用于區(qū)分發(fā)育階段。圖3a顯示了花粉粒在其發(fā)育期間遇到的各個階段的示意圖。細(xì)胞維度和細(xì)胞內(nèi)含物(液泡的尺寸)的變化可以分別影響阻抗信號的振幅和相位角兩者。這在圖3b (其中相位角變化由于不同的液泡尺寸導(dǎo)致)和圖3c (其中振幅變化由于不同的細(xì)胞尺寸導(dǎo)致)中得到證明。該分析利用從指示尺寸(4_7mm)的花芽(buds)中獲得的甘藍(lán)花粉粒進(jìn)行。
[0067]圖4示出了收集自細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS 1-6)以及完全可育系(對照1_3)的蘿卜屬花芽的花粉的活力。該分析顯示較小的植物(4周，對照3)比較老的植物(12周，對照I和2)具有更高的花粉活力一一一種育種者描述但之前沒有分析過的現(xiàn)象。被食花粉的昆蟲如薊馬(Thrips)(其也影響植物的整體健康)的感染加上殺蟲劑的應(yīng)用(“老的植物”和“薊馬感染的”)也顯著降低了對照和CMS系兩者中的花粉活力。
[0068]圖5a和5b顯示了通過以12MHz的IFC分析的花粉活力與種子產(chǎn)生的相關(guān)性。番茄花被不同花粉數(shù)量活性花粉)授粉，并分析相關(guān)的活性種子(包含胚的種子)的量以產(chǎn)生成功授粉的數(shù)據(jù)(圖5a)。用活力高于25%的花粉授粉的花顯示高于可以在每個果實(shí)中獲得的最大種子量的50%的結(jié)籽，如每個果實(shí)通過天然自交獲得的活性種子的數(shù)量所估計(jì)。用低活力花粉(例如低于2.5%)授粉的花成功生產(chǎn)出可能胚珠的僅10-20%。非常低活力的花粉或者失活的花粉分別導(dǎo)致最小量的種子或?qū)е赂緵]有種子，如圖5b所示。只有包含胚的種子將產(chǎn)生新植物。
[0069]圖6a和6b顯示了花粉質(zhì)量對果實(shí)發(fā)育的影響。圖6a顯示了胚分析前授粉后3周收獲的番茄果實(shí)的圖像。測量每個收獲果實(shí)的直徑，并計(jì)數(shù)每個果實(shí)的胚數(shù)。相比于較低質(zhì)量(圖6a，中間行；6b，灰線)，已用最高花粉質(zhì)量(31% )進(jìn)行授粉的花具有顯著更大的果實(shí)和更高的每個果實(shí)的胚數(shù)(圖6a，上行；6b，黑線)。用活力為0.2%進(jìn)行授粉的花不產(chǎn)生任何果實(shí)并因此沒有種子。因此，IFC的使用也可以是在果實(shí)產(chǎn)生過程中的重要工具。
[0070]圖7顯示了用于授粉和種質(zhì)保存目的的方法的原理和應(yīng)用。單一步驟描述在框圖中。花粉的阻抗分析可以在溫室、田野(=原地)中實(shí)施，主要用于生產(chǎn)過程控制或種質(zhì)保存程序，或在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中實(shí)施，用于進(jìn)一步的育種或存儲應(yīng)用(花粉基因庫)。標(biāo)準(zhǔn)化程序的使用允許獨(dú)立于位置和操作者的分析，并因此導(dǎo)致可比較的結(jié)果。這對于種子生產(chǎn)商和育種者代表了巨大改進(jìn)，因?yàn)榛ǚ刍盍?shù)據(jù)可以在種子產(chǎn)生或種質(zhì)保存過程(這經(jīng)常在地理上不同的位置發(fā)生)的全部各個步驟中進(jìn)行追蹤。因此，該花粉分析方法首次滿足了全球運(yùn)作的種子生產(chǎn)商的需求。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于確定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法，包括: 從花中機(jī)械移取未成熟或成熟的花粉粒； 在導(dǎo)電的、特定的且明確定義的緩沖液中重懸花粉粒，用于使這些植物細(xì)胞保持活性； 將細(xì)胞懸浮液通過具有適合于微流體設(shè)備的孔徑的適當(dāng)?shù)倪^濾器，所述微流體設(shè)備適配于實(shí)施阻抗式流式細(xì)胞術(shù)(IFC); 將過濾的懸浮液通過針對各個花粉類型校準(zhǔn)的微流體設(shè)備，并以預(yù)定頻率測量花粉粒的阻抗； 存儲測量的各花粉粒的阻抗值以及測量頻率，所述阻抗值具有幅值及其相關(guān)相位角； 計(jì)數(shù)過濾的懸浮液中的花粉粒；以及 根據(jù)振幅和/或相位值，通過手工或自動設(shè)定合適的門控以鑒別花粉粒，并確定分析的花粉群的活性比非活性的比率或成熟度。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將該植物細(xì)胞在阻抗式流式細(xì)胞儀(IFC)中的特定微流體芯片內(nèi)暴露于交流電(AC)場，所述交流電(AC)場的頻率范圍為0.1到600MHz，優(yōu)選為0.1到200MHz，最優(yōu)選為0.25到30MHz。