l elution buffer洗脫蛋白， SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的純化結(jié)果，細(xì)胞上清經(jīng)鑲柱純化的結(jié)果如圖5所示，在53kDa處得到單 一目的條帶，將純化后的重組布魯氏菌BCSP31蛋白采用0. 45 y m濾膜過(guò)濾，-80°C凍干保存 備用。
[0064] 實(shí)施例2重組布魯氏菌BCSP31蛋白免疫原性的檢測(cè)及分析
[0065] (1)BCSP31蛋白與牛布魯氏菌病陽(yáng)性血清免疫印跡分析
[0066] 將臨床上檢測(cè)的牛布魯氏菌病陽(yáng)性血清（可W通過(guò)虎紅平板和試管凝集反應(yīng)確 定為陽(yáng)性）作為一抗，按照1:400的濃度解育PVDF膜，用山羊抗牛IgG作為二抗，W 1:5000 的濃度解育PVDF膜，經(jīng)TMB顯色，檢測(cè)BCSP31蛋白與牛布魯氏菌病陽(yáng)性血清的特異性反 應(yīng)。結(jié)果如圖6所示；布魯氏菌BCSP31蛋白能夠與牛布魯氏菌病陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反 應(yīng)，說(shuō)明該重組的BCSP31蛋白在布魯氏菌陽(yáng)性動(dòng)物血清中能夠產(chǎn)生特異性抗體。
[0067] (2) BCSP31蛋白免疫小鼠
[0068] 將20只雄性BALB/c(白變種實(shí)驗(yàn)室老鼠）平均分成4組，每組5只，即第一組每 只小鼠免疫5*107SUM0-BCSP31表達(dá)菌化21，第二組每只鼠免疫5*107轉(zhuǎn)化SUMO空載體 BL21，第S組每只小鼠免疫5*105羊種布魯氏菌疫苗株M5,第四組每只小鼠免疫200ul PBS 作為對(duì)照。均采取腹腔注射，共免疫3次，每次間隔21天。最后一次免疫后21天拉頸處死 小鼠，摘眼球采血，吸取血清，分別進(jìn)行western-blotting,血清效價(jià)和細(xì)胞因子的檢測(cè)。
[0069] ①小鼠血清ELISA檢測(cè)特異性抗體的檢測(cè)
[0070] 分別用純化的BCSP31蛋白包被96孔板，采用間接化ISA方法檢測(cè)待測(cè)免疫小 鼠血清，加羊抗小鼠IgG-HRP (1:5000)反應(yīng)，加底物0PD顯色，置酶標(biāo)儀測(cè)490nm吸光度 (A)值，測(cè)定抗體的滴度；將免疫后小鼠每隔7天尾尖采血，直到免疫后第8周，收集血 清，間接化ISA方法檢測(cè)免疫后小鼠血清抗體效價(jià)，結(jié)果如圖7所示，表達(dá)有免疫重組菌 SUM0-BCSP31的大腸桿菌化21從免疫后第7天開(kāi)始，血清效價(jià)逐漸上升，直到免疫后第8周 還沒(méi)有下降，最高血清效價(jià)為1 ; 5600。
[0071]②小鼠血清Western-blotting分析
[007引為了檢測(cè)SUM0-BCSP31表達(dá)菌化21免疫小鼠后血清中能否產(chǎn)生BCSP31蛋白的特 異性抗體，將免疫SUM0-BCSP31表達(dá)菌化21的小鼠血清作為一抗，與布魯氏菌BCSP31蛋白 可溶性表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物分別進(jìn)行Western-blotting分析，結(jié)果如圖8所示，免疫小鼠 血清能夠與BCSP31蛋白在53bp處出現(xiàn)明顯的免疫反應(yīng)，說(shuō)明該SUM0-BCSP31表達(dá)菌化21 免疫小鼠后獲得了 BCSP31蛋白的特異性抗體。
[0073] ⑨小鼠血清IgG亞型的檢測(cè)
[0074] 利用現(xiàn)有的化ISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血清IgGl和IgG2a的表達(dá)量，結(jié)果如圖9 所示，免疫重組菌SUM0-BCSP31的小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG亞型是W IgGl為主，說(shuō)明該重組菌 SUM0-BCSP31誘導(dǎo)了 T肥型免疫反應(yīng)，W血清抗體免疫為主，羊種布魯氏菌疫苗株M5則同時(shí) 誘導(dǎo)產(chǎn)生IgGl和IgG2a，說(shuō)明布魯氏菌弱毒疫苗株能夠同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)和 體液免疫反應(yīng)，而PBS對(duì)照組則無(wú)明顯的IgGl和IgG2a產(chǎn)生。
[0075] ④小鼠血清IFN-丫和比-2的檢測(cè)
[0076] 利用現(xiàn)有的小鼠IFN- 丫和比-沈LISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血清中特異性IFN- 丫 和比-2的表達(dá)量，結(jié)果如圖10和圖11所示，免疫SUM0-BCSP31重組菌小鼠血清無(wú)明顯的 IFN-丫和 IL-2 產(chǎn)生。
