專利名稱：免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒。
免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，其發(fā)展十分迅速，在生物醫(yī)學(xué)各研究領(lǐng)域，特別是在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了日益廣泛的應(yīng)用。膠體金已成為繼熒光素、放射同位素和酶之后，在免疫標(biāo)記技術(shù)中較為常用的一種非放射性標(biāo)劑。
膠體金是由氯金酸在還原劑如鞣酸、檸檬酸三鈉的作用下聚合形成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，它具有高電子密度、能與多種生物大分子結(jié)合的特點(diǎn)。免疫金標(biāo)記技術(shù)主要利用了金顆粒的這一特征，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處于顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或紫紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中。
由于膠體金檢測(cè)試劑盒與放免、酶標(biāo)試劑盒相比，具有操作使用安全(無(wú)放免物的污染)、簡(jiǎn)便(簡(jiǎn)單操作一步完成)、適于單人份檢測(cè)(放免和酶標(biāo)試劑盒不適于單人份或少量樣品檢測(cè))和快速(10分鐘左右即可有結(jié)果)等優(yōu)點(diǎn)，因此近幾年來(lái)金標(biāo)診斷試劑盒正日益流行，在某些項(xiàng)目上已逐漸替代了放免、酶標(biāo)試劑盒，如早早孕試劑條(HCG Test Strip)等。
免疫磁性粒子技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，多用于分離濃縮等試驗(yàn)中。磁性粒子能與蛋白質(zhì)以共價(jià)方式結(jié)合而不影響其活性，所以常用來(lái)捕獲特定蛋白或分離蛋白。其原理如下將某抗體標(biāo)記磁性粒子，放入含目的抗原的溶液中，經(jīng)充分混合反應(yīng)后，形成抗原抗體磁性粒子混合物，使溶液通過(guò)一磁性柱，由于磁性粒子被吸附而使目的抗原截留下來(lái)。同時(shí)它又能用作定量檢測(cè)，可根據(jù)磁性強(qiáng)弱確定捕獲抗體或抗原量的多少。
目前，免疫膠體金技術(shù)在金標(biāo)檢測(cè)試劑上運(yùn)用具有下列缺點(diǎn)1.單純以顯色深淺來(lái)判斷結(jié)果的膠體金檢測(cè)條，只能作半定量而不能作定量檢測(cè)。
2.現(xiàn)有的金標(biāo)快速診斷試劑盒一般對(duì)檢測(cè)樣本只能進(jìn)行定性檢測(cè)，而無(wú)法進(jìn)行定量檢測(cè)，故此種試劑盒只適用于普查篩選。
3.由于方法學(xué)的限制，只使用免疫膠體金技術(shù)建立的快速診斷試劑盒，其靈敏度較低。
4.對(duì)于某些抗原或抗體含量極低的樣本，如使用此種技術(shù)建立的快速檢測(cè)試劑盒，由于靈敏度限制，會(huì)造成假陰性，因而檢出率較低。
本發(fā)明的目的是提供一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒，將免疫膠體金技術(shù)和免疫磁性粒子技術(shù)同時(shí)運(yùn)用到快速檢測(cè)試劑盒中，既能進(jìn)行定性檢測(cè)同時(shí)又能做定量測(cè)定，省時(shí)省力，節(jié)約了成本。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒，本雙標(biāo)記技術(shù)將目的蛋白的抗體或抗原標(biāo)記一磁性粒子，形成一磁珠，再以此磁珠去標(biāo)記膠體金，使該抗體或抗原上同時(shí)帶有兩個(gè)標(biāo)示物；然后以此雙標(biāo)記了的抗體或抗原去結(jié)合目的抗原或抗體，最終被固定在膜上的相應(yīng)抗體或抗原捕獲，形成一檢測(cè)帶；然后在肉眼對(duì)檢測(cè)帶進(jìn)行初步定性或半定量檢測(cè)的基礎(chǔ)上，以磁性測(cè)定儀對(duì)該檢測(cè)帶進(jìn)行定量檢測(cè)。
所形成的檢測(cè)帶是一可見(jiàn)或不可見(jiàn)的T帶，可見(jiàn)T帶為樣本中有目的蛋白并且濃度很高使檢測(cè)帶上積聚的膠體金能為肉眼所見(jiàn)，不可見(jiàn)T帶為樣本中無(wú)目的蛋白或者濃度很低使檢測(cè)帶上積聚的膠體金不能被肉眼看見(jiàn)。
