用于檢測甜蜜素的膠體金免疫層析檢測卡的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]屬于食品安全檢測領(lǐng)域，具體涉及食品中有害殘留物的檢測方法，特別是用于檢測甜蜜素的膠體金免疫層析檢測卡。
【背景技術(shù)】
[0002]甜蜜素(英文名稱:(Beet)molasses ；Sodium N-cyclohexylsulfamate; Sodiumcyclamate)化學(xué)名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉,分子式AHnNHSOAa,白色針狀、片狀結(jié)晶或結(jié)晶狀粉末、無臭、味甜，其稀溶液的甜度約為蔗糖的30倍。甜度為蔗糖的40~50倍，為無營養(yǎng)甜味劑。10%水溶液呈中性(PH值6.5)，對熱、光、空氣穩(wěn)定。加熱后略有苦味。分解溫度約280°C，不發(fā)生焦糖化反應(yīng)。酸性環(huán)境下略有分解，堿性時(shí)穩(wěn)定。溶于水(lg/5ml)和丙二醇(lg/5ml)，幾乎不溶于乙醇、乙醚、苯和氯仿。其濃度大于0.4%時(shí)帶苦味，溶于亞硝酸鹽、亞硫酸鹽含量高的水中，產(chǎn)生石油或橡膠樣的氣味。具有非吸濕性，不支持霉菌或其他細(xì)菌生長。
[0003]在美國曾成為一種消費(fèi)量很大的人工甜味劑，公認(rèn)為安全物質(zhì)，這種情況一直持續(xù)到1969年。這一年美國國家科學(xué)院研究委員會收到有關(guān)甜蜜素為致癌物的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，美國食品與藥物管理局(FDA)為此立即發(fā)布規(guī)定嚴(yán)格限制使用，并于1970年8月發(fā)出了全面禁止的命令。1982年9月，Abbott實(shí)驗(yàn)室和能量控制委員會在大量試驗(yàn)事實(shí)的基礎(chǔ)上，以最新的研究事實(shí)證明甜蜜素的食用安全性，許多國際組織也相繼發(fā)表大量評論明確表示甜蜜素為安全物質(zhì)，但FDA至今還沒有最終解決這個(gè)問題。盡管如此，仍有許多國家(包括中國)繼續(xù)承認(rèn)甜蜜素的甜味劑地位，允許甜蜜素的使用。
[0004]根據(jù)我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760)的規(guī)定，“甜蜜素”可以作為甜味劑，其使用范圍為:一，醬菜、調(diào)味醬汁、配置酒、糕點(diǎn)、餅干、面包、雪糕、冰淇淋、冰棍、飲料等，其最大使用量為0.65g/kg ;二，蜜餞，最大使用量為1.0g/kg ;三，陳皮、話梅、話李、楊梅干等，最大使用量8.0g/kg。GB2760-2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，膨化食品、小油炸食品在生產(chǎn)中不得使用甜蜜素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供快速檢測出食品中甜蜜素的殘留。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是甜蜜素的檢測卡及其檢測樣品的處理方法。甜蜜素的檢測卡是在長條扁平薄殼狀的檢測卡外殼內(nèi)設(shè)置檢測條，檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔，其特征在于測試條是由支承背板上粘貼四種原件組成:支承背板中部粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端上粘貼吸水紙，另一端粘貼樣品墊，吸水紙內(nèi)端與硝酸纖維素膜搭接，樣品墊與硝酸纖維素膜之間則有一段金標(biāo)墊，由金標(biāo)墊將樣品墊與硝酸纖維素膜連接在一起。金標(biāo)墊中是含有第二種屬蛋白和甜蜜素抗體的混合物，硝酸纖維素膜上橫向有2條間隔開的顯色印記帶，一條是含甜蜜素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的檢測帶，另一條是第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG(常用的為抗兔抗體或抗鼠抗體)；測試條置入檢測卡外殼內(nèi)，樣品墊正對加樣孔，硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。
