專利名稱：牛病毒性腹瀉病毒雙抗夾心生物素-親和素elisa檢測試劑盒及使用方法
牛病毒性腹瀉病毒雙抗夾心生物素-親和素ELISA檢測試劑盒及使用方法技術領域
本發(fā)明屬于動物病毒性疾病的監(jiān)測和診斷試劑研究領域，具體涉及牛病毒性腹 瀉病毒抗原的雙抗夾心生物素-親和素ELISA檢測試劑盒及使用該試劑盒的檢測方法。
背景技術：
牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)又稱牛病毒性腹瀉-黏膜病毒，在分類學上屬黃病 毒科瘟病毒屬成員，與屬內的豬瘟病毒(CSFV)及羊邊界病毒(BDV)在血清學上有交叉 反應。BVDV是牛群疾病中一種重要病原，其感染?？沙尸F多種臨床癥狀，如高熱、白 細胞減少、下痢、流涎、反芻停止、結膜炎、黏膜出血、持續(xù)性感染、免疫抑制等，還 能引起奶牛產奶量下降，母牛流產、產死胎和畸形胎。
自1946年Olafson等首次在美國紐約州發(fā)現該病以來，已在世界范圍內廣泛流 行，給世界各國畜牧業(yè)造成了嚴重的經濟損失。據文獻統計，從上世紀80-90年代以 來，在北美州，美國、加拿大感染BVDV的陽性率為50-85%;在南美洲，巴西陽性率為 15.1-56%，委內瑞拉陽性率為36-37%，秘魯陽性率為50-96% ；在歐洲，法國、德國血 清學陽性率為76%，瑞典陽性率為10-80%，芬蘭肉牛的陽性率大于50%，波蘭陽性率為 86%,立陶宛陽性率為70-100% ；在澳大利亞和新西蘭陽性率達89%。BVDV除了感染 牛，還能侵害羊、豬、鹿和駱駝等多種野生動物，據調查研究顯示，該病在野生動物中 的感染情況比較廣泛，而且常常呈持續(xù)性感染狀態(tài)。
我國自1983年李佑名首次從國外引起牛的流產胎兒脾臟中分離并鑒定出 BVDV,證明該病在中國的存在。目前已有20多個省市自治區(qū)報道存在該病。王新 平等曾對內蒙古、吉林、寧夏等不同地區(qū)的牛、羊、鹿進行了病原學調查，結果發(fā)現感 染率分別為16.5%-89.0%、14.6%-83.3%、19.6%_44.4%。宋永峰等對浙江、安徽、湖 南、江西、廣西、遼寧等地43份豬病料進行BVDV檢測，結果檢出陽性率為16.3%。 這表明BVDV也同樣嚴重危害著我國畜牧業(yè)的發(fā)展。值得注意的是，自上世紀90年代 來，從世界各地流行地區(qū)牛急性爆發(fā)病例中分離和鑒定的病原幾乎都是基因2型BVDV(BVDV-2)，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經濟損失。因此世界各國將BVDV-2持續(xù)感染牛的 防疫與監(jiān)控作為BVDV流行病學調查的重點。
隨著養(yǎng)牛業(yè)和奶牛業(yè)在我國畜牧業(yè)中所占比重不斷增加，有必要加強對BVDV 的診斷與防控工作。BVDV診斷的方法可從特異性抗體和抗原兩個方面進行，但由于 BVDV持續(xù)性感染，感染動物常表現為免疫耐受，體內抗體滴度低，且終身排毒及受母 源抗體影響，抗原檢測更具有實際意義。用于抗原檢測的方法眾多，但相比之一，適用 于基層、大批樣品檢測的方法仍為ELISA。ELISA檢測方法已經成為國內外動物疫病常 規(guī)的診斷技術。在歐美許多養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達的國家，都將雙抗夾心ELISA作為根除BVDV持 續(xù)感染牛的一種診斷方法，并都制備成試劑盒；且這些試劑盒價格昂貴，在我國大規(guī)模 運用檢測受到一定的限制。為此，隨著我國養(yǎng)牛業(yè)和奶牛業(yè)的快速發(fā)展，BVDV感染率不斷升高，建立一種適應我國國情的BVDV檢測方法勢在必行。 發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、靈敏度高、特異性強、適合大規(guī)模檢測的單 克隆抗體介導的雙抗夾心ELISA方法。
