一種檢測鋅的免疫分析方法及檢測鋅的免疫分析檢測試劑盒的制作方法
【專利說明】一種檢測鋅的免疫分析方法及檢測鋅的免疫分析檢測試劑合
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技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及免疫分析方法，尤其涉及一種檢測鋅的免疫分析方法及檢測鋅的免疫分析檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]重金屬鋅是人體必需的微量元素，含量少但功用非常重要。鋅可通過吸入和食入途徑進(jìn)入人體，攝入量過多可致中毒，如吸入會引起口渴、胸部緊束感、干咳、高熱、頭暈頭痛等；食入鋅過多可引起急性鋅中毒，有嘔吐、腹瀉等胃腸道癥狀；慢性鋅中毒可有貧血等癥狀；動物實驗可致肝、腎功能及免疫力受損。有些兒童玩具的涂料含鋅，小兒喜把玩具放口內(nèi)，常食入鋅過多可致中毒。
[0003]在食品安全檢測和環(huán)境監(jiān)測中，重金屬鋅的檢測大都采用儀器法(如原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜分析法等)和化學(xué)顯色法。儀器法檢測結(jié)果精確，但是普遍存在儀器昂貴、對檢測樣品要求高、需專業(yè)技術(shù)人員操作和在大量樣品檢測時耗費時間長等問題，難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測的需要?；瘜W(xué)顯色法靈敏度不夠高、較易受樣品中其他物質(zhì)的干擾、在大量樣品檢測時，所需的耗材較多且耗時較長等。因此，尋找一種簡便、快速和高通量的檢測方法顯得十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問題，本發(fā)明實施例提供了一種檢測鋅的免疫分析方法，通過待測樣品與鋅完全抗原競爭結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鋅的單克隆抗體并通過顯色反應(yīng)放大信號實現(xiàn)對待測樣品中鋅含量的檢測。本發(fā)明實施例提供的一種檢測鋅的免疫分析方法為一步法競爭酶聯(lián)免疫分析方法，簡便、快速且能夠高通量檢測。本發(fā)明實施例還提供了一種檢測鋅的免疫分析檢測試劑盒。
[0005]本發(fā)明實施例第一方面提供了一種檢測鋅的免疫分析方法，包括以下步驟:
[0006](I)取鋅完全抗原，用碳酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋后的鋅完全抗原按濃度梯度分別包被至固相載體表面，4°C包被過夜，隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體并甩干;
[0007](2)隨后加入封閉緩沖液封閉所述固相載體表面的空余間隙，37°C封閉lh，隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體并甩干；
[0008](3)取待測樣品，反應(yīng)連接至步驟(2)獲得的固相載體表面，以及取按濃度梯度稀釋的鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液加入至步驟(2)獲得的固相載體表面作為對照組；
[0009](4)取辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鋅的單克隆抗體，用稀釋緩沖液稀釋，與步驟(3)中獲得的固相載體上包被的所述鋅完全抗原和所述待測樣品37°C反應(yīng)30min，隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體并甩干；
[0010](5)通過加入辣根過氧化物酶顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)并測定光密度值或通過加入辣根過氧化物酶發(fā)光劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)測定光信號，計算待測樣品中鋅的含量；
[0011]上述步驟中，所述碳酸鹽緩沖液的濃度為0.05M且pH值為9.6，所述洗滌緩沖液含有濃度為0.015M且pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液和質(zhì)量濃度為0.05%的吐溫20，所述封閉緩沖液中含有質(zhì)量濃度為3%的小牛血清白蛋白或質(zhì)量濃度為5%的脫脂奶粉且所述封閉緩沖液的PH值為7.4，所述稀釋緩沖液為pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0012]步驟(I)中，優(yōu)選地，所述鋅完全抗原的濃度梯度為10ng/mL、20ng/mL, 50ng/mL,100ng/mL,200ng/mL,500ng/mL 和 1000ng/mL。
[0013]優(yōu)選地，所述固相載體為聚苯乙烯酶標(biāo)板、聚苯乙烯珠、尼龍膜、聚偏氟乙烯膜、硝酸纖維素膜或磁性微珠。
[0014]優(yōu)選地，所述鋅完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑將鋅離子與載體蛋白連接形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鋅離子通過化學(xué)鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯(lián)。
[0015]優(yōu)選地，所述具有硫氰基的雙功能螯合劑為1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N, N, N, N-四乙酸(iEDTA)或 p-SCN_Bn_DTPA。所述 p-SCN_Bn_DTPA 為二乙基三胺五乙酸的衍生物，末端具有活性基團(tuán)硫氰基。
[0016]優(yōu)選地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(0VA)。
