專利名稱：采用標(biāo)記鏈霉親和素——生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種采用熒光或酶標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)(Fluorescence/Enzyme labeled Streptavidin Biotin Method，F(xiàn)LSAB/ELSAB)的蛋白質(zhì)芯片。
背景技術(shù)：
標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)，可應(yīng)用于免疫測定。
運用常規(guī)免疫標(biāo)記技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片，熒光或酶直接標(biāo)記在可與待測物質(zhì)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)上，反應(yīng)結(jié)果未經(jīng)過進一步放大，檢測靈敏度有局限，對設(shè)備、試劑和人員操作等要求較高。反應(yīng)過程中由于一些非特異性的結(jié)合，背景會有一些干擾信號，在點樣濃度較高或條件控制稍差的情況下，還可能出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。另外，由于熒光標(biāo)記物難于標(biāo)記在酸性蛋白質(zhì)上，其運用范圍受到一定的限制，例如某些抗原是酸性蛋白質(zhì)，熒光標(biāo)記物標(biāo)記抗原的效率極低，無法直接用熒光標(biāo)記抗原來檢測抗體。而酶標(biāo)由于分子的位阻效應(yīng)而會影響抗原抗體的結(jié)合效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采用標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片，它改進了制作方法，使得檢測結(jié)果清晰、穩(wěn)定，可靠性強。
本發(fā)明的又一目的是提供采用標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用方法，利用不同的標(biāo)記方法在不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)上作標(biāo)記，擴大蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用范圍。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種采用標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片，蛋白質(zhì)的點樣和制作技術(shù)采取下列步驟(1)使用高速點樣機器人將蛋白質(zhì)樣品抗原或者抗體點印于經(jīng)戊二醛處理過的載玻片上或硝酸纖維素膜或尼龍膜上；(2)于室溫過夜或者于37℃溫育1小時固定于固相載體；(3)在載玻片表面加上以牛血清白蛋白(BSA)和吐溫為主的封閉液，于37℃溫育1小時；(4)用雙蒸水充分洗滌并室溫干燥；雜交反應(yīng)采取下列步驟(1)在點好樣的芯片上滴加待測樣品，于37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應(yīng)；(2)用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，于室溫晾干；(3)加封阻液封阻并再次洗凈晾干；(4)滴加以封阻液稀釋過的生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，于37℃溫育30分鐘；(5)洗凈并于室溫晾干；(6)滴加以封阻液稀釋過的熒光或酶標(biāo)記鏈霉親和素，于37℃避光溫育30分鐘；(7)洗凈并于室溫晾干；(8)若(6)中采用酶標(biāo)記鏈霉親和素，則滴加底物，避光溫育30分鐘，以終止液終止反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，利用芯片掃描分析儀對結(jié)果進行判讀，檢測結(jié)果。
所述蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用于測定抗原，將與待測抗原相對應(yīng)的各種單克隆抗體或者多克隆抗體點陣、固定于固相載體上，這些過量的固相抗體和病人血清的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其它物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的另一抗體-熒光或酶標(biāo)記的鏈霉親和素，再次洗滌固相后，測定熒光強度，或者加入酶相對的底物，并測顏色變化后的灰度值，其值與被測的抗原濃度成正比。
所述蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用于測定抗體，將與待測抗體相對應(yīng)的抗原點陣、固定于固相載體上，這些過量的固相抗原和病人血清的抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的其它物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的另一抗原或者二抗-熒光或酶標(biāo)記的鏈霉親和素，再次洗滌固相后，測定熒光強度，或者加入酶相對的底物，并測顏色變化后的灰度值，其值與被測的抗體濃度成正比。
所述蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用于檢測與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)，將與待測物質(zhì)相對應(yīng)的蛋白質(zhì)點陣、固定于固相載體上，這些過量的蛋白質(zhì)和待測物質(zhì)結(jié)合，洗去未結(jié)合的其它物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的與待測物質(zhì)結(jié)合的另一蛋白質(zhì)-熒光或酶標(biāo)記的鏈霉親和素，再次洗滌固相后，測定熒光強度，或者加入酶相對的底物，并測顏色變化后的灰度值，其值與被測的物質(zhì)濃度成正比，這一檢測方法用于配體、受體的檢測、篩選，也用于信號傳導(dǎo)的研究和藥物的篩選。
本發(fā)明的采用熒光或酶標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片，與采用常規(guī)免疫熒光技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片相比較，反應(yīng)試劑是用生物素(Biotin)標(biāo)記的可特異性結(jié)合待測物質(zhì)(如抗原)的蛋白質(zhì)(如抗體)，用熒光(Fluorescence)或酶(Enzyme)標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin)，利用鏈霉親和素與生物素的特異性高度親和性進行生物反應(yīng)放大。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片具有如下優(yōu)點1、靈敏度和可檢測范圍比采用傳統(tǒng)標(biāo)記方法的蛋白質(zhì)芯片提高10倍以上，其檢測信號強。