所述磁珠的制備是選用顆粒直徑為50nm的磁性粒子，將其標(biāo)記到目的抗體或抗原相應(yīng)的抗原或抗體上，成為一磁珠。
所述膠體金的制備是取四氯化金以檸檬酸三鈉還原它成為膠體金。
所述磁珠的膠體金標(biāo)記和固相化是將膠體金標(biāo)記到磁珠上，再以百德(Bio-Dot)儀的氣壓噴頭噴到玻璃纖維素膜上，成為一膠體金墊，于37℃干燥待用。
分別將檢測(cè)目的物相應(yīng)的另一個(gè)抗體或抗原以百德(Bio-Dot)儀的噴頭噴到硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)帶即T帶，同時(shí)將二抗也噴到硝酸纖維素膜上，形成對(duì)照線，以中性蛋白封閉，干燥。
本發(fā)明使用磁性粒子和免疫膠體金雙標(biāo)記技術(shù)建立診斷試劑盒，既能進(jìn)行定性檢測(cè)同時(shí)又能做定量測(cè)定。運(yùn)用本發(fā)明技術(shù)建立的試劑盒與同類定量試劑盒相比，操作簡(jiǎn)單方便，省時(shí)省力，節(jié)約了成本。在檢測(cè)靈敏度要求較低的樣本時(shí)，可先根據(jù)試條有無(wú)顯色篩去陰性結(jié)果，再對(duì)結(jié)果為陽(yáng)性的試條作進(jìn)一步定量測(cè)定，免去了對(duì)所有標(biāo)本都作定量測(cè)定的煩瑣。
由于磁力檢測(cè)儀對(duì)磁性粒子的檢測(cè)很靈敏，所以運(yùn)用本發(fā)明技術(shù)建立的試劑盒具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，尤其能檢測(cè)出濃度較低的目的蛋白。
使用本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)的檢測(cè)板或檢測(cè)條在檢測(cè)時(shí)，可先根據(jù)T帶的顯色與否，以肉眼判斷結(jié)果的陰陽(yáng)性。接下來(lái)，根據(jù)需要以磁性測(cè)定儀對(duì)檢測(cè)板或檢測(cè)條作定量分析。在檢測(cè)需高靈敏度的項(xiàng)目時(shí)，可對(duì)顯色反應(yīng)為陰性的試條作進(jìn)一步分析，以避免可能的漏檢。
使用本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)的檢測(cè)板或檢測(cè)條，具有高靈敏度和高檢測(cè)率的特點(diǎn)。該檢測(cè)板或檢測(cè)條能用于一項(xiàng)多檢的快速檢測(cè)試劑盒；能檢測(cè)全血、血清、血漿、唾液、尿液等樣本；能用于疾病診斷、毒品檢出、細(xì)菌檢出等目的蛋白的檢測(cè)或分離。
使用本發(fā)明技術(shù)制作的檢測(cè)板或檢測(cè)條可以使用雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、間接法。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。


圖1是本發(fā)明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記示意圖。
圖2是本發(fā)明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒在運(yùn)用產(chǎn)品為陽(yáng)性情況a時(shí)的外觀圖。
圖3是本發(fā)明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒在運(yùn)用產(chǎn)品為陽(yáng)性情況b時(shí)的外觀圖。
圖4是本發(fā)明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒在運(yùn)用產(chǎn)品為陰性情況時(shí)的外觀圖。
圖5是本發(fā)明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒在運(yùn)用于一檢多項(xiàng)的產(chǎn)品外觀圖。
圖6是本發(fā)明的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒運(yùn)用檢測(cè)原理圖。