本發(fā)明的技術方案(1)檢測抗原的制備a)優(yōu)化pET^a_BE2重組菌的表達條件，大規(guī)模誘導表達E2糖蛋白b)純化E2糖蛋白，并用SDS-PAGE分析檢測確定抗原濃度(2)單克隆抗體3D8的制備a)純化的表達E2蛋白的pEC143質粒與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑乳化，制 備免疫原，免疫BALB/c小鼠b)免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，間接ELISA篩選分泌抗E2蛋白的單克 隆抗體陽性雜交瘤細胞C) 陽性雜交瘤細胞3D8亞克隆建株、腹水制備與純化(3)單克隆抗體3F9的制備a)純化的890病毒與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑乳化，制備免疫原，免疫 BALB/c小鼠b)免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，間接ELISA篩選c)陽性雜交瘤細胞亞克隆建株、腹水制備與純化(4)雙單克隆抗體(雙抗)夾心生物素-親和素ELISA方法的建立及應用a)3F9生物素標記及效價測定b)雙抗夾心生物素-親和素ELISA方法的建立C) 雙抗夾心生物素-親和素ELISA檢測疑似BVDV臨床樣品 本發(fā)明的牛病毒性腹瀉病毒雙抗夾心生物素-親和素ELISA檢測試劑盒，包括用于 ELISA檢測的洗滌液、顯色液、終止液，Streptavidin-HRP、陽性對照，陰性對照，還有 包被牛病毒性腹瀉病毒單抗3D8的酶標板、生物素標記的牛病毒性腹瀉病毒單抗3F9 (二 抗)O
上述所說的用于ELISA檢測的洗滌液、顯色液、終止液是常規(guī)的。例如，洗滌 液是(0.05%Tween-20+0.01mol/L PH7.4 PBS)，顯色液是(DAB 顯色液)、終止液是(2mol/L H2SO4)。
上述所說陽性對照是篩選出的陽性血清(OD49020.322)，陰性對照是篩選出 的陽性血清(OD490<0.322)。
本發(fā)明還提供了上述試劑盒的使用方法(1)包被用PH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋純化的單克隆抗體3D8至l-2(hig/ml，按 IOOul/孔加于聚苯乙烯微孔板中，37°C放置Zh，然后轉移至4°C，放置過夜。洗滌，甩 干。
(2)封閉含10%小牛血清的pH7.4磷酸鹽緩沖液，150ul/孔，37°C孵育2h。 洗滌，拍干。
(3)加待檢樣品IOOul/孔，37°C孵育lh。洗滌，拍干。
(4)加生物素標記的二抗每孔加IOOul biotin_3F9，37°C孵育lh。洗滌，拍干。
(4)加親和素按 IOOul/孔，加 keptavidin-HRP，37°C孵育 10_20min。洗滌，拍干。
(5)終止每孔加50ul 2mol/L H2SO4,終止反應。
(6)在酶聯免疫閱讀儀上讀取OD49tl值與陽性對照和陽性對照比對。
本發(fā)明的優(yōu)點(1)以雙單抗捕獲BVDV抗原，與豬瘟病毒、1型牛皰疹病毒、牛輪狀病毒均無交 叉反應；(2)由于檢測的是抗原，可避免因體內抗體滴度低而出現漏檢現象；(3)用純化的單克隆抗體包被，特異性高；(4)使用生物素-親和素增敏劑，起放大作用，靈敏度增高，提高檢出率，同時減 少了二抗3F9的用量；(5)對35份疑似BVDV感染病牛血分別用本發(fā)明提供的ELISA和RT-PCR方法進 行檢測，兩種方法的符合率很高，達94.四％。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背 離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于 本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常 規(guī)手段。