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，還包括通過以下鑒定植物細(xì)胞是活性(活的)還是非活性的(死的): 將存儲的具有幅值和相位角值的阻抗值排列在χ-y-矩陣中； 確定具有較低相位角和較高相位角的數(shù)據(jù)組之間的門控； 計(jì)數(shù)不同數(shù)據(jù)組的花粉粒阻抗值； 計(jì)算阻抗值的相位角低于門控的花粉量和阻抗值的相位角高于門控的花粉量之間的比率； 將所述比率與包含各花粉數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫的各比率比餃，用于確定花粉的活力是否足以用于給定的特定目的；以及展示該分析群體的結(jié)果。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，還包括通過以下鑒定成熟度: 確定幅值和/或角度值，作為測量頻率的函數(shù)； 將所述幅值和/或角度值與包含各花粉的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫的各值比較； 將所述植物細(xì)胞鑒定為屬于特定的發(fā)育階段；以及 展示該分析群體的結(jié)果。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中分析的植物細(xì)胞根據(jù)其不同的阻抗信號而分開，并用于下游過程，例如用于育種目的。6.根據(jù)前述權(quán)利要求3或4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述結(jié)果用于種子產(chǎn)生過程和在種子產(chǎn)生過程期間使用，來控制植物細(xì)胞產(chǎn)生過程，或來檢測這些過程中的細(xì)菌、真菌或其他污染。7.根據(jù)前述權(quán)利要求3或4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述結(jié)果用于選擇用于雄性可育性/不育性、耐熱性、耐鹽性和/或脅迫耐性的植物育種材料。8.根據(jù)前述權(quán)利要求3或4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述結(jié)果用于優(yōu)化獲得具有最大活力的花粉所需的植物生長條件。9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，還包括確定用于鑒定花粉的特征的觸發(fā)參數(shù)。10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中確定分析花粉群的活力或成熟度是實(shí)時實(shí)施的。11.微流體設(shè)備在選擇用于雄性可育性/不育性、耐熱性、耐鹽性和/或脅迫耐性的植物育種材料期間，在種子產(chǎn)生過程期間分別通過鑒定植物細(xì)胞是活性(活的)還是非活性的(死的)和/或?qū)⒅参锛?xì)胞鑒定為屬于特定的發(fā)育階段而控制植物細(xì)胞產(chǎn)生過程，或檢測植物產(chǎn)生過程中的細(xì)菌、真菌或其他污染的用途，所述微流體設(shè)備包括至少一個特定微流體芯片并且適配于用交流電(AC)場實(shí)施阻抗式流式細(xì)胞術(shù)(IFC)，所述交流電(AC)場的頻率范圍為0.1到600MHz，優(yōu)選為0.1到200MHz，最優(yōu)選為0.25到30MHz。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于確定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法，所述方法包括：從花中機(jī)械移取花粉粒；在導(dǎo)電的緩沖液中重懸花粉粒，用于使植物細(xì)胞保持活性；將花粉懸浮液通過具有適合于微流體設(shè)備的孔徑的適當(dāng)?shù)倪^濾器，所述微流體設(shè)備適配于實(shí)施阻抗式流式細(xì)胞術(shù)(IFC)；將過濾的懸浮液通過微流體設(shè)備并測量花粉粒的阻抗；存儲測量的各花粉的阻抗值以及測量頻率，所述阻抗值具有幅值及其相關(guān)相位角；計(jì)數(shù)過濾的懸浮液中的花粉粒；以及根據(jù)振幅和/或相位值，通過設(shè)定合適的門控以鑒別花粉粒，并確定分析的花粉群的活力比或成熟度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是植物細(xì)胞不必染色用于活力分析，該方法是非侵入式的，并且可以在短時間范圍內(nèi)實(shí)時且原地分析大量細(xì)胞。
【IPC分類】G01N15/14
【公開號】CN105181560
【申請?zhí)枴緾N201510368787
【發(fā)明人】I·海德曼, M·迪貝拉爾迪諾, K·科克, G·沙德-坎普曼
【申請人】安弗西斯股份公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年3月5日
【公告號】EP2915423A1, US20150253273