一種灌木柳花粉離體培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種灌木柳花粉離體培養(yǎng)的條件，包括以下步驟：（1）花粉的采集；（2）培養(yǎng)基的制備；（3）培養(yǎng)方式；（4）培養(yǎng)溫度和時(shí)間的設(shè)定。本發(fā)明所述的離體培養(yǎng)基測得的灌木柳花粉生活力比一般染色法測得的花粉生活力更為準(zhǔn)確，灌木柳花粉在該培養(yǎng)基上萌發(fā)效果好，易觀察，且花粉在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)避免了在因液體培養(yǎng)基流動而造成的試驗(yàn)誤差，成本低，易操作，在灌木柳繁殖生產(chǎn)上具有重要的實(shí)踐與推廣意義。
【專利說明】一種灌木柳花粉離體培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物花粉離體培養(yǎng)的方法，具體是涉及一種灌木柳花粉離體培養(yǎng) 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 柳屬L.)是楊柳科最大的屬，約550種，我國柳屬植物255種，約占全世 界總數(shù)的46%，是全世界柳屬植物最多、最豐富的地區(qū)，在全國各省、區(qū)廣泛分布，而柳屬絕 大部分為灌木柳。灌木柳在歐美國家也是重要的能源樹種。
[0003] 花粉作為灌木柳種質(zhì)的形式之一，包含了灌木柳的所有基因類型，具有豐富的遺 傳多樣性，是灌木柳種質(zhì)保存以及雜交育種的重要材料。但大多數(shù)灌木柳雌雄異株，花期不 遇，且花粉自然條件下壽命短，這給灌木柳種質(zhì)研究及其雜交育種工作帶來極大的不便，同 時(shí)也不利于灌木柳的遺傳性狀研究。雖然柳樹花粉采集和貯藏在歐洲柳樹繁殖中已有應(yīng) 用，但對其提取和貯藏得方法沒有具體描述。1996年，Stanto對楊樹花粉的采集和貯藏作 了詳細(xì)研究，該方法并不適用于柳樹。楊樹花是典型的風(fēng)媒傳粉，而柳樹為蟲媒傳粉，且柳 樹花粉表面有一層粘合物質(zhì)。王源秀利用M&培養(yǎng)基檢測五種柳樹及其雜家后代的花粉活 力，發(fā)現(xiàn)柳樹種間，雜交種間及親本雜種之間的花粉生活力差異較大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種方便快捷、能準(zhǔn)確測定灌木柳花粉生活力的離體培養(yǎng) 方法。
[0005] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種灌木柳花粉離體培養(yǎng)方法，它包括如 下步驟： (1) 花粉的采集：將半開的灌木柳雄株花枝采回并置于溫室內(nèi)水培，待花盛開后，收集 花粉，備用； (2) 培養(yǎng)基的制備：培養(yǎng)基主要成分為蔗糖、硼酸、可溶性鈣鹽和瓊脂，將培養(yǎng)基倒入培 養(yǎng)皿中備用； (3) 花粉培養(yǎng)：將步驟（1)采集的新鮮灌木柳花粉均勻散布在步驟（2)制備的培養(yǎng)基 上，置于光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)； (4) 設(shè)定培養(yǎng)溫度和時(shí)間：將步驟（3)中的培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為20 ~ 25攝氏度，光照培 養(yǎng)時(shí)間為10 ~ 18小時(shí)后可進(jìn)行萌發(fā)率觀測，花粉活力可達(dá)60%-80%。
[0006] 步驟（1)中，所述灌木柳雄株花枝為春季在生長健壯的灌木柳雄株上，于萌條的 中、上部剪取花芽飽滿、芽數(shù)較多的枝條。此枝條發(fā)育良好，營養(yǎng)充足，成熟度高，后期花粉 萌發(fā)率高。
[0007] 步驟（1)中，所述溫室培養(yǎng)條件為：溫度2(T25 °C，光照2000 Lux，光照時(shí)間16 h/ d，相對濕度659Γ75%。
[0008] 步驟（2)中，所述培養(yǎng)基為：200 mg/L硼酸+ 10(T200 mg/L硝酸鈣+ 5(T200 g/ L蔗糖+ 7 g/L瓊脂，培養(yǎng)基成分比例因灌木柳品種不同而存在差異。蔗糖為柳樹花粉離 體萌發(fā)提供碳源；H3B03在花粉萌發(fā)中的主要作用是可以增加糖的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝，促進(jìn) 構(gòu)成花粉管壁的成分果膠物的合成；外源Ca 2+可通過鈣通道調(diào)節(jié)花粉管內(nèi)的動態(tài)來影響花 粉管的生長，低濃度的Ca2+濃度有利于柳樹花粉萌發(fā)。
[0009] 步驟（4)灌木柳培養(yǎng)溫度為20-25攝氏度。所述花粉萌發(fā)是花粉細(xì)胞內(nèi)一系列生 化反應(yīng)的結(jié)果，而適宜的溫度是生化反應(yīng)正常進(jìn)行的基本條件之一。不同植物間花粉萌發(fā) 和花粉管生長的最適溫度存在顯著差異。
[0010] 步驟（4)中，所述花粉萌發(fā)需要一定的時(shí)間，灌木柳的培養(yǎng)時(shí)間為10?18h，隨培 養(yǎng)時(shí)間的延長，花粉萌發(fā)率先呈逐漸升高趨勢；一定時(shí)間后，萌發(fā)率不再增加，但隨著培養(yǎng) 時(shí)間的延長，花粉管生長過長，不便于觀測。最佳培養(yǎng)時(shí)間為12h。 toon] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 1、采用本發(fā)明所述的離體培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉，可以在測灌木柳花粉生活力時(shí)直接觀察到 花粉管的發(fā)育情況，較直觀的反應(yīng)出花粉的生活力。本發(fā)明中蔗糖、硼酸和硝酸鈣三個(gè)影 響灌木柳花粉萌發(fā)的主要因素濃度適宜，避免了因過高濃度的蔗糖會致使花粉產(chǎn)生質(zhì)壁分 離，造成原生質(zhì)體脫水，抑制花粉萌發(fā)的現(xiàn)象。
