩(wěn)定性的影響；其顯色反應(yīng)生成的胺類色原素最大吸收峰在540nm以上， 可有效避開黃疸、溶血干擾。
[0026] 本發(fā)明所述各組分組合所發(fā)揮的去干擾作用，是本發(fā)明酶法準(zhǔn)確測定血清NEFA 濃度再一個關(guān)鍵因素。
[0027] 本發(fā)明所述表面活性劑選自Brij35、Brij98、Tween20。表面活性劑是反應(yīng)的促進(jìn) 劑，可去除其他脂類雜質(zhì)的影響，提高檢測的靈敏度。為了提高試劑的抗干擾的能力，所述 試劑1中加入了亞鐵氰化鉀和抗壞血酸氧化酶，亞鐵氰化鉀與表面活性劑的組合可有效消 除樣本中高膽紅素對測值的影響，抗壞血酸氧化酶可有效消除樣本中高抗壞血酸對測定樣 本的干擾，從而保證了臨床檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0028]本發(fā)明所述試劑1選用EGTA螯合劑（乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸），可有 效防止除Mg2+外的其他二價金屬離子干擾第一步反應(yīng)。所述試劑2特別選用了氨羧螯合劑 DTPA螯合劑（二乙烯三胺五乙酸），較常用的乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA)、二羥乙基甘氨 酸（DHG)等螯合劑性能更優(yōu)，可迅速與鈣、鎂、鐵、鉛、銅等離子生成水溶性螯合物，有效絡(luò) 合后續(xù)反應(yīng)中過多的鎂離子及抑制乙酰輔酶A氧化酶活性的金屬離子，提高測定結(jié)果的準(zhǔn) 確性；同時還可以防止反應(yīng)中各種金屬陽離子對H 202的分解作用，作為H 202穩(wěn)定劑，具有明 顯的增效和穩(wěn)定作用。
[0029] 本發(fā)明所述4-氨基安替比林（4-AAP)選自高純度制品，其作用并不在第一次酶反 應(yīng)中發(fā)揮，而是留待在過氧化物酶催化的酶反應(yīng)中參與呈色反應(yīng)。
[0030] 本發(fā)明所述試劑2中添加黃素腺嘌呤二核苷酸鈉鹽（FAD)為脂酰輔酶A氧化酶的 輔酶，在反應(yīng)中起到遞氫體的作用，有助于提高反應(yīng)的靈活性，使氧化反應(yīng)更完全，保證了 反應(yīng)高效、穩(wěn)定的進(jìn)行。
[0031] 本發(fā)明所述脂酰輔酶A合成酶和脂酰輔酶A氧化酶均選自由基因工程重組產(chǎn)品提 取的尚純度制品；所述過氧化物酶（P0D)選自由辣根提取的尚穩(wěn)定性制品。
[0032] 本發(fā)明中所述的百分比濃度如未進(jìn)行特別說明，均為質(zhì)量體積百分比濃度，即 100ml溶液中所含溶質(zhì)的克數(shù)。
[0033] 本文中使用的術(shù)語"高純度"是指產(chǎn)品的純度大于95%。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)和有益結(jié)果：
[0035] 本發(fā)明試劑盒與進(jìn)口試劑盒相關(guān)性好，檢測結(jié)果具有高度的一致性（相關(guān)系數(shù) r多0. 990)，線性擬合相關(guān)系數(shù)優(yōu)于進(jìn)口試劑，檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，在臨床可以替代進(jìn)口試 劑盒使用，大