專利名稱：一種咖啡酊中生物堿的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物堿的檢測方法，具體是一種咖啡酊中生物堿的測定方法，可同時 檢測咖啡酊中咖啡因、胡蘆巴堿和尼古丁酸3種生物堿。
背景技術(shù)：
咖啡酊是用一定濃度的乙醇自經(jīng)烘烤處理后的咖啡種子浸提而制得。產(chǎn)品會有多 種生物堿和其它雜環(huán)化合物，還含有糠醇、硫衍生物和少量揮發(fā)酸。具有典型的芳香和苦的 香味等感官特性，添加到卷煙中能增濃香氣，增加烘烤香，味變苦。咖啡豆中的主要植物堿為咖啡因，在生咖啡豆中的含量隨品種的不同而變化，其 具有明顯的苦味，對人體具有顯著的生理作用。胡蘆巴堿和煙堿酸是咖啡豆中另外兩種生 物堿。胡蘆巴堿具有低程度的生理作用，在焙炒過程中會分解生成多種化合物，包括煙堿 酸。煙堿酸在生咖啡豆中的含量很少，在焙燒過程中來自胡蘆巴堿的分解，其本身也會繼續(xù) 分解。目前，咖啡酊中這3種生物堿的同時測定尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是基于上述狀況而提供的一種咖啡酊中三種生物堿的測定方法， 填補了咖啡酊中同時分析檢測咖啡因、胡蘆巴堿和尼古丁酸3種生物堿的空白。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的咖啡酊中生物堿的測定方法如下 以水為樣品稀釋溶劑，甲醇與0. 1%甲酸水溶液的混合液為流動相采用高效液相色譜法同 時對咖啡酊中的咖啡因、胡蘆巴堿和尼古丁酸進(jìn)行檢測，其中檢測器是二極管陣列檢測器。具體測定步驟如下
(1)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制定在4.25X10_4-0. 17mg/mL范圍內(nèi)用甲醇配制胡蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)品 的至少五個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在3. 33 X 10_4-0. 26mg/mL范圍內(nèi)用甲醇配制尼古丁酸標(biāo)準(zhǔn)品 的至少五個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2. 75X 10_4-0. 22mg/mL范圍內(nèi)用甲醇配制咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的 至少五個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再利用高效液相色譜儀分別對上述所有濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中的三 種標(biāo)準(zhǔn)品的含量進(jìn)行檢測，并根據(jù)三種標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和相應(yīng)的濃度分別繪制三種標(biāo)準(zhǔn)品 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線并計算得到其回歸方程；
(2)樣品制備稱取0.IOOg咖啡酊劑于IOmL容量瓶中用水稀釋定容，超聲5min，經(jīng) 0. 45 μ m水相濾膜過濾后使用，再利用高效液相色譜儀采用與步驟(1)相同的條件分別對 樣品溶液進(jìn)行檢測，并根據(jù)得到的峰面積分別帶入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程中，計算出樣 品中的咖啡因、胡蘆巴堿和尼古丁酸含量。高效液相色譜分析條件如下
色譜柱waters C18 分析柱(邪0 mm X 4. 6 mm, 5 μ m)； 流動相流動相A為0. 1%甲酸水，流動相B為甲醇；
梯度洗脫條件2%B開始，5min后10%B，12min后50%B，15min后100%B，保持5min, 2Imin以2%B平衡柱子4min。分析時間共25min ； 流速lmL/min ；柱溫30°C ；檢測波長265nm。在上述條件中，以水為樣品稀釋溶劑以及以0. 1%甲酸水為流動相是本方法的關(guān) 鍵。以水為樣品稀釋溶劑，不僅能夠減小樣品中色素進(jìn)入色譜柱中的量，有效保護(hù)色譜柱， 而且樣品前處理溶劑環(huán)保無毒，并且對生物堿的色譜峰形沒有影響。與純水為流動相相比， 0. 1%甲酸水為流動相能有效改善尼古丁酸的色譜峰形，有利于尼古丁酸的準(zhǔn)確定量。本方法前處理簡單，咖啡酊劑直接用水稀釋定容，超聲5min，經(jīng)0. 45 μ m水相濾膜 過濾后使用，無需進(jìn)一步進(jìn)行樣品凈化步驟。利用本發(fā)明方法對咖啡酊中三種生物堿進(jìn)行 測定，重復(fù)性和回收率好，適用于大批量樣品的分析。


圖1為咖啡因、胡蘆巴堿和尼古丁酸標(biāo)樣色譜圖。圖2為咖啡酊樣品色譜圖。圖中1為胡蘆巴堿，2為尼古丁酸，3為咖啡因。
具體實施例方式
下面通過實施實例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明
色譜條件=Agilent 1200液相色譜，配置二極管陣列檢測器，檢測波長^5nm。色譜柱 waters C18 分析柱(250 mm X 4. 6 mm, 5 μ m)0 流動相0. 1% 甲酸水(A)，甲醇(B)；梯 度洗脫，2%B 開始，5min 后 10%B, 12min 后 50%B, 15min 后 100%B,保持 5min, 21min 以 2%B 平 衡柱子細(xì)in。流速lmL/min。分析時間共25min。柱溫30°C。1)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制定