[0007]樣品處理方法是:稱取試樣2±0.05 g于50 mL的離心管中，加入10 mL超純水，在1800 r/min條件下用高速組織粉碎機(jī)打碎(約1 min),取粘稠液加50%三氯乙酸2 mL和二氯甲燒10 mL,在回旋式振蕩器上高速振搖30 min。然后在4°C 5000 rpm條件下離心30 min，取上清10 mL，加二氯甲烷2 mL，在回旋加速器上振蕩混合20 min，再在4°C 12000rpm條件下離心30 min,上清液即為藥物的抽提液。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能快速檢測出樣品中含有的甜蜜素，且節(jié)省檢測成本，使用方便，檢測快速，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0009]圖1是甜蜜素檢測卡外殼及檢測試紙條在外殼內(nèi)的安置圖。
[0010]圖2是甜蜜素檢測卡檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。
[0011]圖3是檢測試紙條硝酸纖維素膜上顯示印跡帶示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]1.標(biāo)記膠體金的制備
膠體金溶液的制備:先將1 g氯金酸(HAuC14)粉末溶于100 mL超純水配置成1%的氯金酸溶液；再取1 L超純水于特質(zhì)電爐上加熱，至沸騰后加入10 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，沸騰后繼續(xù)加熱，5分鐘后加10 mL 1%的氯金酸溶液，再次加熱至沸騰，等待顏色變?yōu)榫萍t色后開始計(jì)時(shí)，10分鐘后停止加熱，取下后自然冷卻、定容至1 L，即為膠體金溶液；
抗體標(biāo)記:確定抗體所需的0.1 mol/1 K2C03的比例，取100 mL膠體金溶液，加入此比例0.1 mol/L的K2C03，混勻(約5 min)，再將甜蜜素和第二種屬動(dòng)物蛋白分別用PBS (0.01mol/L,pH7.4)溶解稀釋至2 mg/mL,加入2 mL 2 mg/mL的甜蜜素抗體(或2 mL 2 mg/mL第二種屬動(dòng)物蛋白)，混勻(5 min),最后加入10% BSA 2 mL,混勻(5 min)。離心三次留沉淀，此三次收集的沉淀即為金標(biāo)甜蜜素抗體；
膠體金標(biāo)記部分處理:將甜蜜素抗體稀釋后，按一定比例將載體(如玻璃纖維、聚酯膜等)浸透，鋪均勻，取出放于37 °C恒溫烘箱烘制8-12 h，干燥后即作為膠體金標(biāo)記部分。
[0013]2.免疫層析專用高分子復(fù)合膜制備
首先用一種硝酸纖維素膜制成透明背襯膜，在背襯膜上覆蓋一層對蛋白質(zhì)結(jié)合力強(qiáng)，浸潤性能好的具有一定孔徑的層析膜。背襯膜的作用是阻止粘合劑中的有機(jī)溶劑對層析膜上蛋白質(zhì)的破壞。
[0014]3.層析膜的點(diǎn)樣方法
將一定濃度的甜蜜抗原(甜蜜素與載體物質(zhì)形成的偶合物)精確定量；以一定間距(5mm)呈橫條狀點(diǎn)定于層析膜上，供檢測用。
[0015]甜蜜素檢測卡是在檢測卡外殼1中設(shè)置檢測試紙條2，檢測卡外殼1的結(jié)構(gòu)及檢測試紙條2的設(shè)置見附圖1，檢測卡外殼1為長條扁平薄殼狀外殼，長70 _，寬20 _，厚5mm，薄殼壁厚1 mm，由工程塑料制成，檢測卡外殼1由上蓋和下蓋兩半聯(lián)接而成，在檢測卡外殼1上蓋上有檢測窗孔3和加樣孔4。檢測試紙條2放置在檢測卡外殼1的下蓋內(nèi)。
[0016]檢測試紙條2是多層結(jié)構(gòu)的窄條薄片，片長60 mm,片寬約4 mm,厚度小于2.5 mm。檢測試紙條2是多層結(jié)構(gòu):底層是支承背板5,為聚乙烯薄片,厚度約0.5 mm,長60 mm,寬4 mm ;支承背板5中部粘貼硝酸纖維素膜6,硝酸纖維素膜厚0.5 mm,長20 mm,寬4 mm。硝酸纖維素膜6上有兩條間隔開的橫向顯示印跡帶，參見附圖3，兩條顯示印跡中，一條是檢測線10，含甜蜜素偶聯(lián)物，另一條是參照線11，含第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG。支承背板5 —端上粘貼吸水紙9，另一端粘貼樣品墊8，吸水紙9內(nèi)端與硝酸纖維素膜6搭接，樣品墊8與硝酸纖維素膜6之間則有一段金標(biāo)墊7，由金標(biāo)墊7將樣品墊8與硝酸纖維素膜6連接在一起，搭接寬度在1-2 mm。樣品墊8材料為吸水玻璃纖維或聚酯膜。