參看圖1至圖6，本發(fā)明的一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒采用本雙標(biāo)記技術(shù)，將目的蛋白的抗體或抗原標(biāo)記一磁性粒子，形成一磁珠，再以此磁珠去標(biāo)記膠體金，使該抗體或抗原上同時(shí)帶有兩個(gè)標(biāo)示物。然后以此雙標(biāo)記了的抗體或抗原去結(jié)合目的抗原或抗體，最終被固定在膜上的相應(yīng)抗體或抗原捕獲，形成一檢測(cè)帶。然后以磁性測(cè)定儀對(duì)該檢測(cè)帶進(jìn)行定量檢測(cè)。
所形成的檢測(cè)帶是一可見(jiàn)或不可見(jiàn)的T帶，可見(jiàn)T帶為樣本中有目的蛋白并且濃度很高使檢測(cè)帶上積聚的膠體金能為肉眼所見(jiàn)，不可見(jiàn)T帶為樣本中無(wú)目的蛋白或者濃度很低使檢測(cè)帶上積聚的膠體金不能被肉眼看見(jiàn)。
圖1中標(biāo)記1是磁性粒子，2是膠體金，3是抗體，4是抗原。
圖2為當(dāng)陽(yáng)性情況a時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果為樣品中抗體或抗原濃度可使膠體金在T帶的積累可被肉眼看到。圖中標(biāo)記5是加樣孔，6是檢測(cè)窗口，61是檢測(cè)帶即T帶，62是對(duì)照帶即C帶。
圖3為當(dāng)陽(yáng)性情況b時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果為但被捕獲的抗體或抗原濃度較少使膠體金在T帶的積累較少，未被肉眼看到，而被捕獲在此的磁性粒子形成一條不可見(jiàn)的T帶，能被磁性檢測(cè)儀所測(cè)出。
圖4為當(dāng)陰性情況時(shí)，陰性結(jié)果為樣品中無(wú)目的抗體或抗原，T帶處無(wú)條帶出現(xiàn)。
圖5是用于血清糖原磷酸化酶同工酶(GPBB)和肌紅蛋白(Mb)聯(lián)檢項(xiàng)目，在檢測(cè)窗口6內(nèi)顯示有GPBB檢測(cè)帶63、Mb檢測(cè)帶64和對(duì)照帶62。
圖6也是用于血清糖元磷酸化酶同工酶(GPBB)和肌紅蛋白(Mb)聯(lián)檢項(xiàng)目，圖中○表示膠體金，◎表示生物素，C為對(duì)照帶，T1為檢測(cè)帶，T2為檢測(cè)帶，標(biāo)號(hào)21為聯(lián)結(jié)了膠體金的GPBB單抗a磁珠，22為聯(lián)結(jié)了膠體金的Mb單抗α磁珠，23為包被在膜上GPBB單抗b，24為包被在膜上的Mb單抗β，25為包被在膜上的羊抗鼠二抗。
本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的制作方法包括以下步驟1、磁珠的制備。
2、膠體金的制備。
3、磁珠的金標(biāo)及固相化。
4、抗體或抗原或二抗包被到硝酸纖維素膜上及其封閉。
5、試劑盒的組裝。
磁珠的制備是選用顆粒直徑為50nm的磁性粒子，將其標(biāo)記到目的抗體或抗原相應(yīng)的抗原或抗體上，成為一磁珠。
膠體金的制備是取四氯化金以檸檬酸三鈉還原它成為膠體金。
磁珠的膠體金標(biāo)記和固相化是將膠體金標(biāo)記到磁珠上，再以百德(Bio-Dot)儀的氣壓噴頭噴到玻璃纖維素膜上，成為一膠體金墊，于37℃干燥待用。
抗體或抗原或二抗包被到硝酸纖維素膜上及其封閉，是分別將檢測(cè)目的物相應(yīng)的另一個(gè)抗體或抗原以百德(Bio-Dot)儀的噴頭，噴到硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)帶即T帶，同時(shí)將抗鼠二抗也噴到硝酸纖維素膜上，形成對(duì)照線，以中性蛋白封閉，干燥。
試劑盒的組裝是將各成份(底板、上端吸水紙、噴有抗原或抗體的膜、膠體金墊、下端吸水紙)組裝、裁剪、包裝。
使用本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)的檢測(cè)板或檢測(cè)條在如下檢測(cè)時(shí)具有使用效果A、對(duì)于自身靈敏度要求不高的檢測(cè)項(xiàng)目、金標(biāo)方法學(xué)可達(dá)到其靈敏度的項(xiàng)目，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等的檢測(cè)，可先根據(jù)T帶的顯色與否，以肉眼判斷結(jié)果的陰陽(yáng)性，篩去不顯色(陰性)的結(jié)果，再根據(jù)需要以磁性測(cè)定儀對(duì)顯色結(jié)果(陽(yáng)性)的檢測(cè)板或檢測(cè)條作進(jìn)一步的定量分析。