胡蘆巴堿、尼古丁酸和咖啡因用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，母液的濃度分別為1.7mg/mL、 13. 3mg/mL和11. Omg/mL。胡蘆巴堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍4. 25X IO^4-O. 17mg/mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線方 程為y=20234x+0. 0806，R2 =1 ；尼古丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍3. 33 X IO^4-O. 26mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線 方程為y4962h-13.沈9，R2 =1 ；咖啡因的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍2. 75 X 10_4_0. 22mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線 方程為y=3250h+5. 484，R2 =1 ;y為色譜峰面積，χ為生物堿濃(mg/mL)。每個校正曲線含 有7個校正點。2)樣品檢測
稱取0. IOOg咖啡酊劑于IOmL容量瓶中用水稀釋定容，超聲5min。經(jīng)0. 45 μ m水相 濾膜過濾后使用。標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖如圖1所示，樣品譜圖如圖2所示
按照實驗部分所述方法平行5次測定咖啡酊樣品中咖啡因、尼古丁酸和胡蘆巴堿含 量，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD )均見表1。
權(quán)利要求
1.一種咖啡酊中生物堿的測定方法，其特征在于以水為樣品稀釋溶劑，甲醇與0. 1% 甲酸水溶液的混合液為流動相采用高效液相色譜法同時對咖啡酊中的咖啡因、胡蘆巴堿和 尼古丁酸進(jìn)行檢測，其中檢測器是二極管陣列檢測器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的咖啡酊中生物堿的測定方法，其特征在于具體測定步驟如下(1)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制定在4.25X10_4-0. 17mg/mL范圍內(nèi)用甲醇配制胡蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)品 的至少五個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在3. 33 X 10_4-0. 26mg/mL范圍內(nèi)用甲醇配制尼古丁酸標(biāo)準(zhǔn)品 的至少五個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2. 75X 10_4-0. 22mg/mL范圍內(nèi)用甲醇配制咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的 至少五個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再利用高效液相色譜儀分別對上述所有濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中的三 種標(biāo)準(zhǔn)品的含量進(jìn)行檢測，并根據(jù)三種標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和相應(yīng)的濃度分別繪制三種標(biāo)準(zhǔn)品 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線并計算得到其回歸方程；(2)樣品制備稱取0.IOOg咖啡酊劑于IOmL容量瓶中用水稀釋定容，超聲5min，經(jīng) 0. 45 μ m水相濾膜過濾后使用，再利用高效液相色譜儀采用與步驟(1)相同的條件分別對 樣品溶液進(jìn)行檢測，并根據(jù)得到的峰面積分別帶入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程中，計算出樣 品中的咖啡因、胡蘆巴堿和尼古丁酸含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的咖啡酊中生物堿的測定方法，其特征在于高效液相色譜分 析條件如下色譜柱waters C18 分析柱(邪0 mm X 4. 6 mm, 5 μ m)；流動相流動相A為0. 1%甲酸水，流動相B為甲醇；梯度洗脫條件2%B開始，5min后10%B，12min后50%B，15min后100%B，保持 5min, 2 Imin 以 2%B 平衡柱子 4min ；分析時間共25min ；流速lmL/min ；柱溫30°C ；檢測波長265nm。
全文摘要
一種咖啡酊中生物堿的測定方法，其特征在于以水為樣品稀釋溶劑，甲醇與0.1%甲酸水溶液的混合液為流動相采用高效液相色譜法同時對咖啡酊中的咖啡因、胡蘆巴堿和尼古丁酸進(jìn)行檢測，其中檢測器是二極管陣列檢測器。以水為樣品稀釋溶劑以及以0.1%甲酸水為流動相是本方法的關(guān)鍵。以水為樣品稀釋溶劑，不僅能夠減小樣品中色素進(jìn)入色譜柱中的量，有效保護(hù)色譜柱，而且樣品前處理溶劑環(huán)保無毒，并且對生物堿的色譜峰形沒有影響。與純水為流動相相比，0.1%甲酸水為流動相能有效改善尼古丁酸的色譜峰形，有利于尼古丁酸的準(zhǔn)確定量。本方法前處理簡單，重復(fù)性和回收率好，適用于大批量樣品的分析。
文檔編號G01N30/02GK102095816SQ20111000293
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月8日
發(fā)明者丁麗, 夏巧玲, 張曉兵, 王洪波, 謝復(fù)煒, 郭軍偉 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院