本發(fā)明中的生物材料質粒pEC143 (來源于美國賓夕法尼亞大學Dr.Leonard J. Bello 教授，聯系方式為電話(001) 215-898-9596(0),傳真 215-898-7887，Email 為Ijbello@vet.upenn.edu)、pET28a_BE2 (來源于軍事醫(yī)學科學院涂長春教授，聯系 方式為電話 431-87960009(0),傳真 0431-87960009，Email 為 changchun_tu@hotmail. com)、JM109和BL21(DE3)(均為商品化的大腸桿菌工程菌)，均向公眾公開。
實施例1:牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體(McAb) 3D8研制 1實驗方法1.1免疫原的制備取PEC143質粒轉化感受態(tài)宿主菌JM109，挑取單個菌落擴大培養(yǎng)并收獲重組菌， 堿裂解法大量提取質粒pEC143，聚乙二醇沉淀法純化該質粒DNA。以XbaI和Bgl II進 行雙酶切鑒定后，進行DNA定量并免疫小鼠。
1.2小鼠免疫以大腿肌肉注射法用重組pEC143質粒免疫6周齡BALB/c小鼠，每只小鼠注射質粒 前24h，注射25%蔗糖溶液ΙΟΟμ ，每次多點肌注質粒100昭，每隔兩周免疫一次，共免 疫6次，間接ELISA抗體效價達1:104，并于融合前3d加強免疫。
1.3檢測抗原的制備取ρΕ 8&-ΒΕ2質粒轉化感受態(tài)宿主菌BL21 (DE3)，將提取的質粒用限制性內切酶EcoRI和XhoI進行雙酶切鑒定。以IPTG誘導pET28a_BE2重組細菌表達E2蛋白，超聲 波裂解細菌以獲得大量表達的E2重組蛋白。E2重組蛋白的純化參照Polyhistidine-Tagged Proteins (Proteins Ni_TED 2000)說明書進行。以PBS (pH7.2)對浸提液蛋白進行透 析，通過SDS-PAGE電泳檢測分析和測定OD26tl和OD28tl值，確定蛋白濃度。
1.4細胞融合及陽性雜交瘤細胞株篩選將1.0 X IO8個免疫小鼠脾細胞與2.0 X IO7個SP2/0骨髓瘤細胞在50% PEG2 000作用 下按常規(guī)方法進行融合，于96孔培養(yǎng)板中37°C 5%C02飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 檢測抗原E2蛋白包被酶標板，通過間接ELISA法對融合后的雜交瘤細胞上清液進行篩 選。采用有限稀釋法對連續(xù)兩次檢測為陽性的細胞株進行克隆化，同時擴大培養(yǎng)；連續(xù) 克隆化三次以上，直至所有單克隆孔檢測均為陽性且OD49tl值穩(wěn)定后建株，進行擴大培養(yǎng) 并液氮凍存。
有限稀釋法的具體步驟將ELISA檢測為陽性孔中加入200ul培養(yǎng)液，把吹打 下來；吸取IOOul于96孔板Al孔中(提前在A1-A12孔中加IOOul培養(yǎng)液)，做倍比稀 釋，選擇約100個/孔的孔內細胞于6ml培養(yǎng)液中混勻(100個/6ml)；將此細胞混合 液以IOOul/孔(即1.7個/孔)加入新的96孔板中(總共加A-C排，共36孔)；在剩 余的細胞液中補加2.4ml培養(yǎng)液，混勻，將此細胞培養(yǎng)液以IOOul/孔(即0.8個/孔)加 入新的96孔板中(總共加D-F排，共36孔)；在剩余的細胞液中補加1.2ml培養(yǎng)液，混 勻，將此細胞培養(yǎng)液以IOOul/孔(即0.5個/孔)加入新的96孔板中(總共加G-H排， 共對孔)；培養(yǎng)7-10天，觀察，取單個克隆生長的陽性孔再重復以上操作進行亞克隆。