[0017]使用甜蜜素膠體金免疫層析檢測卡時(shí)，先將待檢測的樣品液(藥物的抽提液稀釋后，直接用于檢測)從加樣孔4中滴入甜蜜素檢測試紙條2的樣品墊8，由于虹作用原理，帶動(dòng)待檢測的樣品液及膠體金膜7所含的抗甜蜜素單克隆抗體膠體金標(biāo)記物一起向硝酸纖維素膜6擴(kuò)散，5-10分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。
[0018]檢測卡的主要反應(yīng)是免疫學(xué)的抗原和抗體反應(yīng)，在硝酸纖維素膜上遷移的膠體金標(biāo)記的抗體，在測試線上與含有甜蜜素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，以及參照線含第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG反應(yīng)，形成棕紅色條帶。若樣品中相應(yīng)的待測甜蜜素高于允許值，樣品加入后先與金標(biāo)墊中的抗體反應(yīng)，而不會與檢測帶所帶有的甜蜜素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物反應(yīng)，從而不顯色。主要有以下3種檢測結(jié)果:
1.檢測線10和參照線11同時(shí)顯現(xiàn)棕紅色印跡，表示檢測結(jié)果為陰性，說明被測樣品中不含甜蜜素或含量低于允許值；
2.檢測線10不顯色，參照線11顯現(xiàn)棕紅色印跡，表示檢測結(jié)果為陽性，說明被測樣品中甜蜜素含量高于允許值；
3.檢測線10顯現(xiàn)棕紅色印跡，參照線11不顯色，或檢測線10和參照線11均不顯色，表示檢測試紙條失效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.甜蜜素膠體金免疫層析檢測卡，其特征在于:在試紙的背襯上依次貼有樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測反應(yīng)部分和吸水部分，膠體金標(biāo)記部分被標(biāo)記的物質(zhì)為第二種屬動(dòng)物蛋白和甜蜜素抗體的混合物；檢測反應(yīng)部分包被有檢測用甜蜜素抗原作為檢測線，同時(shí)還包被有抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG 1條作為參照線。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜蜜素膠體金免疫層析檢測卡，其特征在于:甜蜜素檢測用抗原為甜蜜素與載體物質(zhì)形成的偶合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甜蜜素膠體金免疫層析檢測卡，其特征在于:所述的載體物質(zhì)，為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽、半合成多肽或多糖。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜蜜素膠體金免疫層析檢測卡，其特征在于:所述的第二種屬動(dòng)物蛋白為非抗體來源動(dòng)物的蛋白質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明為檢測甜蜜素的膠體金免疫層析檢測卡的制備。主要用于快速檢測食品中甜蜜素的含量，該方法在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測反應(yīng)部分及吸水部分。檢測反應(yīng)部分上面包被有檢測用抗原作為檢測線，同時(shí)還包被有抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG1條作為參照線。該快速檢測試紙條特異性強(qiáng)，能夠半定量檢測，環(huán)境溫度為4-35℃都可以使用，適合于個(gè)體養(yǎng)殖戶、食品衛(wèi)生質(zhì)檢部門、海關(guān)等動(dòng)物源食品進(jìn)行甜蜜素殘留的快速檢測。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測，且操作簡單方便等有益效果。
【IPC分類】G01N33/53, G01N1/28, G01N33/531
【公開號】CN105277681
【申請?zhí)枴緾N201410351075
【發(fā)明人】洪霞, 吳明慧, 杜霞
【申請人】江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2014年7月23日