[0012] 2、采用本發(fā)明所述的離體培養(yǎng)測灌木柳花粉生活力與其他染色法測定花粉生活 力相比，成本低，易操作，且避免了染色法中因統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率過程中花粉細(xì)胞遭到破壞染液完 全進(jìn)入細(xì)胞而造成的誤差。
[0013] 3、采用本發(fā)明所述的離體培養(yǎng)基培養(yǎng)灌木柳花粉試驗(yàn)周期短，培養(yǎng)條件簡單。
[0014] 綜上所述：本發(fā)明所述的離體培養(yǎng)基測得的灌木柳花粉生活力比一般染色法測得 的花粉生活力更為準(zhǔn)確，灌木柳花粉在該培養(yǎng)基上萌發(fā)效果好，易觀察，且花粉在固體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)避免了在因液體培養(yǎng)基流動而造成的試驗(yàn)誤差，成本低，易操作，在灌木柳繁殖生 產(chǎn)上具有重要的實(shí)踐與推廣意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為培養(yǎng)時(shí)間對灌木柳花粉離體培養(yǎng)的影響；圖中，P63表示簸箕柳；P102表示 銀柳；2333表示蒿柳X毛枝柳；2383表示簸箕柳X蒿柳。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0017] 實(shí)施例1 (1) 花粉的采集：將半開的銀柳（5： 雄株花枝采回并置于溫室內(nèi)水培至花 盛開，溫度控制在20?25攝氏度，待花盛開后，收集花粉于5mL的離心管中， (2) 培養(yǎng)基的制備：篩選出銀柳的最佳培養(yǎng)基為150g/L蔗糖+200mg/L硼酸+100mg/L 硝酸鈣+7g/L瓊脂，備用； (3) 花粉培養(yǎng)：將新鮮銀柳花粉均勻散布在步驟（2)制備的培養(yǎng)基上，并置于LRH-300G 光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)，光照度為2000Lux ; (3) 設(shè)定培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為25攝氏度； (4) 設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，花粉萌發(fā)率先呈逐漸升高趨勢；12h后，萌發(fā) 率不再增加。結(jié)果如表1所示。
[0018] 表1培養(yǎng)時(shí)間與銀柳花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)率變化的關(guān)系

【權(quán)利要求】
1. 一種灌木柳花粉離體培養(yǎng)方法，其特征在于，它包括如下步驟： (1) 花粉的采集：將半開的灌木柳雄株花枝采回并置于溫室內(nèi)水培，待花盛開后，收集 花粉，備用； (2) 培養(yǎng)基的制備：培養(yǎng)基主要成分為蔗糖、硼酸、可溶性鈣鹽和瓊脂，將培養(yǎng)基倒入培 養(yǎng)皿中備用； (3) 花粉培養(yǎng)：將步驟（1)采集的新鮮灌木柳花粉均勻散布在步驟（2)制備的培養(yǎng)基 上，置于光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)； (4) 設(shè)定培養(yǎng)溫度和時(shí)間：將步驟（3)中的培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為20 ~ 25攝氏度，光照培 養(yǎng)時(shí)間為10 ~ 18小時(shí)后可進(jìn)行萌發(fā)率觀測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灌木柳花粉離體培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（1)中，所述灌 木柳雄株花枝為春季在生長健壯的灌木柳雄株上，于萌條的中、上部剪取花芽飽滿、芽數(shù)較 多的枝條。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灌木柳花粉離體培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（1)中，所述溫 室培養(yǎng)條件為：溫度2(T25 °C，光照2000 Lx，光照時(shí)間16 h/d，相對濕度659Γ75%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灌木柳花粉離體培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（2)中，所述培 養(yǎng)基為：200 mg/L硼酸+ ΚΚΓ200 mg/L硝酸鈣+ 5(T200 g/L蔗糖+ 7 g/L瓊脂。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述灌木柳花粉離體培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（3)中，光照度為 2000Lux〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述灌木柳花粉離體培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（4)中，灌木柳的 培養(yǎng)溫度為25°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述灌木柳花粉離體培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（4)中，灌木柳花 粉萌發(fā)的培養(yǎng)時(shí)間為12h。
【文檔編號】C12N5/04GK104232561SQ201410491744
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】何旭東, 姚伶, 何開躍, 王保松, 王紅玲, 黃瑞芳, 施士爭 申請人:江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院