1.5腹水的制備與純化選用10-12周齡BALB/c小鼠5只，每只腹腔注射降植烷0.3mL，8天后，將培養(yǎng)的 雜交瘤細胞以lOOOr/min離心ΙΟη ι，棄去上清液，雜交瘤細胞用無血清的培養(yǎng)液懸浮， 每只小鼠腹腔注射5.8Χ IO5細胞。接種雜交瘤細胞5天后，每日觀察小鼠腹水的生成情 況，待小鼠腹部膨脹明顯時收集腹水，1500rpm離心ΙΟη ι以去除細胞碎片等雜質，間 接ELISA測定上清效價并用二氧化硅吸附法進行純化后，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 1.6 McAb 鑒定1.6.1 McAb的ELISA效價測定用間接ELISA檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)液和腹水中的效價，同時以SP2/0細胞培養(yǎng)上 清液和正常小鼠腹水作為陰性對照，以P/N22.1的最高稀釋倍數為單抗的效價。
1.6.2 McAb特異性檢測將 BVDVl 標準毒株(NADL，Oregon C24V)禾Π 2 株 BVDVl 分離株、BVDV2 標準毒株(890，104)和3株BVDV2分離株、牛輪狀病毒(BRV)、牛皰疹病毒1型 (BHV-I)全病毒、重組表達的Ε2蛋白分別做適當稀釋后包被，以陽性雜交瘤細胞株的 培養(yǎng)上清作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，OPD底物顯色，測定OD49tlIim值。 同時以純化的Ε2蛋白和BVDVl (NADL)病毒為陽性對照，SP2/0細胞上清作為陰性 對照。
1.6.3 Western blotting 鑒定將E2蛋白原核表達產物與5X上樣緩沖液混合，煮沸8η ι，進行SDS-PAGE ；將電 泳條帶進行蛋白質印跡反應，用Bio-Rad轉印系統，以350mA濕法轉印90min，將蛋白條帶轉印至硝酸纖維素(NC)膜上，進行抗原抗體反應，一抗為1:1000稀釋的小鼠腹水， 二抗為1:2000稀釋的羊抗鼠IgM-HRP，二氨基聯苯二胺(DAB)顯色。
1.6.4 McAb 亞類鑒定采用Sgma公司鼠類單克隆抗體亞類鑒定試劑盒說明書進行壇亞類鑒定。
1.6.5 McAb穩(wěn)定性鑒定將分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞體外連續(xù)傳10、20和30代，間接ELISA法測定上 述雜交瘤細胞分泌單克隆抗體的效價。
2實驗結果2.1質粒pEC143的大量提取及酶切鑒定質粒pEC143經堿裂解法大量提取及聚乙二醇法純化后，經1:100稀釋，以XbaI和 Bgl II進行雙酶切，出現了 1.15 和8.85 左右的兩條帶，其中1.15 左右的條帶為插 入的目的片斷E2基因，與預期大小相符合，驗證重組質粒的正確性。
經紫外分光光度儀檢測，測得OD^0/C)D280=1.87，質粒pEC143濃度為2 μ g/ yL。表明質粒的純度和濃度都比較高，可用于免疫小鼠。
2.2 E2抗原表達重組質粒pET28a_BE2的酶切鑒定pET28a-BE2質粒經EcoRI和XhoI雙酶切后，出現了 l.lkb和5.3kb的兩條帶，其中 1.Ikb條帶為插入目的片斷E2基因，與預期大小相符合，而對照pET^a(+)載體酶切后 則只有5.3kb左右，與預期和研究報道相一致。
2.3細胞融合及篩選免疫BALB/c小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合后第14天開始檢測，挑選間接ELISA檢 測結果為陽性，OD490值>1.0且一直比較穩(wěn)定的雜交瘤細胞進行亞克隆，共記錄6塊96 孔細胞培養(yǎng)板中出現明顯細胞克隆的培養(yǎng)孔，計算細胞融合率為70%，陽性率為5.25%。 經選擇培養(yǎng)、特異性抗體檢查、篩選并進行3次有限稀釋法克隆，最終獲得獲得穩(wěn)定分 泌抗體的雜交瘤細胞一株，命名為3D8 (由發(fā)明人所在的揚州大學畜禽病原微生物學研 究室保存，自申請日起向公眾提供20年)。
2.4 McAb 的鑒定 2.4.1 McAb效價測定采用間接ELISA測定雜交瘤細胞株3D8的細胞上清液效價為512，腹水效價10 X 27, 純化腹水單抗含量約為5mg/mL。
