測花粉活力的健康分析改善加倍的單倍體產(chǎn)生(doubled haploid product1n)，和通過兩個親本系的花粉分析來優(yōu)化Fl雜交種子產(chǎn)生。另外，該方法可以用于在脅迫條件下選擇育種系，且有助于控制用于種質(zhì)保存的花粉的質(zhì)量。也可以在植物發(fā)育期間應用該方法，以控制植物健康(fitness)以調(diào)整用于果實或種子產(chǎn)生的最佳生長條件。緊接著花粉活力的分析，所述技術也允許檢測植物病原體和它們的活力，提供了一種新的植物病原體的監(jiān)測系統(tǒng)。由于與植物細胞的細胞差別，植物病原體的細胞具有不同的阻抗值。單細胞的阻抗分析通?？梢詰玫剿兄参镂锓N，并不限于本發(fā)明中所述的物種。
[0025]特別地，本發(fā)明基于以下事實:任何來源的細胞被細胞膜和/或細胞壁包圍，以及該細胞膜和/或細胞壁當暴露于電場時展示出比電容(specific capacities)?？梢詼y量這些電容，給出反映細胞膜、細胞壁和細胞質(zhì)的生理狀態(tài)的電容值。
[0026]在本發(fā)明中，通過阻抗式流式細胞儀分析植物細胞電容。常規(guī)庫爾特計數(shù)器使用直流電(DC)或低頻交流電(AC，最高IkHz)測量阻抗，允許可靠的細胞計數(shù)和細胞尺寸鑒別。EP I 335 198 BI公開了一種具有電極排列的微流體方法，所述電極排列允許在寬頻率范圍內(nèi)(100kHZ--20MHZ)對細胞進行阻抗分析。高頻分析超出了簡單的細胞計數(shù)和尺寸測量并且詢問細胞的介電性能，這允許各種應用(例如細胞分化)中的細胞鑒別，或分別動物、真菌和細菌細胞活力(Schade-Kampmann等，標題:ON-CHIP NON-1NVASIVE ANDLABEL-FREE CELL DISCRIMINAT1N BY IMPEDANCE SPECTROSCOPY，Cell Prolif.(2008)，41 (5)，第830-840頁)。與常規(guī)庫爾特計數(shù)器測量(其中信號振幅用于計數(shù)細胞和測量細胞尺寸)相反，高頻分析提供了關于細胞膜電容和細胞質(zhì)導電性的信息，所述細胞膜電容和細胞質(zhì)導電性是細胞生理狀態(tài)的重要指標。在最高達0.1MHz的頻率范圍內(nèi)對單細胞的阻抗分析允許分割振幅和相位角分量，并允許從非細胞顆粒中區(qū)分細胞以及區(qū)分活/死細胞(Conrad 等，標題:頂PED頂ETRIC AND OPTICAL INTERROGAT1N OF SINGLE CELLS IN AMICR0FLIDIC DEVICE FOR REAL-TIME VIABILITY AND CHEMICAL RESPONSE ASSESSMENT，B1sensors and B1elecrtonics (2008)，23，845-851)。然而，Conrad 等為該分析所用的裝置在測量阻抗信號前捕獲單細胞，并因此不適合于在短時間內(nèi)快速分析數(shù)千個細胞，而所述分析為統(tǒng)計分析提供了合理基礎。
[0027]所述方法的適宜性或適用性取決于植物細胞尺寸、細胞類型、分析緩沖液、以及阻抗式流式細胞儀。必須針對各個花粉類型關于其通道寬度(channel width)和使用的緩沖液校準微流體設備，懸浮液中的花粉粒通過所述通道寬度移動。
[0028]本發(fā)明提供了允許不依賴于染色技術分析活性的方法，該分析是可再現(xiàn)且可靠的，其不需要非常特別的設備，可以在任何位置應用，并且可以由任何人在短期培訓后實施。
[0029]本文中的“活力”是指細胞或生物體是生理活性的。生理活性的是指該細胞或生物體能夠分裂、繁殖、萌發(fā)、與另一細胞融合(fuse)或融合(melt)和/或進一步發(fā)育。
