鹿布魯氏菌病膠體金抗體檢測試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及人畜共患傳染病病原體的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種鹿布魯氏菌病 膠體金抗體檢測試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 布魯氏菌表面蛋白 31 炬rucella cellsurface protein 31ku，BCSP31)基因于 1988年被克隆測序和體外表達(dá)，它編碼了大小為31ku具有免疫原性的可溶性細(xì)胞表面蛋 白質(zhì)，除了綿羊附睪布魯氏菌外，在其他6種布魯氏菌中均可檢測到BCSP31蛋白的表達(dá)。布 魯氏菌BCSP31基因在8株不同屬來源的布魯氏菌菌株中同源性達(dá)99. 3%，是布魯氏菌種屬 特異性基因，具有高度保守性。
[0003] 目前，已有學(xué)者利用真核表達(dá)的方法表達(dá)了 BCSP31蛋白，并利用其真核表達(dá)產(chǎn) 物免疫小鼠，研究其在小鼠體內(nèi)的抗布魯氏菌感染的能力；也有學(xué)者利用原核表達(dá)載體 pGEX4p-l表達(dá)了 BCSP31蛋白，并研制了 BCSP31蛋白的單克隆抗體。
[0004] 膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是W膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一 種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。在臨床 使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標(biāo)記。同時(shí)在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)W至生物巧 片中都可能例用到。
[0005] 目前，采用布魯氏菌BCSP31蛋白作為抗原用于鹿布魯氏菌病膠體金抗體檢測試 紙條的研制還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種鹿布魯氏菌病膠體金抗體檢測試紙條及其制備方法，用 于快速篩查鹿血清或鹿全血中布魯氏菌抗體。
[0007] 本發(fā)明為解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下；
[000引本發(fā)明提供的一種鹿布魯氏菌病膠體金抗體檢測試紙條，包括塑料卡、裝在塑料 卡中的PVC底板、依次粘帖在PVC底板上的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、帶有檢測線和質(zhì)控線的NC 膜、吸水紙，所述NC膜的檢測線和質(zhì)控線上分別點(diǎn)樣有抗原和二抗；所述抗原為1. 50mg/mL 的重組布魯氏菌BCSP31蛋白，所述二抗為0. 75mg/mL的兔抗鹿IgG。
[0009] 進(jìn)一步的，所述金標(biāo)結(jié)合墊通過W下方法制備：
[0010] (1)用抑9. 0的棚酸鹽緩沖液將初始濃度2. 45mg/血的抗體蛋白稀釋至終濃度 1. Omg/mL，用0. 1M的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金的抑為9. 0,膠體金粒徑大小為30皿；W每1血 膠體金加40 y g抗體蛋白的比例，逐滴加入抗體蛋白，攬拌均勻后，常溫下靜止30min ;加入 10 % BSA至終濃度為1 %，繼續(xù)攬拌15min ;加入3 % PEG2000至終濃度為0. 1 %，繼續(xù)攬拌 15min，獲得金標(biāo)抗體溶液；
[OCm] (2)將步驟（1)獲得的金標(biāo)抗體溶液在4°C下，150化pm離屯、20min，去除沉淀，得 上清液；將上清液在4°C下，800化pm離屯、30min，棄上清，取流動(dòng)的暗紅色沉淀，重懸于上清 液初始體積1/10的儲存液中，獲得純化的金標(biāo)抗體溶液，4°c保存；
[0012] (3)將結(jié)合墊浸入0.01M的PBS緩沖液中，lOmin后取出，室溫驚干，4°C保存；將步 驟（2)獲得的純化的金標(biāo)抗體溶液滴加到上述結(jié)合墊上，直至結(jié)合墊飽和，37°C下干燥比， 獲得金標(biāo)結(jié)合墊。
[0013] 進(jìn)一步的，步驟（1)中，所述抗體蛋白為兔抗鹿IgG。
[0014] 進(jìn)一步的所述抗原和二抗的點(diǎn)樣用量均為2yL/lcm。
[0015] 本發(fā)明還提供了上述鹿布魯氏菌病膠體金抗體檢測試紙條的制備方法，該方法包 括W下步驟：
