片離子；在第三個質(zhì)量分析器飛行時間質(zhì)量分析器選取穩(wěn)定的特征碎片離子，來 定量PEG。
[0043] 色譜條件：Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，包括二元輸液泵，脫氣機，自動進樣 器，美國Agilent公司；島津UFLC SIL-20A XR柱溫箱，日本島津公司；色譜柱：XBridge? BH1300 C18柱，2. 1X50 mm I.D.，3. 5 ym粒徑，300A孔徑（Waters);流動相：甲酸體積百分 數(shù)占0. 1%的水和甲酸體積百分數(shù)占0. 1%的乙腈，梯度洗脫，具體程序見表2 ;柱溫40° C ; 流速 400 ml,/min ；
其中A是甲酸體積百分數(shù)占0. 1%的水，B是甲酸體積百分數(shù)占0. 1%的乙腈。
[0044] 質(zhì)譜條件：Triple T0F 5600型質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源以及Analyst TF 1.6. 1數(shù)據(jù)處理軟件(美國AB SCIEX公司）;正離子方式檢測；離子噴射電壓：5500 V;溫度： 500° C;氣簾氣體（CUR)氮氣壓力15 psi;氣體1氮氣壓力（GS1)60 psi、氣體2氮氣壓 力（GS2)50 psi ;PEG掃描方式為TOF-MS模式，掃描的m/z范圍為88. 0~178. 0,解簇電壓 (DP)100 V，碰撞電壓（CE)30 eV;辛伐他汀掃描方式為Product ion模式，母離子的m/z為 419. 2,子尚子掃描范圍為198. 5~199. 5 ; 數(shù)據(jù)處理： 利用Analyst TF 1.6.1軟件記錄色譜圖，并使用Multiquant 2. 0.2軟件提取m/z范 圍為133. 083~133. 086 (理論上精確m/z為133. 08592, 3個乙二醇重復單元）離子的色譜 圖進行定量，同時提取質(zhì)量范圍為89. 058~89. 062 (理論上精確m/z為89. 05971，2個乙二 醇重復單元）以及177. 110~177. 114 (理論上精確m/z為177. 11214,4個乙二醇重復單元） 兩個范圍的離子色譜圖作為監(jiān)測離子。以A步驟中獲取的PEG濃度為橫坐標，PEG色譜峰面 積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標，用加權(quán)W=l/x 2最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸 方程，即為標準工作曲線。將B步驟中獲取的待測樣本PEG峰面積與內(nèi)標峰面積比值代入 標準工作曲線，求得PEG濃度。空白血漿樣本色譜圖如圖1所示，內(nèi)標色譜圖如圖2所示， 含PEG 4000的樣本色譜圖如圖4所示，大鼠尾靜脈注射PEG 4000后的血藥濃度見表3 ;
質(zhì)量控制樣本制備 ① 利用去離子水將PEG 4000標準品溶解至1. 0 mg/mL，得到PEG 4000儲備液； ② 利用大鼠血漿將PEG儲備液分別稀釋至100,1000,8000 ng/mL ; ③ 每濃度取至少三個樣本，按照標準曲線制備方法處理樣本，并根據(jù)標準曲線，得出 PEG濃度，計算質(zhì)量控制樣本準確度，具體見表5,考察方法的準確性。
[0045] 本發(fā)明所述的不同聚合度PEG定量方法操作簡便易行、分析時間短、線性關(guān)系良 好、準確度高、重現(xiàn)性好而且靈敏、可靠，不僅可以對復雜生物樣本中不同聚合度的PEG進 行定量，也可應用于PEG鍵合藥物中PEG的含量測定，應用范圍廣。
[0046] 實施例3 血漿樣本中PEG 10000含量的測定，除下述參數(shù)與實施例2不同外，其他操作和參數(shù)與 實施例2相同。
[0047] 測定之前的準備工作中給大鼠注射的為PEG 10000生理鹽水溶液，制作標準溶液 時選取的標準品為PEG 10000。測定參數(shù)中：質(zhì)譜條件中解簇電壓為100 V，碰撞電壓為30 eV ;色譜洗脫程序見表6。標準曲線和準確度見表7、8。
[0048] 實施例3 血漿樣本中PEG 600含量的測定，除下述參數(shù)與實施例2不同外，其他操作和參數(shù)與實 施例2相同。
[0049] 測定之前的準備工作中給大鼠注射的為PEG 600生理鹽水溶液，制作標準溶液時 選取的標準品為PEG 600。測定參數(shù)中：質(zhì)譜條件中解簇電壓為80 V，碰撞電壓為25 eV; 色譜洗脫程序見表9。標準曲線和準確度見表10、11。
【主權(quán)項】