2.4.2 McAb特異性的鑒定經間接ELISA檢測，3D8雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清液只與測試的BVDVl型病毒標準株 (NADL、OregonC24V)和2株分離株，BVDV2型病毒標準株(890、104)和3株分離 株，純化的E2蛋白和BVDVl (NADL)病毒發(fā)生反應，而不與牛輪狀病毒(BRV)、牛 皰疹病毒1型(BHV-I)反應，表明該McAb只特異性識別和結合BVDVl和BVDV2。
2.4.3 Western blotting 鑒定pED8a_BE2重組菌誘導表達產物經SDS-PAGE后，進一步轉印至NC膜上，Western blotting鑒定結果表明，約分子量大小43KDa處的一條蛋白帶條被雜交瘤細胞株3D8所分 泌的單克隆抗體特異性識別，而對照載體菌則沒有出現相應的蛋白條帶。由于該蛋白帶 與E2編碼基因表達的BVDVE2囊膜糖蛋白預期大小相一致，表明篩選到的單抗是特異性識別BVDVE2蛋白。
2.4.4 McAb 亞類鑒定雜交瘤細胞株3D8所分泌的單克隆抗體的分子亞類為IgM。
2.4.5 McAb穩(wěn)定性鑒定將所獲得的雜交瘤細胞株3D8連續(xù)傳10、20和30代，采用間接ELISA測定得雜交 瘤細胞株細胞上清效價都能達到512，說明該雜交瘤細胞株連續(xù)傳30代仍能穩(wěn)定地分泌 單克隆抗體。
實施實例2 牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體3F9的研制 1試驗方法1.1病毒的濃縮與純化將收獲的890病毒感染細胞液，反復凍融2-3次，4°C8000rpm/mte離心40η ι，去除 細胞碎片；取病毒上清，在磁力攪拌器攪拌下緩慢加入40%的PEG-6000和固體NaCl， 至其終濃度分別為10%和2.3% ； 4°C條件下磁力攪拌過夜；次日，4°C 12000rpm/min 離心 50η ι，去上清，沉淀物用 TNE 緩沖液(0.0lmol/L Tris,0.1 mol/L NaCl,0.01 mol/ LEDTA鈉鹽，pH7.4)按原培養(yǎng)液體積的1%懸浮沉淀，此即為PEG濃縮病毒。
用20%蔗糖墊底離心純化病毒。用20ml離心管，將20%蔗糖溶液作為墊底， 將PEG濃縮的病毒樣品Iml緩慢鋪于上層，于4°C 36 000rpm/min (BackmanL7_55,水平 轉子SW40Ti)離心3h;棄上清，用適量的TNE緩沖液懸浮沉淀，4°CTNE透析過夜， 純化的病毒用透射電鏡(TEM)觀察。
1.2檢測抗原的制備在優(yōu)化的表達條件下，誘導培養(yǎng)約500mL pET28a-BE2重組細菌，5000rpm離心 IOmin ；棄去上清，以25mL的PBS重懸細菌沉淀，同時加入溶菌酶至終濃度為IOOmg/ L，加入Triton至終濃度為1%，37°C作用15η ι;于冰浴中超聲波裂解細菌至菌液不再粘 稠，4°C 10 OOOrpm離心IOmin沉淀包涵體；用lmol/L的NaCl和0.5%的Triton各洗滌 包涵體沉淀2次；以5mL PBS重懸包涵體沉淀，分裝并于_20°C保存。制備SDS-PAGE 凝膠，使用特制的梳齒，使整面膠只形成一個大的泳道，以加入盡可能多的樣品；電泳 結束后，取下凝膠，以0.25mol/L的KCl對凝膠進行顯色，4°C作用ΙΟη ι后可見乳白色 的蛋白質條帶；對照標準蛋白質切下所需的目的條帶，用滅菌的IXPBS洗滌后轉入無菌 的玻璃研磨器中磨碎。
將研磨后的凝膠小顆粒以浸提液(0.5mol/L Tris-HCl，O.lmmol/LEDTA, 0.15mol/LNaCl, 0.1%SDS, pH7.9)重懸，置4°C過夜，浸提出膠顆粒中的目的蛋白，其 間振搖3-4次，然后12 OOOrpm離心ΙΟη ι，上清即為純化的Ε2蛋白。用pH7.2 PBS對浸提出的蛋白進行透析，通過SDS-PAGE后與標準蛋白marker進行比對，結合OD26tl和 OD28tl值，確定被檢測的抗原濃度。