[0077] 實(shí)施例3金標(biāo)抗體溶液的制備
[007引 （1)膠體金標(biāo)記抗體蛋白
[0079] 采用抑為9. 0的棚酸鹽緩沖液將初始濃度為2. 45mg/血的抗體蛋白稀釋至終濃 度為1. Omg/mL;采用濃度為0. 1M的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金的抑為9. 0,商品化的膠體金粒徑 大小為30nm;W每ImL膠體金加40 y g抗體蛋白的比例，逐滴加入抗體蛋白，攬拌均勻后， 常溫下靜止30min ;加入10 % BSA至終濃度為1 %，繼續(xù)攬拌15min ;加入3 %陽(yáng)G2000至終 濃度為0. 1 %，繼續(xù)攬拌15min，得到金標(biāo)抗體溶液。
[0080] 上述的抗體蛋白為兔抗鹿IgG，對(duì)應(yīng)獲得的金標(biāo)抗體即為膠體金標(biāo)記兔抗鹿IgG。
[0081] (2)金標(biāo)抗體溶液的純化
[0082] 將上述獲得的金標(biāo)抗體溶液在4°C下，W 1500rpm的轉(zhuǎn)速離屯、20min，去除膠體金 顆粒聚集產(chǎn)生的沉淀，得到上清液；將上清液在4°C下，W SOOOrpm的轉(zhuǎn)速離屯、30min，棄上 清，取管底可流動(dòng)的暗紅色沉淀，重懸于初始體積1/10的儲(chǔ)存液中（也就是說(shuō)初始體積指 的是上清液的體積，上清液與儲(chǔ)存液的體積比為10:1)，得到純化的金標(biāo)抗體溶液，4°C下保 存?zhèn)溆谩?br>[0083] 上述的儲(chǔ)存液為含有1% BSA和0. 05%陽(yáng)G2000的PBS緩沖液，濃度為0. 01M，pH 為 8. 5 ~9.0。
[0084] 實(shí)施例4金標(biāo)結(jié)合墊的制備
[0085] 將結(jié)合墊浸入濃度為0. 01M的PBS緩沖液（含有5 %庶糖和0. 05 %吐溫-20)中， lOmin后取出，室溫驚干后4°C下儲(chǔ)存?zhèn)溆茫粚⑸鲜黾兓蟮慕饦?biāo)抗體溶液滴加到經(jīng)上述處 理的結(jié)合墊上，直至結(jié)合墊飽和，37°C下干燥比，得到金標(biāo)結(jié)合墊（玻纖膜，型號(hào)化0194， 長(zhǎng)X寬=6mmX5mm)。
[0086] 實(shí)施例5 NC膜的預(yù)處理
[0087] W實(shí)施例1獲得的純化后的重組布魯氏菌BCSP31蛋白為抗原，W兔抗鹿IgG為二 抗，將濃度為1. 50mg/mL的布魯氏菌BCSP31蛋白和濃度為0. 75mg/mL的兔抗鹿IgG分別W 2 ji L/lcm點(diǎn)樣于NC膜（型號(hào)為Vividl70,長(zhǎng)X寬=25mmX5mm)上，具體的是將布魯氏菌 BCSP31蛋白噴涂在檢測(cè)線（T線）上，將兔抗鹿IgG噴涂在質(zhì)控線（C線）上，室溫固定化； 將點(diǎn)樣后的NC膜浸入到濃度為0.01M的PBS緩沖液（含有1%BSA)中，37°C下封閉30min ; 取出后，再用濃度為0. 01M的PBS緩沖液（含有1 % BSA)漂洗NC膜表面，37°C下烘干，得到 帶有W重組布魯氏菌BCSP31蛋白為抗原、W兔抗鹿IgG為二抗的NC膜。
[008引實(shí)施例6膠體金檢測(cè)試紙條的組裝
[0089] 將實(shí)施例5獲得的帶有W重組布魯氏菌BCSP31蛋白為抗原、W兔抗鹿IgG為二抗 的NC膜粘貼于PVC底板（長(zhǎng)X寬=60mmX 5mm)上，NC膜左端邊緣距離PVC底板左端邊緣 22mm，NC膜右端邊緣距離PVC底板右端邊緣13mm ;將實(shí)施例4獲得的金標(biāo)結(jié)合墊粘帖在NC 膜左端上表面，疊加長(zhǎng)度為2mm;將樣品墊（玻纖膜，型號(hào)為化0194,長(zhǎng)X寬=20mmX 5mm) 粘帖在金標(biāo)結(jié)合墊左端上表面，疊加長(zhǎng)度為2mm;將吸水紙（型號(hào)為冊(cè)076,長(zhǎng)X寬= 15mmX 5mm)粘帖在NC膜右端上表面，疊加長(zhǎng)度為2mm ;裝上塑料卡固定后即完成膠體金檢 測(cè)試紙條的組裝，得到的膠體金檢測(cè)試紙條的尺寸為：長(zhǎng)X寬=60mmX5mm。
[0090] 實(shí)施例7鹿布魯氏菌病膠體金抗體檢測(cè)試紙條的使用方法
[0091] (1)采集待測(cè)樣品，待測(cè)樣品采集完后需要立即檢測(cè)，如不能立即檢測(cè)，需要放置 在4°C下冷藏或低溫冷凍保存，待測(cè)樣品為鹿全血（抗凝）1ml或鹿血清500ul。
[0092] (2)將完好的鹿布魯氏菌病膠體金抗體檢測(cè)試紙條取出后恢復(fù)至室溫，放置在水 平位置。
[0093] (3)采用吸管吸取待測(cè)樣品1滴緩慢滴入預(yù)先準(zhǔn)備