1. 一種生物樣本中PEG含量的測定方法，其特征在于：采用液相色譜-飛行時間質(zhì)譜 進行測定，測定步驟包括： A. 建立PEG測定的標準曲線； B. 使用液相色譜_飛行時間質(zhì)譜測定待測樣品，通過步驟A所得標準曲線計算出待測 樣本中PEG濃度； 步驟A和步驟B的色譜條件和質(zhì)譜條件相同，其中質(zhì)譜條件基于三重串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，步 驟A和步驟B質(zhì)譜部分的設(shè)定為：第一個質(zhì)量分析器Ql中不選擇母離子，帶電粒子全部通 過后進入第二個質(zhì)量分析器Q2;在第二個質(zhì)量分析器Q2中設(shè)置碰撞能量，將帶電粒子打碎 成碎片離子；在第三個質(zhì)量分析器飛行時間質(zhì)量分析器選取穩(wěn)定的特征碎片離子，來定量 PEG。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于：所述特征碎片離子m/z為 133. 083~133. 086。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于：測定PEG400~1000,所述質(zhì)譜操作 部分解簇電壓為80V，第二個質(zhì)量分析器Q2中PEG的碰撞電壓為25eV。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于：測定PEG1000~2000,所述質(zhì)譜操 作部分解簇電壓為1〇〇V，第二個質(zhì)量分析器Q2中PEG的碰撞電壓為25eV。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于：測定PEG2000~20000,所述質(zhì)譜操 作部分解簇電壓為1〇〇V，第二個質(zhì)量分析器Q2中PEG的碰撞電壓為30eV。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于：測定方法中使用的內(nèi)標物質(zhì)為辛伐 他汀。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任意一項所述的測定方法，其特征在于：步驟A和步驟B中所 述質(zhì)譜條件為：正離子方式檢測；離子噴射電壓：5500V;溫度：500°C;氣簾氣體（⑶R)氮 氣壓力15psi;氣體1氮氣壓力（GSl) 60psi、氣體2氮氣壓力（GS2) 50psi;PEG掃描方 式為TOF-MS模式，掃描的m/z范圍為88. 0~178. 0。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任意一項所述的測定方法，其特征在于：步驟A和步驟B中所 述色譜條件為：流動相為甲酸體積百分數(shù)占0. 1%的水和甲酸體積百分數(shù)占0. 1%的乙腈，梯 度洗脫，柱溫40°C;流速：400mL/min。9. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任意一項所述的測定方法，其特征在于：所述步驟A具體操作 程序為： 1) 制備內(nèi)標溶液和不同濃度的PEG標準溶液； 2) 于抗吸附管中加入內(nèi)標溶液、PEG標準溶液及預冷的乙腈后渦流混勻，離心后上清液 進樣到高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜中分析； 3) 取不同濃度的PEG標準溶液重復程序2)操作，記錄色譜圖，PEG濃度為橫坐標，PEG 色譜峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標，用加權(quán)W=l/x2最小二乘法進行回歸運算，求得的 直線回歸方程，即為標準曲線。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的測定方法，其特征在于：所述步驟B具體操作程序為： 1)于抗吸附管中加入內(nèi)標溶液、待測樣本溶液及預冷的乙腈渦流混勻，離心后取上清 液進樣到高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜中分析； 2 )將程序1)中獲取的待測樣本PEG峰面積與內(nèi)標峰面積比值代入標準工作曲線，求得
【專利摘要】本發(fā)明為一種生物樣本中PEG含量的測定方法，采用液相色譜-飛行時間質(zhì)譜進行測定，首先制備標準曲線，然后將待測樣本測定結(jié)果通過標準曲線計算出待測樣本中PEG濃度；本發(fā)明中質(zhì)譜條件基于三重串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，質(zhì)譜部分的設(shè)定為：第一個質(zhì)量分析器Q1中不選擇母離子，帶電粒子全部通過后進入第二個質(zhì)量分析器Q2；在第二個質(zhì)量分析器Q2中設(shè)置碰撞能量，將帶電粒子打碎成碎片離子；在第三個質(zhì)量分析器飛行時間質(zhì)量分析器選取穩(wěn)定的特征碎片離子，來定量PEG。本發(fā)明針對生物樣本中PEG分子量的不唯一性，建立一種操作簡便易行，結(jié)果準確可靠，靈敏度高，重現(xiàn)性好的PEG定量測定方法。
【IPC分類】G01N30/88
【公開號】CN104931637
【申請?zhí)枴緾N201510356323
【發(fā)明人】顧景凱, 周曉彤, 程龍妹, 尹磊, 楊艷
【申請人】吉林大學
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月25日