1.3 McAb 的制備用純化的890病毒液免疫8周齡BALB/c小鼠數只，免疫程序為頸背部皮下多點注 射弗氏完全佐劑乳化的免疫抗原各50Ug/只；三周后皮下注射弗氏不完全佐劑乳化的等 量抗原；二免后間隔約三周再皮下注射等量裸露免疫抗原，IOd后采血，間接ELISA檢 測動物產生的抗體滴度；挑選抗體滴度高的BALB/c鼠在融合前3d腹腔注射裸露免疫抗原進行強化免疫，IOOug/只。3d后將免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規(guī)方法進行 融合，于96孔培養(yǎng)板中37°C，5%C02飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以純化的E2蛋白為 檢測抗原，通過間接ELISA法對融合的雜交瘤細胞上清進行篩選。采用有限稀釋法對連 續(xù)2次檢測為陽性的細胞株進行克隆，連續(xù)克隆化3次至OD490值穩(wěn)定后建株并進行擴大培養(yǎng)。
有限稀釋法的具體步驟將ELISA檢測為陽性孔中加入200ul培養(yǎng)液，把吹打 下來；吸取IOOul于96孔板Al孔中(提前在A1-A12孔中加IOOul培養(yǎng)液)，做倍比稀 釋，選擇約100個/孔的孔內細胞于6ml培養(yǎng)液中混勻(100個/6ml)；將此細胞混合 液以IOOul/孔(即1.7個/孔)加入新的96孔板中(總共加A-C排，共36孔)；在剩 余的細胞液中補加2.4ml培養(yǎng)液，混勻，將此細胞培養(yǎng)液以IOOul/孔(即0.8個/孔)加 入新的96孔板中(總共加D-F排，共36孔)；在剩余的細胞液中補加1.2ml培養(yǎng)液，混 勻，將此細胞培養(yǎng)液以IOOul/孔(即0.5個/孔)加入新的96孔板中(總共加G-H排， 共對孔)；培養(yǎng)7-10天，觀察，取單個克隆生長的陽性孔再重復以上操作進行亞克隆。
1.4 McAb的腹水制備和效價測定選用12周齡BALB/c經產母鼠數只，每只腹腔注射滅菌的降植烷0.3mL，8天后腹腔 注射培養(yǎng)至對數生長期的雜交瘤細胞，5.8X105細胞/只。5天后開始觀察小鼠腹水的生 成情況，待小鼠腹部膨脹到一定程度時收集腹水，4000rpm離心15η ι以去除細胞碎片等 雜質，取上清用間接ELISA測定效價；用飽和(NH4)2SO4鹽析法純化McAb，核酸蛋白 儀測含量。
1.5 McAb 鑒定1.5.1 McAb的穩(wěn)定性檢測將分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞體外連續(xù)傳20代后，用間接ELISA法測定雜交瘤細 胞分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性。
1.5.2 Western-boltting參照《分子克隆實驗指南》方法，將原核表達產物E2蛋白(BVDV-I)、真核表達 產物 E2s-C3d(BVDV_2)、E2s (BVDV-I)、病毒株 890、NADL> 分離株 XJ-04 分別與 5X上樣緩沖液混合，煮沸ΙΟη ι;同時設MDBK細胞作為陰性對照，進行SDS-PAGE ； 將電泳條帶進行蛋白質印跡反應，用Bio-Rad轉印系統，以350mA濕法轉印90η ι，將 蛋白條帶轉印至硝酸纖維素(NC)膜上；進行抗原抗體反應，一抗為1:1000稀釋的小鼠 腹水，二抗為1:2000稀釋的羊抗鼠^G-HRP, 二氨基聯苯二胺(DAB)系統顯色。
1.6 McAb的生物素標記及效價的測定根據 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin Reagents 說明書進行單克隆抗體的 Biotin 標 記，具體步驟如下以所用biotin與純化腹水IgG的摩爾比值為20 : 1，計算所需biotin 用量。2.0mg biotin溶于300ul超純水中，計算所需biotin的體積；將所需biotin溶液體 積加入純化腹水溶液中，37°C作用0.5h ； 40C PBS過夜透析除去未反應的biotin，間接 ELISA檢測標記效果。