[0016] (1)用抑9. 0的棚酸鹽緩沖液將初始濃度2. 45mg/血的抗體蛋白稀釋至終濃度 1. Omg/mL，用0. 1M的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金的抑為9. 0,膠體金粒徑大小為30皿；W每1血 膠體金加40 y g抗體蛋白的比例，逐滴加入抗體蛋白，攬拌均勻后，常溫下靜止30min;加入 10 % BSA至終濃度為1 %，繼續(xù)攬拌15min;加入3 % PEG2000至終濃度為0. 1 %，繼續(xù)攬拌 15min，獲得金標(biāo)抗體溶液；
[0017] (2)將步驟（1)獲得的金標(biāo)抗體溶液在4°C下，150化pm離屯、20min，去除沉淀，得 上清液；將上清液在4°C下，800化pm離屯、30min，棄上清，取流動(dòng)的暗紅色沉淀，重懸于上清 液初始體積1/10的儲存液中，獲得純化的金標(biāo)抗體溶液，4°C保存；
[0018] (3)將結(jié)合墊浸入0.01M的PBS緩沖液中，lOmin后取出，室溫驚干，4°C保存；將步 驟（2)獲得的純化的金標(biāo)抗體溶液滴加到上述結(jié)合墊上，直至結(jié)合墊飽和，37°C下干燥比， 獲得金標(biāo)結(jié)合墊；
[0019] (4) W 1. 50mg/mL純化后的重組布魯氏菌BCSP31蛋白為抗原，W 0. 75mg/mL兔抗 鹿IgG為二抗，W 2 y L/lcm分別點(diǎn)樣于NC膜的檢測線和質(zhì)控線上，室溫固定化；將點(diǎn)樣后 的NC膜浸入到0. 01M的PBS緩沖液中，37°C下封閉30min后，再用0. 01M的PBS緩沖液漂 洗NC膜表面，37°C下烘干，獲得帶有重組布魯氏菌BCSP31蛋白和兔抗鹿IgG的NC膜；
[0020] 妨將步驟（4)獲得的帶有重組布魯氏菌BCSP31蛋白和兔抗鹿IgG的NC膜粘貼 于PVC底板上，將步驟（3)獲得的金標(biāo)結(jié)合墊粘帖在NC膜左端，疊加2mm;將樣品墊粘帖在 金標(biāo)結(jié)合墊左端，疊加2mm;將吸水紙粘帖在NC膜右端，疊加2mm;用塑料卡固定后即獲得 膠體金檢測試紙條。
[0021] 進(jìn)一步的，步驟（1)中，所述抗體蛋白為兔抗鹿IgG。
[0022] 進(jìn)一步的，步驟（2)中，所述儲存液為含有1% BSA和0. 05%陽G2000的PBS緩沖 液，濃度為0. 01M，抑為8. 5~9. 0。
[0023] 進(jìn)一步的，步驟（3)中，所述PBS緩沖液中含有5%庶糖和0. 05%吐溫-20。
[0024] 進(jìn)一步的，步驟（4)中，所述PBS緩沖液中含有1 % BSA。
[0025] 進(jìn)一步的，所述金標(biāo)結(jié)合墊為玻纖膜，型號為化0194,長X寬=6mmX 5mm。
[0026] 進(jìn)一步的，所述NC膜的型號為Vividl70,長X寬=25mmX5mm。
[0027] 進(jìn)一步的，所述PVC底板的長X寬=60mmX 5mm。
[002引進(jìn)一步的，所述樣品墊為玻纖膜，型號為化0194,長X寬=20mmX 5mm。
[0029] 進(jìn)一步的，所述吸水紙的型號為冊076,長X寬=15mmX 5mm。
[0030]本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的鹿布魯氏菌病膠體金抗體檢測試紙條由樣品墊、 金標(biāo)結(jié)合墊、NC膜、吸水紙、PVC底板和塑料卡組成，將樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、NC膜和吸水 紙依次固定在PVC底板上，然后整體裝在塑料卡中。通過將膠體金標(biāo)記抗體蛋白（兔抗鹿 IgG)后得到的純化的金標(biāo)抗體溶液滴加到結(jié)合墊上形成金標(biāo)結(jié)合墊；W布魯氏菌BCSP31 蛋白為抗原，W兔抗鹿IgG為二抗，將濃度為1. 50mg/mL的布魯氏菌BCSP31蛋白和濃度為 0. 75mg/mL的兔抗鹿IgG分別W2化/lcm點(diǎn)樣于NC膜上，即將布魯氏菌BCSP31蛋白噴涂 在檢測線（T線）上，將兔抗鹿IgG噴涂在質(zhì)控線（C線）上。
[0031] 本發(fā)明的鹿布魯氏菌病膠體金抗體檢測試紙條是基于間接膠體金免疫層析技術(shù) 實(shí)現(xiàn)的，檢測時(shí)，樣品中的布魯氏菌抗體與膠體金包被的抗體蛋白結(jié)合形成抗體復(fù)合物，并 沿著試紙流向NC膜的另一端，當(dāng)該抗體復(fù)合物流到NC膜上的T區(qū)時(shí)，固定在膜上的特異性 抗原即布魯氏菌BCSP31蛋白捕獲該復(fù)合物并逐漸凝集成一條可見的檢測線訂線），質(zhì)控線 (C線）出現(xiàn)則表明免疫層析發(fā)生，即試紙有效；檢測線（T線）出現(xiàn)則表明樣品