小麥黃花葉病毒雙抗夾心生物素-親和素elisa檢測(cè)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種小麥黃花葉病毒雙抗夾心生物素-親和素 ELISA檢測(cè)方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV)是一種由禾谷多黏菌 (Polymyxa graminis L.)傳播的麥類土傳病毒，禾谷多黏菌是一種專性寄生于植物根部的 真核低等生物，該介體分布范圍廣，可在30多種禾谷類作物和雜草上寄生，且擁有抗逆性 很強(qiáng)的休眠孢子和完成侵染循環(huán)的游動(dòng)孢子，只要條件適宜，即可激發(fā)游動(dòng)孢子攜帶病毒 侵染寄主的根系，造成嚴(yán)重的病害。小麥黃花葉病由日本的Sawada在1927年首次發(fā)現(xiàn)并 描述，至今仍是麥類生產(chǎn)上的一種重要病害。在自然條件下WYMV常與中國(guó)小麥花葉病毒 (Chinese wheat mosaic virus，CffMV)復(fù)合侵染小麥，導(dǎo)致嚴(yán)重的田間病害，這兩類病毒都 屬于真菌傳棒狀病毒組，電鏡下觀察病毒粒子為直棒狀二分體。
[0003] 小麥黃花葉病主要分布在日本、韓國(guó)和中國(guó)。我國(guó)目前主要分布于長(zhǎng)江、黃河中下 游和淮河流域，包括四川、陜西、江蘇、浙江、安徽、湖北、山東和河南等省，其中江蘇省的里 下河地區(qū)和寧鎮(zhèn)揚(yáng)丘陵地區(qū)、湖北省東北沿大別山地區(qū)、陜西省渭河流域關(guān)中地區(qū)發(fā)生較 重。該病害已經(jīng)成為我國(guó)冬小麥產(chǎn)區(qū)的一種重要的病毒病，對(duì)小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)有嚴(yán)重影 響。一般病田發(fā)病減產(chǎn)10%-30%，嚴(yán)重的達(dá)70%-80%，甚至絕收。為了監(jiān)測(cè)和防控小麥 黃花葉病的發(fā)生和擴(kuò)散，急需建立該病害的高度特異和靈敏的檢測(cè)方法。
[0004] 目前，對(duì)病害的檢測(cè)方法主要有直接觀察法、分子生物學(xué)法和血清學(xué)方法。癥狀觀 察是判斷田間發(fā)病情況的一種比較常用和直觀的方法。但由于發(fā)病癥狀的相似性，隱癥現(xiàn) 象，以及復(fù)合侵染的情況，所以這種方法一般情況下判斷不夠準(zhǔn)確。RT-PCR的檢測(cè)方法雖然 比較靈敏且特異性好，但由于它的花費(fèi)成本大且儀器要求高，一般局限于實(shí)驗(yàn)室用。綜合而 言，血清學(xué)方法操作簡(jiǎn)便、特異性好、靈敏度高且成本低，更適用于田間大規(guī)模樣品的檢測(cè)， 并易于在基層進(jìn)行推廣。WYMV的血清學(xué)檢測(cè)方法是通過(guò)制備抗血清，利用ELISA或Western blot對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)和研究。向榮等和韓成貴等分別制備了 WYMV Pl和CP的抗血清，可 以通過(guò)ELISA或Western blot等血清學(xué)手段檢測(cè)病毒；尚巧霞等建立了 WYMV ELISA檢測(cè) 系統(tǒng)。但這些以多抗建立的血清學(xué)方法未見(jiàn)其在田間樣品大規(guī)模檢測(cè)中應(yīng)用的報(bào)道。因 此本實(shí)驗(yàn)室利用提純的WYMV病毒粒子為免疫原，經(jīng)雜交瘤技術(shù)獲得了幾株能夠高效分泌 抗WYMV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，利用雜交瘤細(xì)胞制備了腹水單抗。在常規(guī)以單抗為核 心建立的能準(zhǔn)確檢測(cè)小麥中WYMV的ACP-ELISA、TAS-ELISA、dot-ELISA等血清學(xué)方法的基 礎(chǔ)上，有研究表明生物素-親和素（Biotin-Avidin)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一門(mén)生物學(xué) 技術(shù)，依靠其高度的特異親和性、復(fù)合物的穩(wěn)定性、可與酶及固相載體等的偶聯(lián)性、多級(jí)放 大性等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等，目前應(yīng)用于植物 病毒的檢測(cè)上還較少，基于提高WYMV血清學(xué)檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、可操作性和推廣 性等方面，本研究對(duì)WYMV抗體進(jìn)行了配對(duì)篩選和生物素標(biāo)記，建立了 WYMV雙抗夾心生物 素-親和素 ELIAS檢測(cè)方法，并成功應(yīng)用于田間小麥黃花葉病毒的檢測(cè)，為WYMV田間大規(guī) 模快速檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)提供了物質(zhì)和技術(shù)支撐，從而推動(dòng)了小麥黃花葉病的預(yù)報(bào)預(yù)警和科學(xué)防 控體系的建立。