2實驗結果 2.1電鏡觀察結果890病毒感染細胞培養(yǎng)物經PEG濃縮、蔗糖墊底超速離心提純后磷酸鎢負染電鏡觀 察，可見有囊膜、直徑約為60nm的圓形病毒粒子。
2.2檢測抗原的制備經浸提純化的BE2蛋白，進一步SDS-PAGE可見43KDa處出現清晰的單一條帶， 符合預期大小，可用于單克隆抗體的檢測。純化的蛋白用核酸蛋白檢測儀測得濃度為 1.5mg/ml。
2.3 McAb的制備及相關特性SP2/0細胞與免疫BALB/c小鼠脾細胞融合后待細胞長至肉眼可見細胞集落、上清 變?yōu)槌赛S色時可取上清原液進行抗體檢測。挑選經間接ELISA檢測兩次結果為陽性， OD490值>1.0且一直比較穩(wěn)定的雜交瘤細胞進行亞克隆，三次亞克隆后獲得穩(wěn)定分泌抗 體的雜交瘤細胞一株，命名為3F9 (由發(fā)明人所在的揚州大學畜禽病原微生物學研究室保 存，自申請日起向公眾提供20年)，抗體分子類為IgG。
間接ELISA測得單抗3F9腹水的ELISA滴度為1 29X 100。以飽和(NH4)2S04 鹽析法純化腹水，核酸蛋白檢測儀測得^G濃度為2mg/ml。
將所獲得的雜交瘤細胞株3F9連續(xù)傳代，細胞生長良好，反復凍存與復蘇后， 仍能穩(wěn)定地分泌單克隆抗體。
病毒株890、NADL, XJ-04分別與雜交瘤細胞株3F9所分泌的單克隆抗體進行 Western-blotting,結果顯示在約53KDa處形成一條特異性的目的條帶，說明病毒株890、 NADL, XJ-04能與該單抗發(fā)生特異性反應。
2.4 IgG 的 biotin 標記在單克隆體抗體3F9腹水純化物(2mg/ml) Iml中加入水溶性的biotin溶 液(2.0mg biotin溶于300ul超純水)，反應產物透析后用間接ELISA測得標記效價可達 216。
實施例3 雙抗夾心生物素-親和素ELISA方法的建立 1實驗方法1.1雙抗夾心ELISA方法的建立具體操作步驟如下包被液稀釋純化的腹水3D8至l-20ug/ml，以IOOul/孔加入 酶標板孔中，37°C作用Zh后置4°C過夜，棄去孔內的液體，PBST洗滌3次，每次5η ι， 拍干；每孔加150ul封閉液37°C封閉2h，PBST同前洗滌，此時包被板可_20°C保存?zhèn)?用；每孔加IOOul待檢樣品(E2蛋白)，同時設立陰性對照和空白對照，37°C孵育lh， 洗滌拍干；加 biotin_3F9，1 OOul/孔，37°C孵育 lh，洗滌拍干；加 Streptavidin-HRP， IOOul/孔，37°C作用10-20η ι，以2mol/L H2SO4終止反應，50ul/孔，在酶聯免疫閱讀 儀上讀取OD49tl值。
方陣滴定法確定最佳mAb包被量、biotin-mAb的工作濃度，此方法可檢測的最 低待檢樣品量。
1.2雙抗體夾心ELISA方法特異性的檢測將收獲的 890、XJ-04 (分離株 BVDV-2)、NADL (BVDV-I)、BHV-U BRV 病 毒反復凍融三次后，經3000rpm離心IOmin后收集上清用于雙抗體夾心ELISA檢測。同 時設陽性、陰性、空白對照。
1.3雙抗體夾心ELISA方法臨界值的確定建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測10份假定無BVDV感染的牛血清，計算其平均 值(mean)與標準差(SD)，以檢測血清的OD49(femean+;3SD定為陰、陽性血清臨界 值，當待測樣本的OD4902該臨界值時，可判其為陽性。
2實驗結果2.1雙抗夾心ELISA方法的建立方陣法和多次實驗結果顯示雙抗體夾心ELISA方法中3D8的最佳包被濃度為2ug/ ml, biotin_3F9最佳工作濃度為60ng/ml，E2最低檢出量為84ng/ml。
