用于確定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于確定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法，以及微流體設(shè)備的用途，所述微流體設(shè)備包括至少一個特定微流體芯片并且適配于用交流電(AC)實施阻抗式流式細胞術(shù)(IFC)。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞活力的分析，特別是花粉粒的細胞活力的分析，在植物育種以及通過種子的植物產(chǎn)生過程的各個方面扮演重要角色。
[0003]未成熟的花粉粒(小孢子)的活力的分析對于純合的親本系的產(chǎn)生及其特定方案或方法的開發(fā)是重要的。從花粉粒中產(chǎn)生親本系使得育種循環(huán)的許多代安全，并因此被認為對于有效親本系產(chǎn)生是至關(guān)重要的。然而，為了這些系的最佳產(chǎn)生，它們的供體植物必須在最佳條件下生長。
[0004]花粉質(zhì)量的分析在雄性不育母系的選擇期間扮演重要角色?；谥煌ㄟ^雌性遺傳的細胞質(zhì)雄性不育性的雄性不育母系的使用，不僅在蟲媒和風(fēng)媒授粉物種中是優(yōu)選的，而且在人工授粉物種中也是優(yōu)選的。由于花粉丟失，雄性不育母系不能自授粉，這防止了 Fl種子被母系材料污染，并且具有可以省去勞動密集型去雄步驟的優(yōu)點。
[0005]高質(zhì)量的花粉對于有效的Fl雜交種子的產(chǎn)生至關(guān)重要。高花粉質(zhì)量將帶來最大結(jié)籽率(seed set)，而較低的質(zhì)量將導(dǎo)致較低的產(chǎn)量，并因此導(dǎo)致每粒種子的更高生產(chǎn)成本。花粉質(zhì)量受其遺傳組成、植株生長條件的影響，但也受殺蟲劑的影響。在產(chǎn)生過程之前和產(chǎn)生過程期間施用殺蟲劑以保持結(jié)果植物(fruit-bearing plants)健康是常規(guī)實踐，因為這可以在可以分別收獲果實和種子之前的長達兩個月開始。因此，花粉的活力應(yīng)該在種子產(chǎn)生期間被持續(xù)監(jiān)測，分別以預(yù)示/預(yù)測和控制產(chǎn)生，以估計授粉的最佳時間點，例如，施用殺蟲劑之后，或者測試哪種殺蟲劑是不合適的，或者檢查其他化學(xué)制品(例如，化肥)的效果，或者生長情況。
[0006]育種和Fl雜交種子產(chǎn)生以及種質(zhì)保存程序中的另一種常規(guī)實踐是使用儲存的花粉進行。對于任何儲存程序，應(yīng)該使用最高質(zhì)量的花粉。該領(lǐng)域中的常規(guī)花粉活力分析將允許儲存方案和后續(xù)過程的優(yōu)化。
[0007]當前，不存在有效、高通量且容易實施的技術(shù)來原地(on-site)分析花粉質(zhì)量。
[0008]通常，通過各種經(jīng)典方法，如染色技術(shù)或者體外萌發(fā)測定來確定花粉活力。然而，來自各種染色技術(shù)的結(jié)果不總是與體外萌發(fā)相關(guān)，并且其不適用于所有物種。該染色技術(shù)基于酶促反應(yīng)，該酶促反應(yīng)可能不是在所有植物物種的花粉中存在，并且體外花粉萌發(fā)高度取決于正確的條件，該條件需要單獨調(diào)整。現(xiàn)有分析花粉活力和萌發(fā)的方法均受限于在特定時間范圍內(nèi)可以分析的細胞的數(shù)量，并且它們在制備和分析中是耗時的。
[0009]另外，當前技術(shù)接下來需要特定的化學(xué)制品，各種特定設(shè)備，如，熒光顯微鏡、培養(yǎng)箱，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員。通常，這意味著這些分析在分析實驗室中實施，而不能在溫室或曠野的植物之間“原地”實施。最終，由于這些分析實施起來相當復(fù)雜并且涉及從樣品制備到分析的數(shù)個易錯步驟，所以它們的再現(xiàn)性在跨越整個種子產(chǎn)生過程的不同位置(即急需這些數(shù)據(jù)的不同地點)變化巨大。因此，經(jīng)驗顯示，在不同地理位置和甚至在密切相關(guān)的分析實驗室中獲得的花粉活力數(shù)據(jù)也不總是可比較的，并且遭受主觀誤差。