[0030]分析的植物細胞可以被植物細胞壁、膜或者外壁(exine)包圍。該細胞壁、膜或外壁包圍著植物的典型細胞內(nèi)含物，所述內(nèi)容物包含細胞質(zhì)、一個或多個液泡、一個或多個細胞核、質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等。
[0031]具有外壁的植物細胞是作為細胞壁的非常特定類型的植物細胞。具有外壁的植物細胞被稱為花粉粒，其屬于來源于成熟植物的生殖植物細胞類別。生殖植物細胞通過不同的發(fā)育步驟發(fā)育成卵細胞或花粉粒。
[0032]花粉，哺乳動物精子細胞的植物等價物，也被稱作生殖細胞或孢子，對所有植物物種的有性生殖是至關重要的?；ǚ墼诨ㄑ康幕ㄋ巸?nèi)從小孢子母細胞經(jīng)由兩次細胞分裂(二分體(兩個二倍體細胞)和四分體(四個單倍體細胞形式))發(fā)育成單倍體未成熟的花粉粒或小孢子。從四分體釋放后，小孢子經(jīng)由不同的階段發(fā)育成可用于授粉的成熟花粉粒。只有與柱頭接觸的物種相關的、健康且有活性的花粉才會萌發(fā)，并形成朝向植物卵細胞(胚珠)的花粉管，花粉管頂端進入珠孔(microphylla)后，植物卵細胞(胚珠)受精。雙受精之后，胚乳(等同于哺乳動物胎盤)和合子胚將形成并在種皮(seed coat)內(nèi)成熟。大部分的花粉粒具有單倍體核內(nèi)容物(一組染色體)，但其也可以是二倍體(兩組染色體)或多倍體或非整倍體。
[0033]本文中的“成熟植物”是指已經(jīng)達到發(fā)育的晚期階段以使得該植物產(chǎn)生至少一個生殖器官，優(yōu)選多個此類器官的植物，其中，從此類生殖器官中可以獲得活性后代。此生殖器官可以是性生殖器官，例如花，或營養(yǎng)生殖器官(vegetative reproductive organ)，例如塊莖、匍匐枝、根莖、球莖、球芽或鱗莖。
[0034]本文中花可以是單性的，即具有至少一個雄性生殖器官(雄蕊)或者至少一個雌性生殖器官(雌蕊)；或者在本文中花可以是雙性的，即具有至少一個雄性生殖器官和至少一個雌性生殖器官。
[0035]本文中花可以是可育的或是不育的。在可育花的情況下，此花產(chǎn)生功能性花粉和一個或多個功能性卵細胞，其隨后能夠產(chǎn)生活性后代。具有功能性花粉和一個或多個功能性卵細胞的花可以不僅通過自花受精、而且通過異花受精產(chǎn)生一個或多個種子。在不育花的情況下，由于分別不存在任何花粉或存在無功能性花粉，此花不通過自花受精產(chǎn)生種子，但可以通過異花受精產(chǎn)生種子。此花可以是雄性不育或雌性不育的。然而，雄性不育花可以通過來自另一花的功能性花粉而受精。雌性不育花的花粉可用于使另一花受精。此花的雄性不育性可以是細胞質(zhì)雄性不育性(CMS)、孢子體自交不親和性(sporophyticself-1ncompatibility)、配子體自交不親和性(gametophytic self-1ncompatibility)或任何其他不育系統(tǒng)的結果。上述生物學術語以其領域認可的含義使用。
[0036]本文中術語“植物細胞”是指任何源自植物或植物材料(包括藻類)的細胞。也指原生質(zhì)體或來自液體懸浮液的任何細胞，等等。本文中術語“植物材料”是指任何外植體，源于來自植物的任何結構、組織或器官的塊(piece)或插條(cutting)。本文中的植物材料也可指植物的任何組織或器官。從中得到所述外植體、塊或插條的所述植物組織或器官包括子葉、下胚軸、上胚軸、種子、愈傷組織、葉、根、枝條(shoot)、花、花藥、花粉、胚珠、卵細胞、果實、分生組織、原基、花序、葉柄、原生質(zhì)體、庫組織(sink tissue)、源組織、苗(seedling)、庫器官(sink organ)、源器官、塊莖、合子胚、體細胞胚或源自單倍體的加倍的單倍體的胚。在這方面還包括細胞培養(yǎng)物，例