雙抗體夾心ELISA方法的特異性建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法能檢測出890、XJ-04 (BVDV-2)、NADL (BVDV-I)，而對豬瘟病毒(CSFV)、1型牛皰疹病毒(BHV-I)、牛輪狀病毒 (BRV)均顯陰性；該結果表明所建立的檢測方法具有良好的特異性。
雙抗體夾心ELISA方法臨界值的確定用建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測10份假定無BVDV感染的牛血清，其OD490 值中最小值為0.112，最大值為0.346，標準差為0.049，經計算得出OD490平均值+!3SD 為0.322，即當檢測血清的OD490>0.322時判為陽性。
舉例如下ELISA檢測試劑盒包括包被BVDV單抗3D8的酶標板、biotin標記的BVDV單抗 3F9，Streptavidin-HRP,洗滌液，顯色液、終止液，陽性對照，陰性對照。
上述試劑盒的使用35份來自江蘇、山東、河南奶牛場疑似BVDV感染病牛血，進行分離血清，同時用 RT-PCR和本發(fā)明的雙抗夾心ELISA方法進行檢測。
經RT-PCR檢測(BVDV 5，-UTR保守片段的PCR擴增)，結果檢出11份為陽 性；用本發(fā)明的雙抗夾心ELISA檢測，檢出13份陽性樣品，其檢測結果與RT-PCR的符 合率達94. %，預示著這兩種方法有著很大的應用價值，可作為BVDV的特異性診斷， 但簡單和快捷的特性使ELISA成為基層應用和大批樣品檢測的優(yōu)選方法。
本發(fā)明的保護范圍并不僅僅局限于本實施例的描述。
權利要求
1.一種牛病毒性腹瀉病毒雙抗夾心生物素-親和素ELISA檢測試劑盒包括用于ELISA 檢測的洗滌液、顯色液、終止液，Streptavidin-HRP、陽性對照，陰性對照，其特征在 于還有包被牛病毒性腹瀉病毒單抗3D8的酶標板、生物素標記的牛病毒性腹瀉病毒單抗 3F9。
2.權利要求1所述的ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟(1)包被用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋純化的單克隆抗體3D8至l-20ug/ml，按 IOOul/孔加于聚苯乙烯微孔板中，37°C放置2h，然后轉移至4°C，放置過夜；洗滌，甩 干；(2)封閉含10%小牛血清的pH7.4磷酸鹽緩沖液，150ul/孔，37°C孵育2h, 洗滌，拍干；(3)加待檢樣品IOOul/孔，37°C孵育Ih;洗滌，拍干；(4)加生物素標記的二抗每孔加IOOulbiotin_3F9，37°C孵育lh,洗滌，拍干；(5)加親和素按IOOul/孔，加&"eptavidin-HRP，37°C孵育 10_20min ；洗滌，拍干；(6)終止每孔加50ul2mol/LH2SO4,終止反應；(7)在酶聯免疫閱讀儀上讀取OD49tl值與陽性對照和陽性對照比對。
全文摘要
本發(fā)明涉及牛病毒性腹瀉病毒抗原的雙抗夾心生物素-親和素ELISA檢測試劑盒及使用該試劑盒的檢測方法。該試劑盒包括用于ELISA檢測的洗滌液、顯色液、終止液，Streptavidin-HRP、陽性對照，陰性對照，其特征在于還有包被牛病毒性腹瀉病毒單抗3D8的酶標板、生物素標記的牛病毒性腹瀉病毒單抗3F9。用該試劑盒進行檢測無交叉反應；可避免因體內抗體滴度低而出現漏檢現象；特異性高，使用生物素-親和素增敏劑，起放大作用，靈敏度增高，提高檢出率，同時減少了二抗的用量，適于推廣使用。
文檔編號G01N33/577GK102023217SQ20101056845
公開日2011年4月20日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權日2010年12月1日
發(fā)明者吳圣龍, 姚豐華, 孟祥升, 朱軍, 朱國強, 朱曉芳, 朱禮倩, 林燕清, 王建業(yè), 舒燕, 蔣穎, 陶潔 申請人:揚州大學