[0010]對于評價花粉和植物質(zhì)量的可靠裝置和方法的需求被廣泛認可。WO 2012/129199A2公開了此類用于鑒別和分選花粉以及確定花粉活力的方法。對于這些分析，需要常規(guī)的基于熒光的流式細胞儀或者光密度測量。對于基于熒光的分析，遺傳標記物的存在/不存在是強制性的，以便當特定染料結(jié)合于各個細胞時允許鑒別。即使該技術(shù)提供了統(tǒng)計數(shù)據(jù)，其仍不適合于原地分析，并且只有在此類遺傳標記物可用時才起作用。另一方面，光密度測量提供了一種用于鑒別正在分裂的花粉(lysing pollen)的手段，但如果花粉細胞處于具有潛在變化的光密度和仍然活性特征的不同發(fā)育階段，則該光密度測量可能提供混淆數(shù)據(jù)。在這方面，WO 2012/129199 A2沒有公開支持數(shù)據(jù)。
[0011]就節(jié)約生產(chǎn)和后續(xù)成本而言，例如即將用在Fl雜交種子產(chǎn)生中的花粉細胞的“原地”分析具有巨大的商業(yè)利益。在低質(zhì)量(低活力)花粉的情況下，可以決定不將其用于授粉，減少花粉儲存程序、大規(guī)模人工授粉、培育材料直到果實收獲，種子摘取和進一步處理的后續(xù)努力。育種材料的花粉的“原地”分析允許簡單且直接地選擇雄性可育/雄性不育、耐熱和/或耐鹽植物，使得選擇過程更有效以及減少培育和維持選擇的個別植物的勞動。
[0012]不僅種子產(chǎn)生，而且果實產(chǎn)生，均依賴于用良好質(zhì)量花粉的花的受精。一方面殺蟲劑的未知影響以及另一方面對大規(guī)模人工授粉的需求(例如由于各種昆蟲的滅絕)需要簡單的工具以確定花粉質(zhì)量。
[0013]因此，本發(fā)明要解決的問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，并提出了在植物育種和/或種子產(chǎn)生過程中以有效且可靠的方式簡單且快速的分析植物細胞的方法。另外，所述分析應(yīng)該允許在特定過程內(nèi)的標準化并且在不同位置可適用，在同樣的研究/產(chǎn)生地點(溫室、曠野、實驗室)或在不同的地理區(qū)域也是如此，因為種子制造商通常全球操作。
[0014]用于上述過程的植物細胞分析的高度復(fù)雜性這一問題通過如方法權(quán)利要求1和用途權(quán)利要求中要求保護的本發(fā)明而解決。更多有利的實施方式在各個從屬權(quán)利要求(subclaims)中要求保護。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]根據(jù)權(quán)利要求1，用于確定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法，包括:
[0016]從花中機械移取未成熟或成熟的花粉粒；
[0017]在導(dǎo)電的、特定的且明確定義的緩沖液中重懸花粉粒，用于使所述植物細胞保持活性；
[0018]將花粉懸浮液通過具有適合于微流體設(shè)備的孔徑的適當?shù)倪^濾器，所述微流體設(shè)備適配于實施阻抗式流式細胞術(shù)(IFC);
[0019]將過濾的懸浮液通過針對各個花粉類型校準的微流體設(shè)備，并以預(yù)定頻率測量花粉粒的阻抗；
[0020]存儲測量的各花粉的阻抗值以及測量頻率，所述阻抗值具有幅值和其相關(guān)相位角；
[0021]計數(shù)過濾的懸浮液中的花粉粒；以及
[0022]根據(jù)振幅和/或相位值，通過手工或自動設(shè)定合適的門控以鑒別花粉粒，并確定分析的花粉群的活力比或成熟度。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明描述了在導(dǎo)電的、特定的且明確定義的緩沖液中重懸收獲的花粉粒，用于使所述植物細胞保持活性，以及使用射頻阻抗分析用于原地花粉質(zhì)量確定，以及將其整合進相關(guān)蔬菜和果實植物的植物育種和種子產(chǎn)生過程中。導(dǎo)電、特定的且明確定義的緩沖液必須具有使細胞在制備和測量期間保持存活的能力，以及為通過使用射頻阻抗分析的所述測量提供充分導(dǎo)電性的能力。因此，該緩沖液必須適合于被分析物種的細胞類型。
[0024]通過該方法，不僅可以容易地原地區(qū)分活的和死的花粉細胞，而且還可以以高效的方式區(qū)別發(fā)育中花粉的不同發(fā)育階段。該分析方法能夠在植物育種過程以及種子產(chǎn)生期間施用，且通過以下有助于植物育種:通過選擇雄性不育系，通過經(jīng)由監(jiān)