2、具有高度特異性，背景信號低，其非特異性著色淡，檢測結(jié)果清晰、穩(wěn)定，可靠性強。
3、操作時樣品可高度稀釋，進一步減少背景著色的可能性，背景噪音低，特異性進一步提高。
4、秉承了蛋白質(zhì)芯片微列陣技術(shù)的高效性，操作簡便。
5、利用不同的標(biāo)記方法可以在不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)上作標(biāo)記，由此可測蛋白質(zhì)的種類增多，擴大蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用范圍。
6、減少酶的位阻效應(yīng)，提高反應(yīng)效率。
本發(fā)明利用不同的生物素標(biāo)記方法，可以標(biāo)記不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)，擴大蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用范圍。例如，將生物素活化為生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(biotinyl-N-hydroxy-succinimide ester，BNHS)適用于標(biāo)記中性或偏堿性的蛋白質(zhì)；將生物素活化為生物素酰肼(biotin hydrazide，BHZ)主要用于標(biāo)記偏酸性的糖蛋白。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細說明。
圖1是采用熒光標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片測定抗體(Ag-Ab-二抗結(jié)合)的原理圖。
圖2是采用熒光標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片測定抗原(雙抗體夾心法)的原理圖。
圖3是采用熒光標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片測定抗體(雙抗原夾心法)的原理圖。
圖4是采用酶標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片測定抗體(Ag-Ab-二抗結(jié)合)的原理圖。
圖5是采用酶標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片測定抗原(雙抗體夾心法)的原理圖。
圖6是采用酶標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片測定抗體(雙抗原夾心法)的原理圖。
圖7是采用熒光標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片檢測病人血清的熒光掃描結(jié)果示意圖。
圖8是使用單一的熒光標(biāo)記技術(shù)檢測原濃度血清的熒光掃描結(jié)果示意圖。
圖9是采用熒光標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片檢測病人血清，將病人血清稀釋10倍后的實驗結(jié)果示意圖。
圖10是使用單一的熒光標(biāo)記技術(shù)檢測原濃度血清，將病人血清稀釋10倍后的實驗結(jié)果示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明是一種采用標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片，該蛋白質(zhì)芯片的固相載體可以是載玻片或者硝酸纖維素膜(NC膜)或尼龍膜。
蛋白質(zhì)的點樣和制作技術(shù)采取下列步驟(1)使用高速點樣機器人將蛋白質(zhì)樣品抗原或者抗體點印于經(jīng)戊二醛處理過的載玻片上或硝酸纖維素膜或尼龍膜上。
(2)于室溫過夜或者于37℃溫育1小時固定于固相載體。
(3)在載玻片表面加上以牛血清白蛋白(BSA)和吐溫為主的封閉液，于37℃溫育1小時。
(4)用雙蒸水充分洗滌并室溫干燥。
雜交反應(yīng)采取下列步驟(1)在點好樣的芯片上滴加待測樣品，于37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應(yīng)。
(2)用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，于室溫晾干。
(3)加封阻液封阻并再次洗凈晾干。
(4)滴加以封阻液稀釋過的生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，于37℃溫育30分鐘。
(5)洗凈并于室溫晾干。
(6)滴加以封阻液稀釋過的熒光或酶標(biāo)記鏈霉親和素，于37℃避光溫育30分鐘。
(7)洗凈并于室溫晾干。
(8)若(6)中采用酶標(biāo)記鏈霉親和素，則滴加底物，避光溫育30分鐘，以終止液終止反應(yīng)。
反應(yīng)結(jié)束后，利用專業(yè)的芯片掃描分析儀對結(jié)果進行判讀，檢測結(jié)果。
本發(fā)明的應(yīng)用方法如下參看圖1、圖3、圖4和圖6，將蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用于測定抗體，將與待測抗體相對應(yīng)的抗原點陣、固定于固相載體上，這些過量的固相抗原和病人血清的抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的其它物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的另一抗原或者二抗-熒光或酶標(biāo)記的鏈霉親和素，再次洗滌固相后，測定熒光強度，或者加入酶相對的底物，并測顏色變化后的灰度值，其值與被測的抗體濃度成正比。
參看圖2和圖4，將蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用于測定抗原，將與待測抗原相對應(yīng)的各種單克隆抗體或者多克隆抗體點陣、固定于固相載體上，這些過量的固相抗體和病人血清的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其它物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的另一抗體-熒光或酶標(biāo)記的鏈霉親和素，再次洗滌固相后，測定熒光強度，或者加入酶相對的底物，并測顏色變化后的灰度值，其值與被測的抗原濃度成正比。
將蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用于檢測與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)，將與待測物質(zhì)相對應(yīng)的蛋白質(zhì)點陣、固定于固相載體上，這些過量的蛋白質(zhì)和待測物質(zhì)結(jié)合，洗去未結(jié)合的其它物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的與待測物質(zhì)結(jié)合的另一蛋白質(zhì)-熒光或酶標(biāo)記的鏈霉親和素，再次洗滌固相后，測定熒光強度，或者加入酶相對的底物，并測顏色變化后的灰度值，其值與被測的物質(zhì)濃度成正比，這一檢測方法用于配體、受體的檢測、篩選，也用于信號傳導(dǎo)的研究和藥物的篩選。