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、 特異性強(qiáng)、應(yīng)用廣泛且適合大量樣本檢測(cè)的小麥黃花葉病毒（WYMV)雙抗夾心生物素-親和 素 ELISA檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] -種小麥黃花葉病毒雙抗夾心生物素-親和素 ELISA檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0008] 1)每孔用IOOuL病毒特異性抗體包被酶標(biāo)板，37°C放置2h后，4°C過(guò)夜放置，洗板， 甩干；
[0009] 2)每孔加入200uL含10%小牛血清的磷酸鹽緩沖液，37°C孵育2h，洗板，甩干；
[0010] 3)每孔分別加入IOOuL待檢病毒樣品、陽(yáng)性和陰性樣品，37°C孵育lh，洗板，甩 干；
[0011] 4)每孔加入IOOuL生物素標(biāo)記的二抗，37°C孵育lh，洗板，甩干；
[0012] 5)每孔加入IOOuL親和素標(biāo)記的酶，37°C孵育lh，洗板，甩干；
[0013] 6)每孔加入IOOuL顯色底物，37°C孵育5~15min進(jìn)行顯色反應(yīng)，肉眼觀察顯色后 每孔加入IOOuL終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，以大于等于陰性對(duì)照OD值3倍的作物陽(yáng)性結(jié) 果的閾值。
[0014] 優(yōu)選的，步驟1)所述病毒特異性抗體為小麥黃花葉病毒純化單抗2D4。
[0015] 優(yōu)選的，步驟1)中，用PH 9. 6的0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液將病毒特異性抗體稀 釋為5~10ug/mL濃度后包被酶標(biāo)板。
[0016] 優(yōu)選的，步驟1)、2)、3)、4)和5)中洗板用的洗滌液為PH 7. 4含0. 5mol/L Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
[0017] 優(yōu)選的，步驟4)所述生物素標(biāo)記二抗為生物素標(biāo)記的小麥黃花葉病毒純化的單 抗2D3,使用濃度為0. 2ug/mL。
[0018] 優(yōu)選的，步驟5)所述親和素標(biāo)記的酶為辣根過(guò)氧化物酶。
[0019] 優(yōu)選的，步驟6)所述顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺。
[0020] 優(yōu)選的，步驟6)所述終止液為2mol/L硫酸溶液。
[0021] 優(yōu)選的，步驟6)所述OD值在波長(zhǎng)450nm下測(cè)定。
[0022] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果：
[0023] 1)本發(fā)明結(jié)合生物素-親和素系統(tǒng)的高度放大作用和抗原-抗體識(shí)別的特異性， 建立了一種用于檢測(cè)小麥黃花葉病毒的新的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法檢測(cè)小麥黃花葉病毒的 靈敏度高于ELISA，與RT-PCR比較靈敏度略低，但特異性一致，因此可有效地應(yīng)用于田間小 麥黃花葉病毒的早期診斷和監(jiān)測(cè)。
[0024] 2)本發(fā)明建立的檢測(cè)小麥黃花葉病毒的雙抗夾心生物素-親和素 ELISA方法，既 不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備，又可以一次性檢測(cè)大量樣品，不但節(jié)約了檢測(cè)成 本，還達(dá)到了簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定的檢測(cè)效果。
[0025] 3)本發(fā)明建立的方法因高度的靈敏度和特異性而減少抗體的用量，大大節(jié)約了檢 測(cè)成本；生物素-親和素的偶聯(lián)放大作用，大大提高了特異和準(zhǔn)確性。
[0026] 4)本發(fā)明建立的方法，因其操作簡(jiǎn)便、適用性強(qiáng)等特點(diǎn)，可有效地作用于田間作物 中小麥黃花葉病毒的大規(guī)模檢測(cè)，且可在基層推廣應(yīng)用，為該病毒病的預(yù)測(cè)預(yù)警和科學(xué)防 控提供了物質(zhì)和技術(shù)支撐。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為雙抗夾心生物素-親和素 ELISA (BA-ELISA)方法檢測(cè)小麥黃花葉病葉的靈 敏度分析圖；