[0017]優(yōu)選地，所述鋅完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0018]制備雙功能螯合劑1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸(iEDTA)溶液；
[0019]將含有鋅離子的溶液逐滴加入到所述1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N, N, N-四乙酸(iEDTA)溶液中，室溫下反應(yīng)，制得鋅離子_雙功能螯合劑復(fù)合物；
[0020]將所述鋅離子-雙功能螯合劑復(fù)合物逐滴加入到含有載體蛋白的緩沖體系中制得反應(yīng)混合液，室溫下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后離心超濾或透析除去未反應(yīng)的鋅離子和雙功能螯合劑，制得鋅完全抗原，所述鋅完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑將鋅離子與載體蛋白連接形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鋅離子通過化學(xué)鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯(lián)。
[0021]更優(yōu)選地，所述鋅離子與所述1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸(iEDTA)的摩爾比為1:1。
[0022]更優(yōu)選地，所述1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸溶液為將1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N, N, N-四乙酸溶解在二甲基亞砜中制得。
[0023]更優(yōu)選地，所述室溫下反應(yīng)為25°C、125rpm下反應(yīng)3h。
[0024]更優(yōu)選地，所述含有載體蛋白的緩沖體系為載體蛋白溶解于pH值為7.4的Tris-HCl緩沖液中制得，所述Tris-HCl緩沖液的摩爾濃度為0.lmol/L，制得反應(yīng)混合液后調(diào)節(jié)所述反應(yīng)混合液的pH值為9.0?9.5。
[0025]更優(yōu)選地，通過加入三乙胺溶液調(diào)節(jié)所述反應(yīng)混合液的pH值。
[0026]更優(yōu)選地，所述室溫下反應(yīng)為25°C、125rpm下反應(yīng)24h。
[0027]更優(yōu)選地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(0VA)。
[0028]更優(yōu)選地，所述牛血清白蛋白與所述鋅離子的摩爾比為1:44?50。
[0029]更優(yōu)選地，所述卵清蛋白與所述鋅離子的摩爾比為1:17?20。
[0030]還優(yōu)選地，所述鋅完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0031]將雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA和載體蛋白在緩沖體系中反應(yīng)，反應(yīng)后超濾除去未反應(yīng)的Ρ-SCN-Bn-DTPA，洗取截留物制得雙功能螯合劑-載體蛋白復(fù)合物；
[0032]在所述雙功能螯合劑-載體蛋白復(fù)合物中逐滴加入含有鋅離子的溶液反應(yīng)，超濾去除未螯合的鋅離子，制得鋅完全抗原，所述鋅完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑將鋅離子與載體蛋白連接形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鋅離子通過化學(xué)鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯(lián)。
[0033]更優(yōu)選地，所述緩沖體系為pH值為9.4的HEPES緩沖液。
[0034]更優(yōu)選地,所述在緩沖體系中反應(yīng)為反應(yīng)24h。
[0035]更優(yōu)選地，所述超濾條件為4°C且6000r/min。
[0036]更優(yōu)選地，所述洗取截留物為用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液洗取截留物。
[0037]更優(yōu)選地，逐滴加入含有鋅離子的溶液反應(yīng)lh。
[0038]更優(yōu)選地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
[0039]更優(yōu)選地，所述牛血清白蛋白與所述鋅離子的摩爾比為1:44?50。
[0040]更優(yōu)選地，所述卵清蛋白與所述鋅離子的摩爾比為1:17?20。
[0041]更優(yōu)選地，所述雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA和牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:2。
[0042]更優(yōu)選地，所述雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA和卵清蛋白的質(zhì)量比為1:3?4。
[0043]步驟(3)中，優(yōu)選地,所述鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度均為50ng/mL, 100ng/mL, 200ng/mL,400ng/mL,800ng/mL和 1600ng/mL。
[0044]步驟(4)中，優(yōu)選地，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鋅的單克隆抗體的濃度為50ng/mLo
[0045]優(yōu)選地