本發(fā)明以丙肝常用臨床檢驗指標(biāo)丙肝病毒(HCV)的檢測為其中一個實施例參看圖7至圖10，用蛋白質(zhì)芯片檢測某病人血清所得到的熒光掃描結(jié)果，圖中第一行和第二行的10個點為檢測結(jié)果，最后兩行為陽性對照，中間兩行無信號為陰性對照。
圖7和圖8為檢測原濃度血清，其中圖7利用了熒光標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)，而圖8則使用單一的熒光標(biāo)記技術(shù)。從圖中可以看出，采用熒光標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的反應(yīng)結(jié)果陽性反應(yīng)信號強，圖像清晰，背景信號低；而使用單一的熒光標(biāo)記技術(shù)的反應(yīng)結(jié)果，相對背景信號較高，圖像相對模糊。
圖9和圖10是將病人血清稀釋10倍后的實驗結(jié)果。圖9利用了熒光標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)，而圖10則使用單一的熒光標(biāo)記技術(shù)，可見前者結(jié)果仍然很清晰，而后者結(jié)果信號已經(jīng)很弱，圖像模糊難辯，由此可能會產(chǎn)生假陰性的結(jié)論。
權(quán)利要求
1.一種采用標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片，蛋白質(zhì)的點樣和制作技術(shù)采取下列步驟(1)使用高速點樣機器人將蛋白質(zhì)樣品抗原或者抗體點印于經(jīng)戊二醛處理過的載玻片上或硝酸纖維素膜或尼龍膜上；(2)于室溫過夜或者于37℃溫育1小時固定于固相載體；(3)在載玻片表面加上以牛血清白蛋白(BSA)和吐溫為主的封閉液，于37℃溫育1小時；(4)用雙蒸水充分洗滌并室溫干燥；雜交反應(yīng)采取下列步驟(1)在點好樣的芯片上滴加待測樣品，于37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應(yīng)；(2)用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，于室溫晾干；(3)加封阻液封阻并再次洗凈晾干；其特征在于，雜交反應(yīng)接著采取下列步驟(4)滴加以封阻液稀釋過的生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，于37℃溫育30分鐘；(5)洗凈并于室溫晾干；(6)滴加以封阻液稀釋過的熒光或酶標(biāo)記鏈霉親和素，于37℃避光溫育30分鐘；(7)洗凈并于室溫晾干；(8)若(6)中采用酶標(biāo)記鏈霉親和素，則滴加底物，避光溫育30分鐘，以終止液終止反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，利用芯片掃描分析儀對結(jié)果進行判讀，檢測結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用于測定抗原，將與待測抗原相對應(yīng)的各種單克隆抗體或者多克隆抗體點陣、固定于固相載體上，這些過量的固相抗體和病人血清的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其它物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的另一抗體-熒光或酶標(biāo)記的鏈霉親和素，再次洗滌固相后，測定熒光強度，或者加入酶相對的底物，并測顏色變化后的灰度值，其值與被測的抗原濃度成正比。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用于測定抗體，將與待測抗體相對應(yīng)的抗原點陣、固定于固相載體上，這些過量的固相抗原和病人血清的抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的其它物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的另一抗原或者二抗-熒光或酶標(biāo)記的鏈霉親和素，再次洗滌固相后，測定熒光強度，或者加入酶相對的底物，并測顏色變化后的灰度值，其值與被測的抗體濃度成正比。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用標(biāo)記鏈霉親和素-生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用于檢測與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)，將與待測物質(zhì)相對應(yīng)的蛋白質(zhì)點陣、固定于固相載體上，這些過量的蛋白質(zhì)和待測物質(zhì)結(jié)合，洗去未結(jié)合的其它物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的與待測物質(zhì)結(jié)合的另一蛋白質(zhì)-熒光或酶標(biāo)記的鏈霉親和素，再次洗滌固相后，測定熒光強度，或者加入酶相對的底物，并測顏色變化后的灰度值，其值與被測的物質(zhì)濃度成正比，這一檢測方法用于配體、受體的檢測、篩選，也用于信號傳導(dǎo)的研究和藥物的篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用標(biāo)記鏈霉親和素——生物素技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片,將蛋白質(zhì)點樣并制作,雜交反應(yīng)采取下列步驟:在點好樣的芯片上滴加待測樣品,用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品,加封阻液封阻并再次洗凈晾干,滴加以封阻液稀釋過的生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì),洗凈并于室溫晾干,滴加以封阻液稀釋過的熒光或酶標(biāo)記鏈霉親和素,洗凈并于室溫晾干。本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用于測定抗原、抗體,用于檢測與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)。本發(fā)明改進了制作方法,使得檢測結(jié)果清晰、穩(wěn)定,可靠性強。本發(fā)明利用不同的標(biāo)記方法在不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)上作標(biāo)記,由此可測蛋白質(zhì)的種類增多,擴大蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用范圍。
文檔編號G01N33/543GK1335505SQ0111332
公開日2002年2月13日 申請日期2001年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月11日
發(fā)明者張濤, 李賓, 彭永濟, 葛海鵬, 任一萍 申請人:上海晶泰生物技術(shù)有限公司