B、對(duì)于靈敏度要求高的檢測(cè)項(xiàng)目、金標(biāo)方法學(xué)可能無(wú)法達(dá)到其靈敏度的項(xiàng)目，例如在采血流動(dòng)車(chē)上的運(yùn)用，對(duì)所獻(xiàn)的血必須進(jìn)行乙肝HBV、丙肝HCV、艾滋病HIV、梅毒TP的檢測(cè)，只有結(jié)果均為陰性的血才能被接受。所以，先篩去T帶有顯色的陽(yáng)性血清，由于HIV、HCV初期患者其血內(nèi)的抗體水平極低，極可能被漏檢，因此要對(duì)不顯色的陰性結(jié)果作進(jìn)一步磁性檢測(cè)，借用磁性的高靈敏度避免可能的漏檢，增加血液使用的安全性。
C、如果樣品中無(wú)目的抗原或抗體，則T帶處無(wú)條帶出現(xiàn)，即為無(wú)可見(jiàn)色帶，也無(wú)磁性條帶。
權(quán)利要求
1.一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒，其特征在于，本雙標(biāo)記技術(shù)將目的蛋白的抗體或抗原標(biāo)記一磁性粒子，形成一磁珠，再以此磁珠去標(biāo)記膠體金，使該抗體或抗原上同時(shí)帶有兩個(gè)標(biāo)示物；然后以此雙標(biāo)記了的抗體或抗原去結(jié)合目的抗原或抗體，最終被固定在膜上的相應(yīng)抗體或抗原捕獲，形成一檢測(cè)帶；然后在肉眼對(duì)檢測(cè)帶進(jìn)行初步定性或半定量檢測(cè)的基礎(chǔ)上，以磁性測(cè)定儀對(duì)該檢測(cè)帶進(jìn)行定量檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒，其特征在于，所形成的檢測(cè)帶是一可見(jiàn)或不可見(jiàn)的T帶，可見(jiàn)T帶為樣本中有目的蛋白并且濃度很高使檢測(cè)帶上積聚的膠體金能為肉眼所見(jiàn)，不可見(jiàn)T帶為樣本中無(wú)目的蛋白或者濃度很低使檢測(cè)帶上積聚的膠體金不能被肉眼看見(jiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒，其特征在于，所述磁珠的制備是選用顆粒直徑為50nm的磁性粒子，將其標(biāo)記到目的抗體或抗原相應(yīng)的抗原或抗體上，成為一磁珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒，其特征在于，所述膠體金的制備是取四氯化金以檸檬酸三鈉還原它成為膠體金。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒，其特征在于，所述磁珠的膠體金標(biāo)記和固相化是將膠體金標(biāo)記到磁珠上，再以百德(Bio-Dot)儀的氣壓噴頭噴到玻璃纖維素膜上，成為一膠體金墊，于37℃干燥待用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒，其特征在于，分別將檢測(cè)目的物相應(yīng)的另一個(gè)抗體或抗原以百德德(Bio-Dot)儀的噴頭噴到硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)帶即T帶，同時(shí)將二抗也噴到硝酸纖維素膜上，形成對(duì)照線，以中性蛋白封閉，干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標(biāo)記快速診斷試劑盒,本雙標(biāo)記技術(shù)將目的蛋白的抗體或抗原標(biāo)記一磁性粒子,形成一磁珠,再以此磁珠去標(biāo)記膠體金,使該抗體或抗原上同時(shí)帶有兩個(gè)標(biāo)示物。然后以此雙標(biāo)記了的抗體或抗原去結(jié)合目的抗原或抗體,最終被固定在膜上的相應(yīng)抗體或抗原捕獲,形成一檢測(cè)帶。然后在肉眼對(duì)檢測(cè)帶進(jìn)行初步定性或半定量檢測(cè)的基礎(chǔ)上,以磁性測(cè)定儀對(duì)該檢測(cè)帶進(jìn)行定量檢測(cè)。本發(fā)明將免疫膠體金技術(shù)和免疫磁性粒子技術(shù)同時(shí)運(yùn)用到快速檢測(cè)試劑盒中,既能進(jìn)行定性檢測(cè)同時(shí)又能做定量測(cè)定,省時(shí)省力,節(jié)約了成本。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1335503SQ01113129
公開(kāi)日2002年2月13日 申請(qǐng)日期2001年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月27日
發(fā)明者張濤, 李賓, 龔丹, 周軍, 彭永濟(jì), 任一萍 申請(qǐng)人:上海晶泰生物技術(shù)有限公司