[0028] 圖2為酶聯(lián)雙抗體夾心ELISA(TAS-ELISA)方法檢測(cè)小麥黃花葉病葉的靈敏度分 析圖；
[0029] 圖3為田間小麥樣品檢測(cè)小麥黃花葉病毒的RT-PCR結(jié)果（M為Marker III ;1-9 為小麥樣品；10為感染W(wǎng)YMV植株；11為健康植株）。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明在常規(guī)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素與親和素間的高度信號(hào) 放大作用，建立了一種檢測(cè)系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為 68kDa，由4個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素有非常高的親和力（結(jié)合常數(shù)高達(dá)1015M-1)。生物素 很易與蛋白質(zhì)（如抗體等）以共價(jià)鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性 抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，即起到了多級(jí)放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)的催化 作用而呈色，從而大大提高了檢測(cè)小麥黃花葉病毒抗原靈敏度的目的。
[0031] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 小麥黃花葉病毒單克隆抗體的制備：
[0034] 1.免疫原的制備及免疫動(dòng)物
[0035] 用蔗糖硫酸銫不連續(xù)密度梯度離心法提純小麥黃花葉病毒粒子，再用提純的病毒 粒子免疫4-5周齡體重18-20g BALB/c雌性小鼠。初次免疫：提純的WYMV病毒粒子用生理 鹽水加以稀釋，與等體積弗氏完全佐劑（Freund' s complete adjuvant，F(xiàn)C)混合，充分乳 化后經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射；3周后再次免疫：免疫原仍用生理鹽水稀釋，再與等體積的弗 氏不完全佐劑（Freund's incomplete adjuvant，F(xiàn)IA)充分乳化后，進(jìn)行腹腔注射；之后每 隔3周進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫：取2倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射。第四次免疫3天后取脾細(xì)胞 進(jìn)行融合。
[0036] 2.細(xì)胞融合
[0037] 取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0)按10 : 1的比例，在無(wú)血清 的RPMI-1640培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50% PEG(Sigma，分子量 1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入lmL，使其融合2min，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng) 基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì) 胞板中，37 °C，5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0038] 3.雜交瘤細(xì)胞、陽(yáng)性孔的篩選及其克隆
[0039] 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等 到融合細(xì)胞覆蓋孔底5% -50%時(shí)，以感染W(wǎng)YMV的小麥葉片和提純病毒為檢測(cè)抗原包被，用 常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲42個(gè)陽(yáng)性孔。選擇10個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn) 行有限稀釋法克隆，獲得4株能分泌抗WYMV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)6個(gè)月以上 體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于 腹水制備和液氮保存。用ACP-ELISA方法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行特異性分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)抗體均能 特異地與小麥黃花葉病毒反應(yīng)；并對(duì)用